动物狂犬病病毒中和抗体检测技术

动物狂犬病病毒中和抗体检测技术

国家标准 GB/T34739一2017 动物狂犬病病毒中和抗体检测技术 Detectingtechniqueofneutralizationantibodyagainstrabhiesvirusinanmals 2017-11-01发布 2018-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34739一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准参考世界动物卫生组织(OIE)2013年版《国际陆生动物卫生法典》2.1.13狂犬病的相关 内容 本标准由农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位:人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 本标准主要起草人;扈荣良、张守峰,刘哗,张菲
GB/34739一2017 动物狂犬病病毒中和抗体检测技术 范围 本标准规定了用于动物狂犬病血清中和抗体定量测定的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)的血清样 品采集、实验操作方法及结果判定 本标准适用于动物个体狂犬病免疫效果的定量测定、群体免疫覆盖率监测及狂犬病流行风险评估 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 GB19489一2008实验室生物安全通用要求 缩略语 下列缩略语适用于本文件 ATV;抗生素-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(AntibioticTrypsin-Ver. rsene BHK-21:乳仓鼠肾细胞系(BabyHamsterKidney21 BSL-2;生物安全2级实验室(BiosafetyLaboratoryLevel2) ngeVirusStandard CVS;狂犬病标准攻击毒株(Challenl FAVN:荧光抗体病毒中和试验(FluorescentAntibodyVirusNeutralizationTest esceinIsothiocyanate) FITC;异硫氰酸荧光黄(Fluore MEM:细胞基础培养基(Eagle'、MimimumEssentialMedium) PBS;磷酸盐缓冲液(Phosphate-BuferedSaine' TCIDa;半数细胞感染量MedianTissueCutureInfeectiveDose) 试剂和材料 除非另有规定仅使用分析纯试剂 4.1水:GB/T6682一2008,二级水 4.2商品化的狂犬病阴性标准犬血清 4.3商品化的狂犬病阳性标准犬血清,用前稀释至0.5IU/mL 4.4FITC标记的抗狂犬病病毒抗体,用PBS(0.01mol/L，pH7.4，见A.1)稀释成工作液,现用现配 4.5MEM见A.2). 4.6细胞培养用抗生素溶液(见A.3). 4.7抗生素-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(ATV)溶液(见A.4). 4.8固定液;80%丙酮(见A.5) 警示- -丙酮易燃,有害健康
GB/T34739一2017 4.9BHK-21细胞 4.10狂犬病标准攻击毒株cVs11,滴度应>10'TcID/ml 5 器材和设备 5.18道移液器,50al一200L(士2%). 5.296孔微量培养板 5.337C5%二氧化碳培养箱 5.4倒置荧光显微镜 5.5普通冰箱和超低温冰箱 5.6细胞计数器 5.7204L一200AL吸头 5.8BSL-2级生物安全柜 6 动物血清的采集 无菌采集动物血液不少于2mL,室温或37C静置60min 4C放置1h至过夜后,6000r/min离 心5min,收集上清，-20C以下保存待检 样品采集应详细记录动物品系、大小,免疫史、芯片号码、主 人姓名等信息 FAVN实验操作 7.1安全防护 本检测应在满足GB19489一2008的BsL-2级生物安全实验室内进行 进行本检测的人员应采取 针对性防护措施(见附录B) 7.2材料准备 7.2.1细胞 按常规方法培养BHIK-21细胞，1个75cnm'的细胞培养瓶(10m 培养液)细胞刚长成单层后 (4×10"细胞/mL),可以用于2块96孔(每孔细胞数为2×10'个/孔)细胞培养板的检测 7.2.2待测血清 待洲血清在56C下灭活30min 灭活时,将血清样本放在56C恒温水浴箱内,水面要高于血请 液面,但不要超过试管高度 7.2.3检测用培养板 以96孔细胞培养板进行检测 每个检测批次除了需要待测血清样品测定板(见C.3)若干以外,还 需设血清对照板(见C.1)和病毒对照板(见C.2)各1块 7.3检测操作 7.3.1血清的稀释 7.3.1.1在培养板上分别标记清楚样品对应编号,每个样品的同一个稀释度设4个重复,稀释直接在
