草鱼出血病诊断规程

草鱼出血病诊断规程

国家标准 GB/T36190一2018 草鱼出血病诊断规程 Proteolofdagnstiemethodlsforhemorhugiediseasefgrasscarp 2018-05-14发布 2018-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/36190一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业农村部提出 本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TcC156)归口 本标准起草单位:浙江省淡水水产研究所、检验检疫科学研究院、深圳出人境检验检疫局 本标准主要起草人:沈锦玉、潘晓艺、郝贵杰、徐洋、江育林、陈爱平、高隆英、袁雪梅、尹文林、 姚嘉诿、菌凌云
GB/36190一2018 草鱼出血病诊断规程 范围 本标准规定了草鱼出血病诊断的临床症状,采样、病毒分离和鉴定以及综合判定 本标准适用于草鱼出血病的流行病学调查、诊断、检疫和监测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期版本适用于本文件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 sc/T7016.3鱼类细胞系第3部分;草鱼卵巢细胞系(co) SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 缩略语 下列缩略语适用于本文件 AMV;鸟类成髓细胞性白血病病毒(avianmyeloblastosisvirus) bp;碱基对(basepair deoxyribonucleicacid DNA;互补脱氧核糖核酸(cc complementary cellline CO草鱼卵巢细胞系(grasscarpovary cytopathiceffeet CPE;细胞病变效应(e ltrimethylammoniumbromide CTAB:十六婉基三甲基溴化铵(cetylt dNTP:脱氧核糖核昔三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate dATP;脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate) dCTP脱氧胞苷三磷酸deoxyeytidinetriphosphate) dGTP脱氧鸟苷三磷酸三钠(deoxyaguanoe triphosphate 1osine dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidinetriphosphate) 3mide EB;澳化乙唁(ethidiu 1mbrOm EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid enzyme-linkedimmunosorbentassay ELISA;酶联免疫吸附试验( FBS;胎牛血清(fetal bovineserum GCRV:草鱼呼肠孤病毒( grasscarpreOvirus HEPES;4-胫乙基听嗓乙碱酸[4(2-hydroxyethyI)-lpiperazineethanesulfonicacid] oxidase HRP:辣根过氧化物酶(horseradishpero MCP主要衣壳蛋白(msjorcapsidprotein) PHBST;磷酸盐吐温缓冲液(phosphatebuffersolution-tween-20 RT-PCR;逆转录-聚合酶链式反应(reversetranseriptionpolymerasechainreaetion
