国家标准 GB/T33035一2016 水仙黄条病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofNareissusyellowstripevirus 2016-10-13发布 2017-05-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/I33035一2016 水仙黄条病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了水仙黄条病毒(Narcisusyelorwsrijpeuirus)的检疫鉴定方法本标准适用于可能携带水仙黄条病毒的水仙及水仙产品检疫鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 sN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964植物病毒检测规范 SN/T3457植物病毒分子生物学检测规范水仙黄条病毒基本信息中文名;水仙黄条病毒学名:Nareissusyellowstripeuirus,缩写;NYSV 分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyiridae),马铃薯Y病毒属Poutyirus). 水仙黄条病毒的其他信息参见附录A 方法原理水仙黄条病毒的血清学和分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据仪器、用具及试剂 5.1仪器高速冷冻离心机、电子天平,PCR仪、荧光PCR仪,水平电泳系统、一20C低温冰箱和一80C超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、酶标仪等 5.2用具酶联板,可调移液器(2.5AL10AlL、20AL、100L,200L、1000AL)和可调移液器头、离心管、,研钵等 5.3试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 PTA-ELISA检测试剂见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D.
GB/T33035一2016 抽样和样品制备 6.1 抽样抽样方法按照sN/T2122中规定执行 6.2样品制备分别按照有症和无症进行样品制备,具体方法按照SN/T2964和SN/T3457中规定执行检测鉴定 7.1PTA-ELISA检测以含NYSV材料作为阳性对照,以不含NYsV的健康植物组织作阴性对照,同时以样品提取缓冲液作为空白对照,具体操作见附录B 7.2RI-pCR检测以含NYsV材料作为阳性对照,以不含NYsV的健康植物组织作阴性对照,同时以ddH,O代替模板作为空白对照分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作见附录C 如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行 7.3实时荧光RI-PCR检测以含NYsV材料作为阳性对照,以不含NYsv的健康植物组织作阴性对照,同时以ddH.o代替模板作为空白对照分别提取样品和对照的总RNA,进行实时焚光RT-PCR检测,具体操作见附录D. 如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行结果判定样品检渊时.检测流程及结果判定按下述原则进行 -PTA-ELISA初步筛检,若检测结果为阴性,则判定样品不携带NYsV;若检测结果为阳性,则采用RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行验证 -若验证结果为阳性,则判定样品携带NYSV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带NYsV 样品保存与结果记录 9.1样品保存经检测确定携带NYSV的样品应保存在适合的条件下以备复核种苗叶片等样品保存在一80C冰箱中;做好登记和标记工作,保存期限至少6个月结果记录 9.2 记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字 PTA-EL.ISA 检测应有酶联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有实时荧光结果图片
GB/T33035一2016 附录 A 资料性附录) 水仙黄条病毒相关资料 A.1寄主范围自然寄主主要为石蒜科的水仙(NareissustasetlaL.)和长寿花(NareissusjonguillaL.). 病害症状侵染水仙后引起的典型症状为沿叶脉产生褪绿黄色条斑,系统花叶,病叶表面有凸起,花梗产生褪绿斑,病株花朵着色不均,最后导致鳞茎变小、植株矮化.直至提前枯萎(参见图A.1). 图A.1NYSV侵染水仙后引起的症状 A.3分布地区主要分布于英国、荷兰、立陶宛、美国、新西兰、传播途径汁液接触、蚜虫传播 A.5粒体形态病毒粒体为线条状,大小约755nm×12nm(参见图A.2)
GB/T33035一2016 注;引自http://www.dpvweb.net 图A.2NYs病毒粒体 A.6病毒基因组正义单链RNA病毒,全长约9650bp
GB/I33035?2016 B ? 淶??) ?岶???(PIA-ELISA B.1? ?(pH9.6) B.1.1 ?(Na,cO. 1.59g ?(NaHcO. 2.93g (NaN,) 0.2g ?900ml,HClpH?9.6,??1L,4C档 B.1.2λ?(PBs,pH7.4 ?(NaCD) 8.0g (KH.PO 0.2g (Na,HPO 1.15" ?(KCD 0.2g (NaN,) 0.2g 900mL???,NaOHHClpH?7.4,??1L B.1.3PBST ?PlSм0.5mL-20. B.1.4???/????? (TiHcD 13.0g ???(Tris) 2.0g ?(NaCD) 9.0g -20(Tween-20 25.0ml ?? 50.0g и?1L,4C档 B.1.5(pPp)?(pHg.8 ??(MgCl. 0.lg (NaN, 0.2 ?[HN(CH,CHOH).] 97.0ml 800mL??,HClpH?9.8,??1L,C档 B.1.6 :??