GB/34739一2017 96孔培养板中进行 7.3.1.2血清对照板(见C.1)第16列、第AD行孔为阳性标准犬血清;第16列第E~H行孔为 阴性标准犬血清 每孔加人100LMEM 7.3.1.3待测血清样品测定板(见C.3)第1~9列第AH行孔为待测样品,每4列用于1份样品的检 测 每孔加人100LMEM. 7.3.1.4在血清对照板(见C.1)第1列、第AD行孔中加人504L阳性标准犬血清,第1列、第EH 行孔中加人50AL阴性标准犬血清 在待测血清样品测定板(见C.3)第1列、第AD行孔中加人 50l1号待测样品,第1列第E~H行孔中加人50l.2号待测样品 7.3.1.5用504l多道移液器对血清样品进行连续的3倍稀释,每个稀释度共设4个重复 产生1/3 1/9.1/27.1/81.1/243,1/729,1/2187.1/6561和1/19683的稀释倍数 其中对照血清只稀释6列.到 1/729 弃掉从最后一行孔中吸出的50l液体 7.3.2病毒的滴定 7.3.2.1在病毒对照板(见C.2)第1列、第AD行孔中加人100AlMEM，第2~6列,第A一D行孔 中加人150LMEM,用于病毒滴度的测定;在第9一10列、第A一H行孔中加人200ALMEM用作培 养基对照;在第11~12列、第A~H行孔中加人150LMEM用作细胞对照 7.3.2.2cvs-11病毒液在一60以下冰柜中贮存 用时取出1份,置于生物安全柜中融化,立即用 MEM将病毒稀释成100TcCD../50L,稀释总体积满足每个细胞培养板不少于5mL 7.3.2.3向病毒对照板(见C.,2)第12列、第A~D行加人50AlCVS-ll病毒(100TCIDm). 7.3.2.4病毒和培养基混匀后,从第2列的AD行吸取50L加人到第3列的AD行,如此连续稀 释至第6列 每稀释一次要更换一次吸头 7.3.2.5弃去最后一排孔中的50LCVS-1l病毒液于0.1%氢氧化钠溶液中 7.3.3病毒与血清的中和 7.3.3.1 病毒的加入 待测血清样品测定板(见C.3),血清对照板(见C.1)内全部各孔均加人7.3.2.2稀释的CVS-1l病毒 50L(100TCIDm) 吸头不应接触液面 加人病毒后以培养板盖盖好 7.3.3.2中和 将上述全部培养板从生物安全柜中取出,置37C温箱中,中和60min(最多不超过90nmin) 7.3.4细胞的加入 7.3.4.1在中和结束前10min,准备BHK-21细胞;弃细胞瓶中的培养基,细胞加人3nml5ml1× ATV覆盖单层细胞,轻轻摇晃数次后,弃消化液 重复洗涤1次 7.3.4.2加人2ml一5ml.1×ATV,置37C消化约5min 震动细胞瓶,使细胞脱落 7.3.4.3加人10mLMEM,取少许于细胞计数板中,用细胞计数器或在镜下对细胞进行计数 7.3.4.4加人MEM,调整细胞密度至4.0×10个/ml 7.3.4.5除培养基对照孔外,在每孔中加人50L细胞悬液 整个操作过程中吸头不应接触液面和孔 壁 加细胞后培养板加盖 7.3.5培养 全部培养板从生物安全柜中取出,置37C5%二氧化碳培养箱中培养48h
GB/T34739一2017 7.3.6细胞固定与荧光抗体染色 7.3.6.1 细胞的固定 7.3.6.1.1将细胞培养板从温箱中转移到级生物安全柜中,弃培养基于0.1%氢氧化钠溶液中 7.3.6.1.2将培养板直接浸人第一个固定液容器内,片刻后取出,将孔中的溶液弃回至固定液中 7.3.6.1.3将培养板浸人第二个固定液容器内,20min45min后,将孔中的溶液弃回至固定液中 细 胞培养板从I级生物安全柜中取出,自然干燥或用吸水纸吸干 7.3.6.2荧光抗体染色 7.3.6.2.1FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白荧光抗体用0.01nmol/LPBS(pH7.4)稀释至工作浓度后， 加到所有检测检测细胞板中,50AL/孔 7.3.6.2.2置37C5%二氧化碳培养箱中温育60min 7.3.6.2.3弃标记抗体于0.1%氢氧化钠溶液中,用0.01mol/1PBS洗2次,倒置培养板于吸水纸上 干燥 结果观察与判定 8 8.1染色结果观察 8.1.1观察顺序 按病毒滴定板、血清对照板待测血清板顺序观察 8.1.2观察结果记录 在荧光显微镜下观察染色情况,观察每孔所有视野,结果为定性判定,以“十"表示1个以上的荧光 细胞,只记录含有荧光颗粒的细胞孔,表示含有未被中和的病毒 无荧光颗粒记的细胞孔为“一” 在见 表C.4、表C.5、表C.6中记录观察结果 8.1.3CVS-11病毒滴度的计算 计数病毒滴定区见C.2,A2~D6区域)内有荧光细胞的孔数N,CVS-1l病毒滴度TCID.)