GB/T36190一2018 RNA;核糖核酸(rilbonuedleieacd) sDsPAGE.十二烧基硫酸销聚丙婚酰胶凝胶电泳(odium.daoadesylslhatepolyacrylhamidegel- lectrophoresis TBE;三胫甲基氨基甲碉酸乙二胺四乙酸缓冲液(Tris-Borate-EDTA) 试剂和材料 4.1琼脂糖:电泳级 4.2邻苯二胺;分析纯 4.3AMV逆转录酶;l0U/L,一20C保存,避免反复冻融或温度剧烈变化 4.4RNA酶抑制剂(RNaselnhibitor);-20C保存,避免反复冻融或温度剧烈变化 4.5dNTP含dCTP,dG:TP,dATP,dTTP各10mmol/L,一20C保存 4.6Taq酶;10U/AL,保存温度为一20C,同时应避免反复冻融或温度剧烈变化 4.7无水乙醇;分析纯,使用前预冷到一20c 4.8DNA分子量标准:DNAMarker2000,4保存 4.9辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠抗体;一20C保存 4.10过氧化氢:分析纯 4.11GCRV参考株GCRV873株(GCRVI型),GCRV9014株(GCRVI型),GCRVHB1007株 (GCRVI型 注，由农业部相关部门指定机构提供 4.12羊抗GCRV免疫球蛋白;-20C保存 注:由动物防疫管理部门指定单位提供 4.13鼠抗GCRV单克隆抗体;一20C保存 注由动物防疫管理部门指定单位提供 4.14鱼类细胞系:CO应符合sC/T7016.3的规定 4.15水:GB/T6682中一级水,核酸抽提和RT-PCR须使用无RNA酶的去离子水 4.16鱼类细胞培养液:用含厄尔平衡盐(Earle'sbalancedsalts)的M199培养基配制见附录A中 A.l),或其他商品化的细胞培养基,另加10%胎牛血清(FBS). 4.17鱼类细胞维持液;用含厄尔平衡盐(Earle'sbalancedsalts)的M199培养基配制,另加2%胎牛血 清(FBS) 4.18细胞消化液:见A.2. 4.19AMV逆转录酶缓冲液和Taq酶缓冲液;分别见A.6,A.7 4.20电泳缓冲液:TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液,见A.8) 4.21MgCl;25mmol/L,保存温度为-20C 4.22包被稀释液:为0.05mol/LpH=9.6的碳酸盐缓冲液(见A.ll. 4.23封闭液:1%明胶(用包被稀释液配制). 4.24终止液;2mol/L的硫酸 4.25依据GCRVI型中S10片段序列设计引物,扩增s10中的698bp片段(见附录B中B.1) 0mol/L正向引物:5'-CCCCGATCAT-CACCA-CGAT-3' 0mol/L反向引物:5'-CGCGT-TCGCT-GATGA-AAGG3' 4.26依据GCRVI型的M6片段序列设计引物,扩增M6中的320bp片段(见B.2). 0mol/L正向引物:5'-AGTTC-TCAAA-GC'TGA-GACAG3'; 10mol/儿反向引物:5'-ACGTGCGATT-GGAAGAGCTT-3'
GB/36190一2018 4.27依据GCRVII型的L2片段序列设计引物,扩增L2中的474p片段(见B.3): 10 mol/L正向引物5'-GTAAGCcCAC-AGGTC-CCACT-3'; 0pmol儿反向引物5'-AG.ATGAccCA-AGG.AA-TAGCA-GT3'" 器材和设备 5.1倒置显微镜 5.2生化培养箱 5.3普通冰箱和超低温冰箱 5.4组织研磨器 5.5冷冻离心机 5.6生物安全柜或超净工作台 5.7CR仪 5.8电泳仪,水平电泳槽和垂直电泳糟. 5.9微量移液器 5.10凝胶成像仪或紫外透射仪 5.11商压灭菌锅 5.12微波炉 5.13水浴锅 5.14制冰机 5.15磁力搅拌器 5.16过滤系统 5.17酶标仪和洗板机 临床症状 病鱼眼球突出、体色发黑,口腔,蟋盖和鳍条基部出血 撕开表皮,可见肌肉出现点状或块状出血 剖检腹腔,可见肠道充血.肝、脾充血或因失血而发白 根据出血部位可将此病分为“红肌肉”“红肠子” “红鳍红腮盖”三类 病鱼可以有其中一种或儿种临床症状 采样 7.1采样对象 草鱼、青鱼等易感鱼类 7.2采样数量 采样数量应符合sC/T7103的要求 7.3样品采集 按GB/T18088的规定执行,体长<4cm的鱼去尾后取整条(尾)鱼;体长为4cm一6cm(含)的鱼， 取脑、内脏(包括肾);体长>6em的鱼则取脑肝、肾和脾
