原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法

原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法

国家标准 GB/T22388一2008 原料乳与乳制品中三聚胺检测方法 Determinationofmelamimeinrawmilkanddairyproduets 2008-10-07发布 2008-10-07实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22388一2008 前 言 本标准包括三个方法;第一法高效液相色谱法,第二法液相色谱-质谱/质谐法,第三法气相 色谱-质谱联用法 检测时,应根据检测对象及其限量的规定,选用与其相适应的检测方法 本标准的附录A为资料性附录 本标准由全国食品安全应急标准化工作组、全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会提 出并归口 本标准第一法起草单位;检验检疫科学研究院、疾病预防控制中心、国家食品质量安全监 督检验中心、北京市疾病预防控制中心、国家乳制品质量监督检验中心、浙江省质量技术监督检测研究 院,国家加工食品质量监督检验中心(广州 本标准第一法主要起草人:宋书锋、鲁杰、安娼、杨大进、李淑娟、张晶、刘艳琴、杨红梅、杨金宝 鄂来明、廖上富、陈小珍、蔡依军、郭新东,吴玉銮 本标准第二法起草单位;检验检疫科学研究院、北京市疾病预防控制中心、国家食品质量安全 监督检验中心.-疾朝预控制中心.-中华人民其和国江苏出人境检验检疫局 本标准第二法主要起草人彭涛、吴永宁、邵兵、王浩、李晓娟、郭启雷、苗虹、赵云峰、丁涛、李立、 蒋原 本标准第三达起草单位上海市质量监督检验技术研究院、国家食品质量安全监督检验中心、 检验检疫科学研究院 本标准第三法主要起草人:乘强国、常宇文,雷涛、陈冬东,赵玉琪周耀斌、穆同娜,葛宇、曹程明、 张辉、麦成华、曹红
GB/T22388一2008 原料乳与乳制品中三聚氮胺检测方法 范围 本标准规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氮胺的三种测定方法,即高效液相色谱法 HPLC法)、液相色谱-质谱/质谱法(IC-MSs/MS法)和气相色谱-质谱联用法[包括气相色谱-质谱法 (GC-MS法),气相色谱-质谱/质谱法(GC-Ms/MS法] 本标准适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氧胺的定量测定;液相色谱-质谱/质谐法,气相 色谱-质谱联用法(包括气相色谱-质谱/质谱法)同时适用于原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氮胺的 定性确证 本标准高效液相色谱法的定量限为2mg/kg液相色谱-质谱/质谱法的定量限为0.01mg/kg,气 相色谱-质谱法的定量限为0.05mg/kg(其中气相色谱-质谱/质谐法的定量限为0.005mg/kg) 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,ISO3696:1987,MOD) 第一法高效液相色谱法(HPLC法 3.1原理 试样用三氧乙酸溶液-乙腊提取,经阳离子交换固相萃取柱净化后,用高效液相色谱测定,外标法 定量 3.2试剂与材料 除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 3.2.1甲醉;色谱纯 .2.2乙睛;色谱纯 3 3.2.3氨水;含量为25%~28% 3.2.4三氯乙酸 3 3 3.2.5柠檬酸 33 .2.6辛婉碱酸钠;色谱纯 3.2.7甲醇水溶液;准确量取50ml甲醇和50mL.水,混匀后备用 3. 3.2.8三氯乙酸溶液(1%):准确称取10g三氯乙酸于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度,混匀后 备用 3. .2. 9 氨化甲醇溶液(5%);:准确量取5mL氨水和95mL甲醇,混匀后备用 3.2.10离子对试剂缓冲液:准确称取2.10g柠檬酸和2.16g辛炕磺酸钠,加人约980mL水溶解,调 节pH至3.0后,定容至1L备用 3.2.11三聚氧胺标准品:CAs108-78-01,纯度大于99.0% 3.2.12三聚氮胺标准储备液;准确称取1o0mg(精确到0.1mg)三聚氮胺标准品于100mL容量瓶 中,用甲醇水溶液(3.2.7)溶解并定容至刻度,配制成浓度为1mg/mL的标准储备液,于4C避光 保存