为 4N+2)4 8.1.4血清狂犬病中和抗体效价的计算 将观察结果参数代人下列公式计算待检血清的中和抗体效价(E) (B一Bce)/n E=0.5×(A，/Ae)×3" 式中: 中和抗体效价,单位为IU/mL A 待测血清整列孔均无荧光染色的血清最大稀释倍数; 阳性标准犬血清整列孔均无荧光染色的血清最大稀释倍数; Ae 待测血清在A，稀释度后出现的无荧光染色的孔数; B B 标准血清在A，稀释度后出现的无荧光染色的孔数
GB/34739一2017 8.2检测结果判定 8.2.1判定成立条件 病毒滴定结果的计算值应介于30300之间;细胞对照、培养基对照孔观察结果应全部判定 为“ 8.2.2结果判定 中和效价不低于0.5IU/mL时,判定为该份血清的来源动物具备狂犬病免疫保护能力,否则判定 为无免疫保护能力
GB/T34739?2017 ? A 淶??) ? A.10.01mwl/LpH7.4???(PBs ??85.00g,15.49g,2.03g,??,10L, 2mol/L?pH7.4 A.2?MEM ??MEM920mL,???50mL7.5%??10mL,200mmol/L L-?10mL?(A.3)10ml4C档 ??? MEM??,?ù?100IU/ml,ù?100mg/mL,? -20C档 A.4-??-?(ATV)? ??10ATV??(Gibco)50mL,??450mL,,4?(? ???) A.580% ???,к ??800ml,??1000ml
GB/34739一2017 附录B 规范性附录 狂犬病中和抗体检测操作者个人防护措施 B.1人员免疫 进行狂犬病抗体的操作者应进行狂犬病暴露前免疫,每年进行2次血清狂犬病病毒中和抗体检测， 中和抗体效价应不低于0.5IU/mL B.2实验室条件 操作者所在实验室及使用的检测设备应满足GB19489要求 B.3个人防护 操作时应佩戴口罩、手套,着长袖工作服 B.4操作注意事项及意外处置 应避免锐物刺伤和割伤,发生外伤后,应立即停止实验,以肥皂水冲洗伤口不少于15min,并加强 免疫狂犬病疫苗1剂
GB/T34739一2017 附 录 规范性附录) 检测所需细胞板加样示例及记录表格 C.1参考血清对照板加样示例(见图c.1 27 81 243 729倍 阳性标准犬血清(0.5IUml 阴性标准犬血清 注:每孔加人100lLMEM,50L标准阳性血清加到第1列的AD行孔内,50L阴性血清加到第1列的EH 行孔内 图C.1参考血清对照板加样示例
GB/34739一2017 C.2病毒滴度测定板加样示例(见图C.2) 10 11 12 16 64 256 1024 培养基对照 细胞对照 注在第1列的A~D行孔内加人100lMEM.在第2一6列的A~D行及细胞对照的第1l,12列的AH行孔 内加人150LMEM,在第9,10列的A~H行的培养基对照孔中加人200L的MEM,在第1,2列的A~D行 孔中加人50病毒液(含100TCIDm 图C.2病毒滴度测定板加样示例 c3待测血清样品板加样示例(见图c3) 1/3 1/9 1/27 1/81 1/243 1/729 1/2187 /65611/19683 待测血清" 待测血清2 注:在第19列的AH行孔内加人100ALMEM,在第1列的A~D行孔内加人50L1号待测血清样品,在第 1列的E~H行孔内加人50Al.2号待测血清 图C.3待测血清样品板加样示例
GB/T34739一2017 C.4FAVN检测对照培养板观察记录表格(见表C.1,表C.2) 表c.1参考血清对照板观察记录表 27 稀释倍数 81 243 729 阳性标准 犬血清 (0.5IU/mL 阴性标准 犬血清 表C.2病毒滴度测定板观察记录表 病毒稀释倍数 对照 空白列 16 664 256 2014 培养基对照 细胞对照 10
GB/34739一2017 C.5FAVN检测待测样品板观察记录表格(见表C3 表c.3待测样品板观察记录表 血清稀释倍数 27 81 729 243 2187 6561 19683 注有荧光细胞的孔记录为加号(+),本表可只记录有荧光细胞的孔.