GB/T36190一2018 8 病毒分离和鉴定 8.1病毒分离培养 8.1.1样品处理 最多每5尾鱼设为1个合并样,将样品匀浆成糊状,用含1000IU/mL青霉素和10004g/mL链 霉素的鱼类细胞培养液按1;10稀释 置于25C下孵育2h4h或4C下孵育过夜后8000×离心 20min,收集上清液 8.1.2病毒分离 对1:10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释 然后将1:10、l:100和1:1000三个稀释度 的上清液各100AL分别接种到生长约24h的COo见图B.1)单层细胞的96孔板中,25吸附1h后， 加人细胞维持液,置于25C士2C培养7d 试验中设2孔阳性对照即接种GCRV873株和2孔空白 对照即未接种病毒的细胞 10倍倒置显微镜检在 空白对照细胞形态应保持正常,用性对照细胞应此 7d内每天用40倍和 若接种了被检匀浆上清稀释液的co细胞出现CPE(见图B2)时,应立即进行GCRV鉴定， 现CPE 若无CPE出现,则需盲传1次 盲传时,将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融1次,以 8000×区,C离心20min.收集上清液 将100L.上清液接种到新鲜单层细胞的96孔板中,25C士 期间每天用40倍和100倍倒置显微镜检查 盲传后仍无CPE出现,则仍然需要做进 2C培养7d 步鉴定 不同基因型GCRV感染敏感细胞后表现出的cPE特征为:GCRv873(GCRVI型代表株)能 在co等草鱼敏感细胞系中大量增殖并出现CPE;GCRV9014(GCRVl型代表株)能在co等草鱼敏 感细胞系中大量增殖,但不产生CPE;GCRVHB1007株(GCRV皿型代表株)很少存在，也不 生CPE 8.1.3病毒分离结果判定 有临床症状的鱼,检测样品上清液接种细胞后,若出现CPE,可判断为疑似携带GCRVI型或 GCRV型 8.2R-PCR 8.2.1RNA提取 8.2.1.1对照设置 在样品处理过程中应设立阳性对照,阴性对照和空白对照 -取含有GCRV873参考株和GCRVHB1007参考株细胞悬液,同时取含有GCRV9014参考 株细胞悬液或含有病毒目的片段的非感染性体外转录RNA作为阳性对照; -取正常的细胞悬液作为阴性对照 -取等体积的水代替模板作为空白对照 8.2.1.2样品处理 将450AL细胞悬液或组织匀浆上清液放人1.5mL.的离心管,再加人450LCTAB溶液(见A.3) 并混匀,25C作用2h一2.5h
GB/36190一2018 8.2.1.3RRNA抽提 在含有900L样品处理液的离心管中加人600AL抽提液I见A.5)，用力混合至少30s 12000r/min、！离心5min,小心吸取上层水相(约800ML)于新离心管中 再加人7004L抽提液I 见A.4)，用力混合至少30s 12000r/min、4C离心5min,小心吸取上层水相(约600L)于新离心 管中 再加人-20C预冷的1.5倍体积的无水乙醇(约900AL),倒置数次混匀后，一20C8h以上沉 淀核酸 12000r/min、4C离心30min,小心弃去上清 沉淀干燥后加11L无RNA酶的去离子水 溶解,用作RT-PCR模板 也可以采用商品试剂盒抽提病毒核酸,其方法按商品说明书进行 提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增;若需长期保存应置于一80C冰箱中 8.2.2RT-PCR扩增 8.2.2.1eDNA合成 根据样品数量N,在离心管中分别加人4.17、4.18和4.,.19中的每条引物各N×1AL,混匀制成N× 6L.