猪轮状病毒病病毒RT-PCR检测方法

猪轮状病毒病病毒RT-PCR检测方法

国家标准 GB/T34756一2017 猪轮状病毒病病毒RT-PCR检测方法 Porcinerotavirusdisease一 一Rr-pCRtordeteetingirusaeid 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34756?2017 ?RI-PCR? Χ ?涨?RT-PCR??豸 ????С)???? ?? AMV;RNA???(avianmyeloblastosisvirus) p;(asepair) DEPC;?(diethypyrocarbonate) DNA;?(deoxyribonucleicacid) dNTPs;?(deoxyribonucleosidetriphosphates) PBSs;λ?(phosphate-buferedsalinebuffer) PCR:????(polymerasechainreaction) RNA:?(ribonucleicaced) inhibitor RRIRNA??RNaseribonuclease RT;??(revw versetranscriptase ase-polymerasechainreaction RT-PCR:??-????(r reversetranscrIpta Taq?;TaqDNA??(TaqDNApolymerase ? й涨,????RNA???RNA? ? 3.1?;±档 3.2 3.375%? 3.4?(DEPC). 3.5Tu? 3.6AMv 3.7DNA?(DL.200obp). 3.8??(TAE)(?A.1. 3.91.5%??A.3). 3.10???(?B) 豸 4.1??
GB/T34756一2017 4.2PCR扩增仪 4.3核酸电泳系统 4.4恒温水浴锅 4.5冰箱(2C一8、一20C 4.6凝胶成像系统(或紫外透射仪) 4.7组织匀浆器或研钵 4.8二级生物安全柜 4.9微量加样器(0.5L一10L;2lL一20L.:20L一200L100L~1o00L). 5 操作程序 5.1样品的采集、运输和处理 5.1.1样品采集和运输 采集腹泻急性期的小肠(G.0cm10.0cm)或新鲜粪便(G.0g一10.0g),放到密封袋中,置于带有冰 袋的保存箱中,送至实验室 样品被运到实验室时,附带的冰袋应未完全融化;如样品不能被及时送到 实验室,应置于一20C冰箱中保存,贮存要求不超过1个月;如需长期保存样品,应置于一80C冰箱 5.1.2样品处理 5.1.2.1小肠样品 取5.0cm~10.0em小肠组织,用剪刀剪碎,加人10mlPBS,用适宜规格的组织研磨器或研钵研磨 后转移到适宜玻璃瓶中,每毫升样品加人RNA酶抑制剂RR(40U/L)500L,一20C反复冻融3次 后,摇匀,取1.0mL到1.5mL离心管中,经12000r/min离心5min,取500L上清备用 5.1.2.2粪便样品 取0.5g1.0g新鲜粪便,加人到含5.0mL10.0mL样品处理液配方见A.2)的玻璃瓶中,每毫 升样品加人RNA酶抑制剂RRI(40U/L)500AL,一20C反复冻融3次后,摇匀,取1.0mL到1.5ml 离心管中,经12000r/min离心5min,取5004L上清液备用 5.1.2.3细胞培养物样品 取细胞培养物,每毫升样品加人RNA酶抑制剂RRI(40U/aL)500AL,反复冻融3次,经 2000r/min离心10min,取1nml上清备用 5.2RNA的提取 可选择市售商品化试剂盒、全自动核酸提取法或其他商品化提取法提取RNA 在提取RNA过程 中设立阳性和阴性对照样品,RNA提取操作应在生物安全柜内进行 5.3反转录 5.3.1反转录引物序列 反转录引物采用下游引物P2,见附录c 5.3.2 反转录反应体系 反转录的反应体系见附录D.
GB/34756一2017 5.3.3反转录反应程序 42C水浴1h,70C灭活15min,结束反应 可以直接进行PCR,或者放于一20C保存备用 试 验中设立阳性对照、阴性对照和空白对照 5.4PCR 5.4.1PCR引物序列 见附录C 5.4.2PCR反应体系 见附录D. 5.4.3PCR反应程序 95C预变性5min后进人PCR循环,94C变性30s,54C退火30s,72延伸40s,30个循环,最 后72终延伸10min,结束反应 1.5%琼脂糖电冰分析结果 5.5电泳 制备1.5%琼脂糖凝股板,见A.3 5.5.1 5.5.2取10.0L.PCR产物与2.0uLDNA上样缓冲液(6×)混合,加人琼脂糖凝胶板的加样孔中,同 时加人DNA分子量标准作对照 5.5.3盖好电泳仪,插好电极,电压为80V~100V,时间为30min. 5.5.4用紫外凝胶成像系统对图片拍照、存档 5.5.5用分子量标准比较判断PCR片段大小 5.6结果判定 5.6.1试验成立的条件 阳性对照的PCR扩增产物电泳后在271bp位置出现特异性条带,同时阴性对照和空白对照PCR 扩增产物电泳后没有任何条带(参见图E.1),则试验结果成立;否则结果不成立 5.6.2阳性判定 在阳性对照、阴性对照,空白对照试验结果都成立的前提下,如果样品的PCR产物电泳后在271bp 位置上出现特异性条带,判定为猪轮状病毒核酸阳性 猪轮状病毒VP6基因扩增条带测序序列参见 E.2 5.6.3阴性判定 在试验结果成立的前提下,如果检测样品在271bp位置未出现特异性条带,判定为猪轮状病毒核 酸阴性