GB/T33035一2016 酶标抗体;碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG B.2操作步骤 B.2.1样品制备称取0.5g1.0g待测样品,按1:10(质量:体积)比例加人包被缓冲液,用研钵研磨成浆,8000 离心5min.上清液即为制备好的检测样品,保存于一20C冰箱阴性对照、阳性对照作相应的处理或按说明书进行 B.2.2包被抗原加人制备好的检测样品,同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照每个处理至少设2个重复 100L/孔,37C孵育1h或4C冰箱孵育过夜,倒去酶联板孔中溶液,用PBST洗涤4次一6次 B.2.3加病毒抗体将病毒抗体按说明稀释至工作浓度,加人到酶联板的孔中,1004L/孔,37C孵育1h,倒去酶联板孔中溶液,用PBST洗涤4次~6次 B.2.4加酶标抗体将酶标抗体按说明将稀释至工作浓度,加人到酶联板的孔中,100L/孔,37C孵育1h,倒去酶联板孔中溶液,用PBST洗涤4次~6次 B.2.5加底物将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),按100al/孔,加人到酶联板中,室温避光孵育 B.2.6吸光值的测定阳性对照孔显色后,用酶联仪于405nm处读OD值 B.3结果判断在满足阴性对照孔的oD值<0.15,阳性对照孔的oD值/阴性对照孔的oD值>5一10,孔的重复性基本一致的质量要求后,样品OD值/阴性对照OD值>2,判为阳性样品OD值/阴性对照oD值在阔值附近,判为可疑样晶,需重新做一次,或用其他方法加以验证样晶oD值/阴性对照OD值<2,判为阴性
GB/T33035一2016 附录c 规范性附录 RT-PCR检测 C.1试剂 C.1.1TRIzol裂解液 c.1.25×TBE缓冲液 Tri、碱 54.0g 砌酸(H,BO. 27.5g 20 0.5mol/LEDTA(pH8.0) mL 补充蒸僧水至1L 用时加蒸僧水稀释至0.5×TBE c.1.36×加样缓冲液 C.1.4三氯甲烧 C.1.5异丙醉 c.1.675%乙醉 c.1.7无水乙醇 C. 1.8RT缓冲液 C1.9aNTP0mmo/L. c.10MEMLVRT.200U/AL c.1.,11RNA酶抑制剂;40U/nL C.1.12TaqDNA聚合酶 C.1.13PCR缓冲液 C.1.14MgCl;25mmol/L c.1.15引物;RT-PCR引物见表c.1 表C.1RT-PCR的引物病毒名称引物序列目的条带大小 NYsv-[5'-GAAGcAAAGTG;TcGcCAGTG3'" 水仙黄条病毒 751bp NYSV-r;5'-cAcGcCTAGAAGGTTGTGCAT-3 c.2RI-PCR检测 C.2.1总RNA提取取0.1g样品组织置于研钵中,加人lmLPBsT缓冲液研磨，4C,l0000片离心5min,取上清液 (100l200AL)迅速转移至灭菌的1.5ml离心管中,加人1mLTRIaol试剂,剧烈振荡后,室温静置 5 min;4,12000买离心10min,取上清液;加人三氯甲婉300AL,剧烈振荡15s,室温静置5 min C,12000尽离心15min,取上层水相;加人等体积的异丙醉,颠倒混匀后室温下静置15 min,4 1200发离心10mim.弃上请液;加人ImL75%乙醉洗涤沉淀2次,每次4c.7500！离心了mn,弃上清液;RNA沉淀干燥后,用20AL40L经DEPC焦碳酸二乙醋)处理过的ddH,O溶解,一20 保存备用
GB/T33035一2016 C.2.2eDNA合成在PCR管中加人2Al总RNA,1Al下游引物NYsV-r(10Amol/L),ddH.O5AL,70水浴 10min,迅速冰浴5min,再加人下列试剂:5×RT缓冲液2.5AL、dNTPs(10mmol/儿L)1AL、 MMLVRT200U/L)0.5ALRNA酶抑制剂(40U/L)0.5AL 42C水浴60min,70C水浴 10min,自然冷却至室温，一20C保存备用 C.2.3PCR扩增 PCR反应体系见表C.2,每个反应设置2个重复 PCR反应条件;94C预变性3min，然后94C变性45s,55C退火50s、72C延伸60s,35个循环,最后一个循环结束后72C继续延伸10 min 表C.2CR反应体系名称加样量/L cDNA 3.0 0.5 TuDNA聚合牌GU/aL dNTPs10mmol/L 0.5 10×PCR缓冲液(不含Mg+ 2.5 25mmol/L.MgCl 2.0 上游引物(10mol/L 1.0 下游引物(10pmolL) l.0 ddH.o 14.5 总体积 25.0 C.2.4阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 c.2.4.1阴性对照:不含病毒的健康植物组织 C.2.4.2阳性对照;含有NYsV材料 C.2.4.3空白对照:ddH,O C.2.5琼脂糖凝胶电泳制备1.5%的琼脂糖凝胶,对PCR产物进行电泳,电压120V,缓冲液0.5×TBE 电泳结束后,在澳化乙锭(EB,浓度为0.54g/mL)溶液染色10min后,再在凝胶成像系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带,拍照并做记录 C.2.6结果判断如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,阳性对照在751bp大小处有扩增条带,待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带,则判定为阳性如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,阳性对照在751bp大小处有扩增条带,待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带,则判定为阴性
GB/T33035一2016 附录 D 规范性附录实时荧光RI-PCR检测 D.1试剂核酸提取、反转录试剂同c.1 D.2引物及探针实时荧光RT-PCR检测引物及探针见表D.1 表D.1实时荧光RT-PCR检测引物及探针名称序列(5'-3' 上游引物NYSV1 TGGATG;GAGAAGAACAAG;TTGAATT 下游引物NYSVr GCCATTATCTGCCTGAGTGTAGGT 探针NYSV-Probe FAM-CCACTTAAACCCATCATTGATCACGCCA-BHQ D.3 总RNA提取方法同c.2.1 D.4eDNA合成方法同c.2.2 D.5实时荧光PCR反应实时荧光PCR反应体系见表D2,每个反应设置2个重复反应程序:95C30s;95C5s,60C34s,共40个循环表D.2实时荧光RT-PCR反应体系名称加样量/AL 2×PremixExTag 12.5 NYSV(10amol/L) 0.5 NYSVr(10丝mol/L) 0.5 NYSV-Probe(10umol/L) 0,5 cDNAN 2.0 ddH.O 9.0 总体积 25.0
GB/T33035一2016 D.6阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 D.6.1阴性对照;不含病毒的健康植物组织 D.6.2阳性对照:含有NYsV材料 D.6.3空白对照:ddH.O. D.7结果判定在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典型扩增曲线的条件下待测样品的ct值>40时,判定NYsV阴性待测样品的c值<35时,判定NYsV阳性待测样品的3540时,判定Ys 阴性;如果重新测试的Ct值一40,则判定NYsv阳性 10o