的引物预混液 在另一只离心管中,分别加人N×5L5倍逆转录酶缓冲液(见A.6),N×2nl dNTP,N×0.5L40U/AL的RNA酶抑制剂、N×1L10U/AL的AMV逆转录酶和N×0.5AL无 RNA酶的去离子水,混匀制成N×9al的反转录预混液 在PCR反应管中加人10L模板,再加人上述引物预混液6pAL,至总体积16L 94C变性 5min.立即冰浴,低速离心约5s,使液体集中在底部 在上述PCR反应管中,再加人9AL的反转录预 混液,至总体积25AL 45C反应60min以合成cDNA 8.2.2.2DNA扩增 根据样品数量N,在离心管中分别加人N×2.5L.10倍Taq酶用浓缩缓冲液(见A.7)、N×2AL 5mmol/L的MgCl、N×2LdNTP,三对引物每种各N×X1L、N×0.5AL10U/L的Taq酶、N ×7L无RNA酶的去离子水,混匀后按每PCR反应管20L分装,最后在各PCR反应管中分别加人 8.2.2.1合成的cDNA5AL,使得各管总体积25L 如果PCR仪没有热盖,每管还需加人50AL矿物 油 低速离心5s,以使试剂集中在底部 再将反应管置于PCR扩增仪中 94C预变性4tnin,再按以 下程序进行扩增反应;94C40s,55C40s,72C1min,35个循环;72C延伸8min,4C保温 8.2.3琼脂糖电泳 用1×TBE缓冲液(见A.8)制备2%的琼脂糖含0.54g/mlEB,见A.9)凝胶平板 将其放人水 平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面,将6LPCR扩增产物和2L样品缓冲液(见A.10)混匀后加 人样品孔 在电沫时设立DNA分子量标准 5V/em电泳约05h,当澳附蓝到达底部时停止.在紫外 透射仪或凝胶成像仪下观察 结果判定 8.2.4 电冰后经观察GcRvs8参考株阳性对照应出现688(见图B313该道)或GcRv04参考 株阳性对照应出现320bp(见图B.34-6泳道),或GCRRVHB1007参考株阳性对照应出现474bp(见图 B.37-9泳道)的DNA片段,阴性对照和空白对照均无该核酸带 待测样品RT-PCR扩增后能在相应698bpDNA位置上有带,或者能在相应320bp位置上有带， 或者能在相应474bp位置上有带,均可判为PCR阳性 无带或带的大小不是698bp,320bp和474bp 的均判为PCR阴性
GB/T36190一2018 阳性对照无特定条带出现或阴性对照或空白对照有条带出现都表明PCR失败,应在排除故障和清 除污染后,重新取样检测 8.3直接电泳检测病毒核酸 8.3.1RNA抽提 采用8.2.1的方法抽提获得病毒RNA 8.3.2核酸电泳 按常规方法配制5%9%的SDS-PAGE胶做垂直电泳,电泳结束后用常规方法银染或者EB染 色,观察电泳结果 8.3.3结果判定 GCRV基因组RNA电泳后能看到11条核酸带,根据片断长度大小,11个片段可分为3组,即3条 大片段(L1~L3,大小分别约为4.0kb3.5kb),3条中等片段(M4M6,大小分别约为2.5kb 2.0kb)和5条小片段(S7一s11,大小分别约为1.5kb一0.7kb),当样品RNAsDsPAGE胶做垂直电 泳能看到明显的l1个核酸带时可判定为阳性(见图B.4) 8.4L.ISsA检测 8.4.1包被 用pH9.6的包被稀释液(见A.1l1)按照说明书指示适量稀释纯化的羊抗GCRV免疫球蛋白(Ig)包 被ELISA板,每孔100L 4笔孵育过夜 次日用含0.05%表面活性剂吐温-20(Tween-20)的 0.01mol/LPBS(PBST,见A.13)洗3次 8.4.2封闭 用1%明胶溶于PBST中)封闭,每孔200AL 37C反应1.5h后，PBST洗1次 8.4.3加样 加人待测的样品,GCRV阳性对照和阴性对照,每孔100AL,37C反应2h PBST洗3次 8.4.4加单抗 按照说明书要求加稀释到一定浓度的鼠抗GCRV单克隆抗体到小孔中,每孔100AL,37C反应 1.5h PBST洗2次 8.4.5去除非特异性 加人0.1%H.O(用燕水稀释),去除非特异性过氧化物酶 每孔150L37C反应15min PBST洗2次 8.4.6加酶标抗抗体 加人标记辣根过氧化物酶的抗鼠IgG抗体(酶标二抗),每孔100AL37C反应1.5h PBsT洗 3次 8.4.7加底物显色 加人底物见A.16),每孔100L,37C反应 当阳性对照出现明显蓝色,阴性对照无色时加人终