GB/T22388一2008 3.2.13阳离子交换固相萃取柱:混合型阳离子交换固相萃取柱,基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯 基苯高聚物,填料质量为60mg,体积为3mL,或相当者 使用前依次用3mL甲醇,5mL水活化 3.2.14定性滤纸 mm0.85mm， 3.2.15海砂;化学纯,粒度0.65 二氧化硅(SsiO)含量为99% 16 3.2. 微孔滤膜:0.2m有机相 3.2. 17氮气:纯度大于等于99.999% 仪器和设备 3.3.1高效液相色谱(HPLC)仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器 2 3.3. 分析天平;感量为0.0001g和0.01g 3.3.3离心机:转速不低于4000r/min. 3.3.4超声波水浴 3.3.5固相萃取装置 3.3.6氨气吹干仪 3.3.7涡旋谋合器 3.3.8具塞塑料离心管.50m. 3.3.9研钵 3.4样品处理 3.41提取 3.4.1.1液态奶、奶粉、酸奶,冰淇淋和奶糖等 称取2g(精确至0.01g)试样于50mL具塞塑料离心管中,加人15ml三氧乙酸溶液(3.2.8)和 5ml乙睛,超声提取10min,再振荡提取10min后,以不低于4000r/min离心10min 上清液经三叙 乙酸溶液润湿的滤纸过滤后,用三氯乙酸溶液定容至25mL,移取5mL滤液,加人5mL水混匀后做待 净化液 3.4.1.2奶酪、奶油和巧克力等 称取2g(精确至0.01B)试样于研钵中,加人适量海砂(试样质量的4倍一倍)研磨成干粉状,转 移至50mL具塞塑料离心管中,用15mL三氯乙酸溶液(3.2.8)分数次清洗研钵,清洗液转人离心管 中,再往离心管中加人5nml乙睛,余下操作同3.4.1.1中“超声提取10min,加人5mL水混匀后 做待净化液” 注;若样品中脂肪含量较高,可以用三叙乙酸溶液饱和的正己烧液-液分配除脂后再用sPE柱净化 3.4.2净化 将3.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱(3.2.l3)中 依次用3mL.水和3ml 甲醇洗涤,抽至近 干后,用6mL氨化甲醉溶液(3.2.9)洗脱 整个固相萃取过程流速不超过1mL/min 洗脱液于50c 1 下用氮气吹干,残留物(相当于0.4g样品)用1ml流动相定容,涡旋混合 min ,过微孔滤膜(3.2.16) 后,供HPLC测定 3.5高效液相色谱测定 3.5.1IHPLC参考条件 色谱柱;C，柱,250mmX4.6mm[内径(i.d.],5m,或相当者 a C柱,250mm×4.6mm[内径(i.d.],5Am,或相当者 b)流动相:C柱,离子对试剂缓冲液(3.2.10)-乙肘(85十15,体积比),混匀 C柱,离子对试剂缓冲液(3.2.10)-乙睛(90+10,体积比),混匀 流速:1.0mL/min. c d 柱温;40C 波长:240 e nm
GB/T22388一2008 f 进样量:20L 3.5.2标准曲线的绘制 用流动相将三聚氮胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8,2、20,40,80g/mL的标准工作液， 浓度由低到高进样检测,以峰面积-浓度作图,得到标准曲线回归方程 基质匹配加标三聚氰胺的样品 HPLC色谱图参见附录A中的图A.1 3.5.3定量测定 待测样液中三聚氮胺的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应稀释后再进样分析 3.5.4结果计算 试样中三聚氰胺的含量由色谱数据处理软件或按式(1)计算获得 xcxYx1oo 1 X= A，×n×1000 式中: 试样中三聚饥胺的含量,单位为毫克每千克(mg/Akg); 样液中三聚氮胺的峰面积 一标准游液中三聚氛胶的浓度,单位为微克每毫升(ee/mL 样液最终定容体积,单位为毫升(mL); 标准溶液中三聚氮胺的峰面积 试样的质量,单位为克(g); 77 稀释倍数 3.6空白实验 除不称取样品外,均按上逃调定条件和步骤进行 3.7方法定量限 本方法的定量限为2mg/kg 3.8 回收率 在漆加浓度nmg/k以一10m眼/k罐浓度范围内,回收率在80%~10%之间,相对标准解差小 于10% 3.9允许差 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 第二法液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/NIS法 原理 试样用三氯乙酸溶液提取,经阳离子交换固相萃取柱净化后,用液相色谱-质谱/质谱法测定和确 证,外标法定量 4 2 试剂与材料 除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 4.2.1乙酸 4.2.2乙酸铵 4.2.3乙酸铵溶液(10mmol/L):准确称取0.772g乙酸铵于1L容量瓶中,用水溶解并定容至刻度， 混匀后备用 4.2.4其他同3.2. 4.3仪器和设备 液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)仪:配有电喷雾离子源(EsI) 4.3.2其他同3.3