水仙黄条病毒检疫鉴定方法GB/T33035-2016

水仙黄条病毒是影响水仙花生长和品质的一种严重病毒病害，对花卉产业造成了很大的经济损失。为了控制这种病害的传播，国家发布了水仙黄条病毒检疫鉴定方法GB/T33035-2016。

鉴定原理

水仙黄条病毒鉴定采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，通过检测样品中是否含有水仙黄条病毒核酸来进行鉴定，具有高灵敏度和特异性。

操作流程

水仙黄条病毒检疫鉴定方法的操作流程如下：

取样：从疑似感染水仙黄条病毒的水仙花植株上采集叶片样品。
提取RNA：使用RNA提取试剂盒对样品中的总RNA进行提取。
RT-PCR扩增：将提取得到的RNA进行反转录和聚合酶链式反应扩增，通过电泳检测扩增产物。
结果判读：根据扩增产物的大小和数量判断样品是否含有水仙黄条病毒。

注意事项

样品采集和操作过程中要注意消毒，避免污染。
使用试剂和器材要按照说明书规定使用。
在操作过程中要避免目标核酸的污染。
结果解读需要结合实际情况进行综合判断，不可以只凭一项检测结果做出诊断。

总之，水仙黄条病毒检疫鉴定方法GB/T33035-2016是一种有效的检测手段，可以帮助控制水仙黄条病毒的传播，保护花卉产业发展。