GB/36190一2018 止液,在450nm波长下读取结果 底物改用邻苯二胺(OPD)或其他底物,应改用490nm或相应波长 测量 8.4.8结果判定 测量各孔的光吸收值后,计算P/N值 如果阳性对照孔P/N>2.1,表明对照成立 再计算待测样 品孔的P/N值 当P/N>2.1时判为GCRV阳性 当P/N<2.1时判为GCRV阴性 注:按公式P/N=待检测孔一空白对照)/阴性对照一空白对照). 综合判定 9.1确诊病例的判定 易感鱼类在发病条件下出现典型临床症状,且经过细胞分离病毒后,无论是否出现CPE,用RT PCR、ELISA,直接电泳检测病毒核酸方法中的一种,其结果为阳性即可确诊为草鱼出血病;如果直接将 病鱼组织匀浆上清液用RT-PCR,ELISA、直接电泳检测病毒核酸方法中的一种,其结果为阳性即可确 诊为草鱼出血病 g.2疑似携带或携带草鱼呼肠孤病毒的判定 9.2.1疑似携带草鱼呼肠孤病毒的判定 无临床症状或临床症状不典型的鱼类,但能直接从鱼组织匀浆上清液中用RT-PCR,ELISA或者 RNA直接电泳观察核酸带中任何一项结果为阳性,即可判断为疑似携带草鱼呼肠孤病毒 9.2.2携带草鱼呼肠孤病毒的判定 无临床症状或临床症状不典型的鱼类,但能直接从鱼组织匀浆上清液中用RT-PCR,ELISA或者 RNA直接电泳观察核酸带中其中二项为阳性，或者经过细胞分离病毒后,用PCR、ELISA或RNA直 接电泳观察11条核酸带中任何一项结果为阳性,即可判断为携带草鱼呼肠孤病毒
GB/T36190一2018 附 录 A 规范性附录) 试剂及其配制 细胞培养液 A.1 按M199培养基(含Earle's盐)说明书的要求,用一级水配制,然后加人10%经56C30min灭活 的胎牛血清,用碳酸氢钠粉末调节培养液pH为7.2~7.4 过滤除菌,分装后一20C保存 在开放系统 使用时,需要加人过滤除菌的HEPEs,使其在培养液中的终浓度为0.02mol/L A.2细胞消化液 在1L灭菌去离子水中,顺序加人氯化钠8g,氯化钾0,2g,磷酸二氢钾0.lg、十二水合磷酸氢二钠 2.3g、乙二胺四乙酸0.2g,胰酶0.,6g,碳酸氢钠0.4g一0.6g使pH为7.4~8.0 完全溶解后过滤除 菌,分装，一20C保存 A.3CTAB溶液 含CTAB2%,氯化钠1.4mol/L,乙二胺四乙酸20mmol/L,Tris-HCl20nmmol/L,pH7.5(配制 方法为,在60ml.水中顺序加人氧化钠8.19g,乙二胺四乙酸0.744g，Tris1.21g,浓盐酸0.25ml 0.3mL,使pH7.5一8.0,再加人cTAB2g,完全溶解后加水至100mL) cTAB溶液使用之前加疏基 乙醇至终浓度为0.25% A.4抽提液I 三氯甲婉:异戊醉按24:1的比例混合,密闭避光保存 抽提液I 1molLTris水溶液饱和的酚:三领甲烧:异戊醉按2524:1混合,密闭避光保存 A.6AMIV逆转录酶缓冲液(5倍浓缩液 分别用Tris-HClpH8.3)1000mmol/L、氯化钾1000 mmol/儿氧化镁250 mmol/儿L、二硫苏糖 醇250mmol/几等体积混合,-20C保存
GB/36190一2018 A.7ruq酶缓冲液(10倍浓缩液 分别用浓度为1500mmol/L.的Tris-Hcl(pH8.8)、1500mmol/几的氯化钾和3%的TritonX-100 水溶液等体积混匀配制而成,-20C保存 A.8IBE电泳缓冲液(5倍浓缩液 在1000mL水中,分别加人Tris54g、棚酸27.5g、乙二胺四乙酸2.922g,用5mol/L的盐酸调 pH至8.0 A.9EB浓缩液 用水配制成5mg/ml的EB浓缩液 用时每10ml电泳液或琼脂中加1pL A.10样品缓冲液 每100ml.