GB/T22388一2008 4.4样品处理 4.4.1提取 4.4.1.1液态奶、奶粉、酸奶,冰淇淋和奶糖等 称取1g(精确至0.01g)试样于50m具塞塑料离心管中,加人8ml三氯乙酸溶液(3.2.8)和 2ml.乙睛,超声提取10min,再振荡提取10min后,以不低于4000r/min离心10min 上清液经三氯 乙酸溶液润湿的滤纸过滤后,做待净化液 4.4.1.2奶酪,奶油和巧克力等 称取1g(精确至0.01g)试样于研钵中,加人适量海砂(试样质量的4倍6倍)研磨成干粉状,转 移至50ml具塞塑料离心管中,加人8mL三氯乙酸溶液(3.2.8)分数次清洗研钵,清洗液转人离心管 中,再加人2ml乙睛,余下操作同4.4.1.1中“超声提取10min,做待净化液” 注:若样品中脂肪含量较高,可以用三氯乙酸溶液饱和的正已烧液-液分配除脂后再用SPE柱净化 4.4.2净化 将4.4.1中的待净化液转移至固相萃取柱(3.2.13)中 依次用3mL水和3mL甲醇洗涤,抽至近 干后,用6ml氨化甲醇溶液(3.2.9)洗脱 整个固相萃取过程流速不超过1mL/min 洗脱液于50c 下用氮气吹干,残留物相当于1些试样)用1mL流动相定容涡旋混合1min,过微孔滤膜(3.2.16)后 供Lc-Ms/Ms测定 4.5液相色谱-质谱/质谱测定 4.5.1IC参考条件 a 色谱柱;强阳离子交换与反相C混合填料,混合比例(l;4),l50mm×2.0mm[内径(i.d.] 5um,或相当者 流动相:等体积的乙酸铵溶液(4.2.3)和乙晴充分混合,用乙酸调节至pH=3.0后备用 b e)进样量;10L d)柱温;40C e)流速.0.2mL/min. 4.5 Ms/NMS参考条件 2 a 电离方式:电喷雾电离,正离子 b) 离子喷雾电压:4kV 雾化气:氮气,2.815kg/enm(40psi). 干燥气:氮气,流速10L/min,温度350 d C 碰撞气:氮气 分辨率:Q1(单位)Q3(单位) 扫描模式:多反应监测(MRM),母离子m/z127,定量子离子m/z85,定性子离子m/z68 停留时间0.3s 裂解电压:100V 碰撞能量;m/z127>85为20V,m/2127>68为35V 4.5.3标准曲线的绘制 取空白样品按照4.4处理 用所得的样品溶液将三聚氮胺标准储备液(3.2.12)逐级稀释得到的浓 g/mL的标准工作液,浓度由低到高进样检测,以定量子离子峰面积浓 度为0.010.050.1,0.2、0.5 度作图,得到标准曲线回归方程 基质匹配加标三聚氮胶的样品IC-Ms/NMs多反应监测质量色谱图 参见附录A中的图A.2 4.5.4定量测定 待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应稀释后再进样分析
GB/T22388一2008 4.5.5定性判定 按照上述条件测定试样和标准工作溶液,如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液一致 变化范围在士2.5%之内);样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰 度一致,相对丰度偏差不超过表1的规定,则可判断样品中存在三聚胺 表1定性离子相对丰度的最大允许偏差 >50% <10% 相对离子丰度 -20%至50% >10%至20% 士20% 士25% 士30% 士50% 允许的相对偏差 4.5.6结果计算 同3.5.4 4 6 空白实验 除不称取样品外,均按上述测定条件和步骤进行 4.7方法定量限 本方法的定量限为0.mg/Ake. 4.8 回收率 在添加浓度0.01mg/kg~0.5mg/kg浓度范围内,回收率在80%110%之间,相对标准偏差小于 10% 4.9允许差 在重复性条件下获得的两次独立刹定结果的绝对差值不得超过算朴平均值的15% 第三法气相色谱-质谱联用法GC-MS和GC-Ms/NMS法 5 原理 试样经超声提取、固相萃取净化后,进行硅婉化衍生,衍生产物采用选择离子监测质谱扫描模式 (SIM)或多反应监测质谱扫描模式(MRM),用化合物的保留时间和质谱碎片的丰度比定性,外标法 定量 5.2试剂与材料 除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 5.2.1毗哧:优级纯 5.2.2乙酸铅 5.2.3衍生化试剂:N,O-双三甲基硅基三佩乙酰胺(ESTFA)十三甲基氯硅烧(TMCs)(99十1),色 谱纯 4 5.2. 乙酸铅溶液(22g/L):取22g乙酸铅用约300ml水溶解后定容至1L 5. .2.5三聚氮胺标准溶液;准确吸取三聚氮胺标准储备液(3.2.12)1ml于100nmL容量瓶中,用甲醉 定容至刻度,此标准溶液1ml.相当于10ug三聚氮胺标准品,于4C冰箱内储存,有效期3个月 氧气;纯度大于等于99.999%. 5.2.7氮气;纯度大于等于99.999% 5.2.8其他同3.2. 5.3仪器和设备 5.3.1气相色谱-质谱(GC-MS)仪;配有电子轰击电离离子源(EI) 5.3.2气相色谱-质谱/质谱(GC-Ms/MS)仪;配有电子轰击电离离子源(El) 5.3.3电子恒温箱 5.3.4其他同3.3.