GB/T34756一2017 附 录 A 规范性附录) 溶液的配制 电泳缓冲液的配制 A.1 50×TAE的配制;准确称量242只三胫甲基氨基甲烧、57.1mL的冰乙酸、100mL.0.5mmol/L乙二 胺四乙酸(pH8.0),加人蒸馏水至1L,室温放置备用 使用时,用蒸憎水稀释成1倍使用 A.2样品处理液的配制 准确称量下列试剂,加去离子水定容至200ml121C灭菌20nin后窒温放置备用 氯化钠 l.60g 0.,04 氯化钾 1g 0.29 磷酸氢二钠 g 0.05 磷酸二氢钾 g 3.72 乙二胺四乙酸二钠纳 2g A.31.5%琼脂糖的配制 准确称取1.5g琼脂糖,加人100mL1×TAE,在微波炉中加热,使琼脂糖充分溶解,取出,加人适 量的染料,混匀,倒人制胶板中
GB/34756一2017 附录B 规范性附录 猪轮状病毒阳性样品和阴性样品 阳性样品制备 B.1 取猪轮状病毒细胞毒灭活后,用100mLPBS稀释至1个半数组织培养感染量TCIDa,向其中加 人不含猪轮状病毒的猪粪便10g,摇匀,分装,0.5mL/管,备用 B.2阴性样品制备 用PBS按10:1的比例稀释不含猪轮状病毒的猪粪便,摇匀,分装,0.5mL/管,备用
GB/T34756一2017 录 附 C 规范性附录) 检测猪轮状病毒RI-PCR方法的引物序列浓度及扩增片段 引物序列及浓度见表C.1 表c.1引物序列 引 物 列 引物名称 引物浓度 序 说明 5’-GAAACGGAATAGCTcCCACAAT-3” 上游引物P1 10pmol/ 扩增片段为轮状病毒的VP基 因,大小为271bp 下游引物P2 10pmol/Al GAATAATCAAATCCAGCCACC-3”
GB/34756一2017 附 录D 规范性附录 检测方法的RT和CR反应体系 D.1RT反应体系组成 RNA 20L 0mmol/LdNTPs 4.0丛 RNA酶抑制剂 1.0AL 5×反应缓冲液 8.0AL AMV反转录酶 2.0AL 下游引物P2(见附录C) 2.0AL DEPC水 3.0AL 总体积 40.0l D.2PCR反应体系 反转录产物(cDNA 3.0L TaqDNA聚合酶反应缓冲液(10X 2.5L 10mmol/LdNTPs 2.0l 上游引物P1(见附录C) .0l 下游引物P2(见附录C) 1.0AL TaqDNNA聚合酶 0,.5AL 灭菌去离子水 5.0AL 总体积 25.0L
GB/T34756?2017 ? E ??) ??? E.1????? ??????E.1 PC 2000bp 1000bp 70p 500bp 271bp 250bp 100bp ? DNA?(2000bpDNALadderMarker). M PC ?; N ?; ? ?E.1????? E.2?VP317~587λ TGAAATGGCTAGAGAGTcGCAACGAAACGGAATAGCTcCACAATCTGAAGCACTGAG AAAGCTGTCAGGTATTAAG:TTTAAGGGAATTAATTTTGACAATTCATCTGATTACATTGA GAATTGGAATTTACAAAATAGAcGACAGcGTACTGGATTcGTGTTcCATAAGCCAAATAT ACTTcCATACTCAGCATCATTCACTTTGAATAGATCACAGccGGCACATGATAATTTAATG GGGACTATGTGGATTAACGcCTGGATCAGAAATT(271bp)

猪轮状病毒病病毒RT-PCR检测方法GB/T34756-2017

猪轮状病毒病是由猪轮状病毒引起的一种疾病，主要通过口腔-粪便途径传播。该病毒造成的临床症状包括呕吐、腹泻和脱水等。为了及时诊断和控制该病，需要使用可靠的检测方法。

目前，常用的猪轮状病毒RT-PCR检测方法已经被纳入国家标准GB/T34756-2017中。该标准规定了猪轮状病毒RT-PCR检测方法的实验室设备、试剂盒、反应系统和检测步骤等方面的要求。

具体而言，该标准要求PCR检测应使用相应的试剂盒，包括病毒RNA提取试剂盒、RT试剂盒和PCR试剂盒。同时，还要求反应体系包括正、负对照以及内标对照，并且需要按照规定的温度和时间进行PCR扩增反应。

在检测结果的解释方面，该标准规定了阳性和阴性结果的判断标准，并且对于可疑结果需要进行复检或者其他检测方法的验证。

总之，猪轮状病毒病病毒RT-PCR检测方法符合GB/T34756-2017标准，具有高灵敏度和特异性，是目前诊断猪轮状病毒病的主要手段之一。

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2022/9/1 4:56:05 现行