水溶液中含澳酚蓝0.25g,蔗糖40g A.11包被稀释液(plH=9.6 在1000mL.水中,分别加人碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g,充分搅拌完全溶解后,4C保存 A.120.01mol/LPBs(plH=7.4) 在1000mL水中,分别加人碳酸氢二钠1.19g、碳酸二氢钠0.22g、氯化钠8.50g,充分搅拌完全溶 解后,4C保存 A.13PBST洗涤液(pH=7.4) 在1000mL水中,分别加人氯化钠8.0g、十二水合磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钾 0.2g,吐温-200.5mL,充分搅拌完全溶解后,4C保存 A.14四甲基联苯胺储存液 在25mL.N,N-二甲基甲酰胺中加人3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)250mg,充分搅拌完全溶解 后,4C保存 A.15底物缓冲液(pH=5.0) 在100m蒸溜水中加人一水合柠檬酸1.02g、十二水磷酸氢二钠3.68g,充分搅拌完全溶解后
GB/T36190一2018 4 C保存 A.16底物 在10mL底物缓冲液中,分别加人四甲基联苯胺储存液0.1ml,30%H.O5l,充分混匀后,现 配现用 0
GB/36190一2018 附录B 规范性附录 GCRV扩增产物参考序列及其核酸11条带电泳图和细胞,CPE形态 本附录给出了GCRV扩增产物的参考序列,其中方框处为引物位置 同时给出了病毒核酸11条 带的电泳图 同时给出了细胞cO正常图及其接种GCRV后所出现的CPE B.1GCRV873株第10条带(s10)的部分序列,PCR扩增其中的698p片段 GTTATTTCTGAGcCCCCGACATCACCACGCCACTTCACATGATTCCGCAMGTCGC0 61CACGCTATCGTGCGTGCAGCCCGCTGCACGACGCCTTACCTTATACACAAGAACTAGAACT 121GAGACCACCAACTTTGATCACGCTGAGTACGTCACCTGCGGGCGGTACACCATCTGCGCC 181TTCTGCCTTACGACTCTGGCTCCCCACGCCAACGTCAAGACCATTCAAGACTCCCACGCT 241TGTTCACGTCAACCAAATGAAGCCATTCGCTCATTAGTCGAAGTGAGTGACAAAGCGCAG 301ACCGCCCTCGTCGGTAGCCGTACTGTAGACTATCACGAATTGGATGTGAAAGCTGGGTTC 361GTCGCCCCAACTGCCGATGAAACAATAGCCCCCTCTAMAGGATATCGTCGAACTTCCGTTT 421CGCACCTGTGACTTGCGACGATTCCTCTGCTACCGCTTGCGTCCGAAATCACTGCCAGGC 481GGTCACGACGGCGTTATCCACCTCCCGATCCTTTCTGGAGATTTCAAATTGCCTAACGAG 541CATCCCACCAAACCGTTGGACGATACGCATCCCCACGACAAGGTGCTGACTCGCTGCCC oCCA0GcCMccccGrTAGTTCCMcc TCGTCCATGACM 601 AAGACTGGTCTCCTCCr ACTCAC 661GCTGCTACGAGAGCTATCCTCATGCACGACTCTACATCAGCGAACGCCGATGACGGC B.2GCRv9014株第6条带(M6)的部分序列,CR扩增其中的320bp片段 AGTCTCAAAGCTGAGACACGCCGACGTCCNNATATGAACGTCTGCTGATGTCAGAATC 61GAGACACTTGCTCATTACGcGTCACACCTTCGACCATACTCACTcCAGACGCTGTAGTTc 121CTGCCGCACCACCANGCTAATACGCCAACGACATCAGAGAGAAGTGATCCACTATTTCCGG 181CCCGTAACGCAGGGTATATCTTCAATGCTACCTCATATACAGCATTTTGGTATTGTTTGC 241ATACATTATCCACTGGTAGGTTTTCGTCCCAAAATCTAAGTAAGCTCTTCCAATCGACGT 301AAGCTCTTCCAATCGCACGT 11