GB/T22388一2008 5.4样品处理 5.4.1GC-MIS法 5.4.1.1提取 5.4.1.1.1液态奶,奶粉、酸奶和奶糖等 称取5g(精确至0.01g)样品于50ml.具塞比色管,加人25ml三氯乙酸溶液(3.2.8),涡旋振荡 30s,再加人15mL三氯乙酸溶液,超声提取15min,加人2mL乙酸铅溶液(5.2.4),用三氯乙酸溶液 定容至刻度 充分混匀后,转移上层提取液约30ml至50ml离心试管,以不低于4000r 离心 /mln 10min 上清液待净化 5.4.1.1.2奶酪、奶油和巧克力等 称取5g(精确至0.01g)样品于50ml具塞比色管中,用5ml热水溶解必要时可适当加热),再 加人20ml三氯乙酸溶液(3.2.8),涡旋振荡30s,再加人15ml三氯乙酸溶液超声提取及以下操作同 5.4.1.1.1 若样品中脂肪含量较高,可以先用乙酥脱脂后再用三氯乙酸溶液提取 5.4.1.2净化 准确移取5ml的待净化滤液至固相萃取柱(3.2.13)中 再用3ml水,3ml甲醉淋洗,弃淋洗 液,抽近干后用3mL氨化甲醇溶液(3.2.9)洗脱,收集洗脱液,50C下氮气吹干 5.4.2GC-MS/MS法 奶粉、奶醋.奶油、巧克力和奶糖等 5.4.2.1 称取0.5g(精确至0.01g)试样,加人5ml甲醇水溶液(3.2.7),涡旋混匀2min后,超声提取 5min一20min,以不低于40o0r/min离心10min,取上清液200,L用微孔滤膜(3.2.16)过滤,50c 下氮气吹干 5.4.2.2液态奶和酸奶等 称取1g(精确至0.01g)试样,加人5nl甲醇,涡旋混匀2min后,超声提取及以下操作同5.4.2.1 5. 4.3衍生化 取上述氨气吹干残留物，加人600L的毗晓和200L衍生化试剂(6.2.3)混匀，70C反应 30min后,供GCMS或GCMS/MS法定量检测或确证 5.5气相色谱-质谱测定 5.5.1仪器参考条件 5.5.1.1GC-Ms参考条件 色谱柱:5%苯基二甲基聚硅氧婉石英毛细管柱,30mX0.25mm[内径(i.d.]×0.25Am,或 a 相当者 流速:1.0mL/min D 程序升温:70C保持1min,以10C/min的速率升温至200C,保持10nmin. c dD 传输线温度;28oc 进样口温度;250C 进样方式;不分流进样 进样量:1L 电离方式;电子轰击电离(E. 电离能量:70eV 离子源温度:230 k扫描模式;选择离子扫描,定性离子m/z99,171,327,342,定量离子m/z327 5.5.1.2GC-Ms/NMS参考条件 a 色谐柱:5%苯基二甲基聚硅氧婉石英毛细管柱,30m×0.25mm[内径(i.d.]×0.25m,或 相当者
GB/T22388一2008 b 流速1.3mL/min. 程序升温:75C保持1min,以30C/min的速率升温至220C,再以5C/min的速率升温至 250C,保持2min. d)进样口温度;250C 接口温度:250C f 进样方式:不分流进样 进样量;lAL 电离方式:电子轰击电离(EI) 电离能量:70eV 离子源温度:220 k)四级杆温度;150 碰撞气;氯气,0.2394Pa(1.8mTorr). 碰撞能量:15V m n)扫描方式;多反应监测MRM),定量离子m/z342>327,定性离子m/z342>327,342>171 5.5.2标准曲线的绘制 5.5.2.1GC-MS法 准确吸取三聚氮胺标准溶液(G.2.5)0,0.4.0.8.1.6,4.8.,16mL.分别置于7个1o0mL容量瓶中 用甲醇稀释至刻度 各取1ml用氮气吹干,按照5.4.3步骤衍生化 配制成衍生化产物浓度分别为 0,0.05,0.1、0.2,0.5、124g/ml的标准溶液 反应液供GC-MS测定 以标准工作溶液浓度为横坐 标,定量离子质量色谱峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线 标准溶液的GC-MS选择离子质量色谱图 参见附录A中的图A.3,三聚氮胺衍生物选择离子质谱谐图参见附录A中的图A.4 5.5.2.2Gc-Ms/MS法 准确吸取三聚汛胺标准溶液(5.2.5)0,0.04,0.08,0.4,0.8、4,8mL,分别置于7个100ml容量瓶 中,用甲醇稀释至刻度 各取1mL用氮气吹干,按照5.4.3步骤衍生化 配制成衍生化产物浓度分别 为0,0.005、0.01,0.05,0.1,0.5、14g/ml的标准溶液 反应液供GC-Ms/MS测定 以标准工作溶 液浓度为横坐标,定量离子质量色谐峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线 标准溶液的GC-MS/MS多 反应监测质量色谱图参见附录A中的图A.5 5.5.3定量测定 待测样液中三聚氮胺的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应对净化液稀释,重新行 生化后再进样分析 5.5.4定性判定 5 5.4.1GC-MS法 以标准样品的保留时间和监测离子(m/z99,171,327和342)定性,待测样品中4个离子(m/z99 171、327和342)的丰度比与标准品的相同离子丰度比相差不大于20% 5.5.4.2GC-Ms/MS法 以标准样品的保留时间以及多反应监测离子(m/z342>327、342>171)定性,其他定性判定原则同 4.5.5 5.5.5结果计算 同3.5.4. 5. 6 空白实验 除不称取样品外,均按上述测定条件和步骤进行 5.7方法定量限 本方法中,气相色谱-质谱法(GC-MS法)的定量限为0.05mg/kg,气相色谱-质谱质谱法(GC
GB/T22388一2008 MS/MS法)的定量限为0.005mg/kg 5.8回收率 GCMS法;在添加浓度0.05mg/kg2mg/kg浓度范围内,回收率在70%110%之间,相对标准 偏差小于10% GCMs/MS法;在添加浓度0.005mg/kglmg/kg浓度范围内,回收率在90%105%之间,相 对标准偏差小于10% 5.9允许差 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%
GB/T22388一2008 附 录A 资料性附录 三聚氧胺标准品色谱图 保留时间/min 图A.1基质匹配加标三聚氮腔的样品HPLC色谱图 检测波长240nm,保留时间13.6min,C，色谱柱 x10' 6Ic 5 4 3 心 x10 127>68 2.5 1.s叫 05 x10 127>85 2.5 0.51 0.20.40.60.81 22.22.42.62.833.23.43.63.844.24.44.64.855.25.45.6 保图时间/minm 图A.2基质匹配加标三聚胺的样品LC-MIS/NMS多反应监测质量色谱图 保留时间4.2min,定性离子m/z127>85和m/z127>68
GB/T22388一2008 5 500 5000 500 4000 3500 33 000 500 000 500 1000 500 l 14.00 7.00 8.00 9.00 11.00 12.00 13.00 10.00 保留时间/mim" 图A.3三聚胺衍生物GC-MS选择离子色谱图 保留时间12.514min 327.0 2000 响 800 1600 40o 171.0 1200 342.0 1000 800 60099.0 400 200 100 120 140 160 180 200 340 220 240 26o 280 300 320 m/n 图A.4三聚氮腔衍生物cc-MS选择离子质谱图 定性离子;m/299.0,171.0,327.0和342.0 10
GB/T22388一2008 回冈 kCounts1 TIc 1.50 1,.25 值 1.00- 0.75 0.50 0.25 .o TCOI 342.0>327.D[-15.0 2.o 四 l.5 0.0 Couns 342.0>171.0[-15.0w 200 150 100 50 保留时间/min 图A.5三聚胺衍生物GC-MS/NIS多反应监测质量色谱图 保留时间7.25min,定性离子m/z342>171和m/z342>327