GB/T36190一2018 B.3GCRVHB1007株第2条带(L2)的部分序列,PCR扩增其中的474bp片段 ATGCCGGCGGCdGTAAGCCCACAGGTCCCACcACTGCCGGTATGCATCCGCAGAACCCG 61GACATGTTCATGAAGATGACATCCCTGGGCGCCATTCCTAGAACGAGTTGGCCAATACTTT 121CATGACGCGCTGTTTGTTAAACGAGTCGTGTCGGGCATGGATGTCAATACGTTCGACGCT 181GCATTACTCAAGTTACGAATACTTGGTGCGCCCGCTAACGCTCTCGTAGGTGTGATCATG 241CAGTCGcGTTTCTCAGAGTCGGACGCAGCTGAAATAGCIGGTCGCATTCAACTCAACGAT 301GCACGTACTGTCCAGATACCGCGTGTCGTGAATTTATCCGTACCCGATACTTGGATGTTG 361TTCAACTTCCATCTCCTGCTGCACGCCACAGTTAATCCACATGGAATGTATGGTCAGACA 21ACCTTCACGAAAATCCCACCATCAATCCCATGGTTCCGTTCGATACTGCATTCCTTGGG 481CATCATTAATATGACCAGAGTTGGTCCGATTCATCAGGTGTATTTAGCGAGAATACAT B.4正常的co及其接种cCRV产生的CPE形态图(见图B.1和图B.2) 图B.1正常的co 图B.2co接种cCRV873株后出现的CPr形态 12
GB/36190一2018 B.5RT-CR后的电泳图和GCRV核酸11条带的电泳图见图B.3和图B.4). NT p p 20oo 100o 750 697 500 474 20 250 10o 说明 N;阴性对照;l3;873株;46;9014株;7-9,HB007株;NT:空白对照 图B3GVR经PCR后的2%琼脂糖电泳图谱 L 873株 HB1007株 9014株 图B,4GCRV三种基因型毒株核酸7%sDs-PAGE电泳图谱(由水科院珠江所提供》 13

草鱼出血病诊断规程GB/T36190-2018

草鱼出血病是一种常见病、多发病，严重影响了草鱼养殖业的健康发展。为了规范草鱼出血病的诊断，提高草鱼养殖业的生产效益，国家于2018年颁布实施了《草鱼出血病诊断规程》（GB/T36190-2018），该标准为整个行业提供了统一的标准和指导。

GB/T36190-2018标准主要分为五个部分：术语与定义、基本原则、诊断方法、检查项目和结果判断。其中，术语与定义明确了一些病理学上的专业术语，使得行业人士之间的沟通更加顺畅。基本原则部分则规定了草鱼出血病的发病原因、病理变化及其临床表现，为后续诊断方法和结果判断提供了依据。诊断方法部分详细介绍了草鱼出血病的检测技术，包括常规检测和特殊检测两种方法。检查项目部分列举了在草鱼出血病检测中必须要检查的各项指标，准确性得到了一定程度上的保证。结果判断部分则明确了各检测指标正常和异常值的界限，并根据检测结果提供了草鱼出血病是否存在的判断标准。

GB/T36190-2018标准的推行，可以有效规范草鱼出血病的诊断和治疗，提高养殖业的生产效益。同时，也为相关科研人员提供了一个统一的标准和检测方法，促进了行业的技术创新与升级。但是，这个标准并不能完全解决草鱼出血病的问题，我们还需要加强对于养殖环境的监管、提高养殖技术水平等措施，从而最大限度地预防和控制草鱼出血病的发生。

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2022/8/18 18:55:43 现行