三疣梭子蟹

三疣梭子蟹

国家标准 GB20556一2006 三 疣梭 子 蟹 Swimmingcrab 自2017年3月23日起，本标准转为推荐性 标准，编号改为GB/T20556-2006. 2006-12-01实施 2006-09-29发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 小 国国家标准化管委员会国家标准
根据国家标准公告(2017年第7 号)和强制性标准整合精简结论，本标准自2017 GB20556一2006 年3月23日起，转为推荐性标准，不再强制执行 前 言 本标准的5.1和5.2为强制性条款,其余为推荐性条款 本标准的附录A,附录B为规范性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国水产标准化技术委员会海水养殖分技术委员会归口 本标准起草单位:水产科学研究院黄海水产研究所、海洋大学、山东省渔业技术推广站 本标准主要起草人:张岩、于东祥、陈四清、孔晓瑜、李鲁晶、王春生
GB20556一2006 三 疣 梭子蟹 范围 本标准给出了三疣梭子蟹(PortumustrilubeculatusMiers)的主要形态构造特征、生长与繁殖特征、 生化遗传学特征、分子生物学遗传特征以及检测方法 本标准适用于三犹梭子蟹的种质鉴定和检测 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 全甲宽tullearapacewidth 成体型三疣梭子蟹头胸甲最末两侧棘尖端间的直线距离 甲宽earapacewidth 成体型三犹梭子蟹头胸甲最末两侧棘基部前缘间的直线距离 名称与分类 3.1学名 三疣梭子蟹(PortunusrilubeculatusMiers) 3.2分类位置 甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹属(Portwnus). 分布与生态习性 三犹梭子蟹为暖温性多年生大型蟹类,我国沿海及日本、朝鲜、菲律宾等地均有分布,尤其是在沙泥 质潮间带海滩广阔的内湾水域分布较多,如莱州湾,勒海湾、吕泗,长江口,浙闽沿海及日本的懒户内海 等,这些地方都形成了历史悠久的梭子蟹渔业 梭子蟹白天潜伏海底,夜间出来觅食并有明显的趋光 性 养在池塘中的三胱梭子蟹日出日落时有比较明显的昼夜垂直移动现象 三疣梭子蟹游动时,身体 倾斜倒垂于水中,第5步足频频摆动,作横向或不定向的水平游动 潜人泥砂时,常与池底呈15"一45" 的交角,仅露出眼及触角,三犹梭子蟹无钻洞能力 梭子蟹属于杂食性动物,喜欢摄食贝肉、鲜杂鱼,小杂虾等,也摄食水藻嫩芽,海生动物尸体以及腐 烂的水生植物 而且不同生长阶段,食性有所差异,在幼蟹阶段偏于杂食性,个体愈大愈趋向肉食性 通常白天摄食量少,傍晚和夜间大量摄食 但水温在10C以下和32C以上时,梭子蟹停止摄食 形态特征 5.1外形 头胸甲呈梭形,背面大部为茶绿色,后缘和后侧缘呈紫色,并有灰白色斑点分布,腹面均为灰白色; 整足发达,长节呈棱桂形,内缘具钝齿,整足背面紫色,具灰白色斑点;前3对步足蓝色,指节紫色 第4 对步足掌节和指节扁平,宽薄;背面除指节外具灰白色斑点;腹部扁平,雄蟹腹部呈三角形,雌蟹呈圆形 三犹梭子蟹的外部形态见图1.
GB20556一2006 图1三疣梭子蟹外形 5.2可数性状 5.2.1头胸甲表面有3个显著的状隆起,1个在胃区,2个在心区 5. .2.2头胸甲两前侧缘各具9个锯状齿,第9齿特别长大 5.2.3额缘具2枚~6枚小齿,一般4枚;前侧缘斜拱形,长于后侧缘 5.2.4额部两侧有1对能转动的带柄复眼 5.2.5胸足5对 5.3可量性状 成体型三疣梭子蟹的甲宽与全甲宽的关系见式(1),式(2) 雄蟹:w=0.0801×L一0.120 雌蟹w=0.0793×L一0.029 式中 w -甲宽,单位为毫米(mm); 全甲宽,单位为毫米(t mm 生长与繁殖 6.1生长 6.1.1生长 三疣梭子蟹幼蟹以后每次蜕皮的体重增长如图2所示,每蜕皮一次约增重2.8倍 在越年(两年y 养成中,经过2次一3次蜕皮,甲宽达18cm以上,体重最大可超过1kg 250 ×为蚁皮 200 150 100 50 40 60 80 100120 经过天数天 图2三疣梭子蟹的生长
GB20556一2006 6.1.2不同蜕皮龄期与全甲宽及湿重的关系 不同蜕皮龄期与全甲宽及湿重的关系见表1 表1三疣梭子蟹不同蜕皮龄期与全甲宽及湿重的关系 湿重 全甲宽 湿重 全甲宽 蚁蜕皮龄期 蜕皮龄期 mmm mmm C 4.00 C9 53.50 8.50 C2 6.30 C10 68,50 18.00 C3 C11 45.00 7.30 90.00 C 12.00 C12 110.00 90.00 (C5 13 16.50 133.00 155.00 C6 21.50 C14 155.00 235.00 (C7 30.00 1.5 C15 180.00 355.00 40,5o C16 500,00 C8 203.00 3.7 注c为幼蟹或成体蟹.c1为1蜕皮龄蟹,其他类推 6.1.3全甲宽与体重(湿重)的关系 三疣梭子蟹全甲宽与体重湿重)关系式以式(3)表示 w=0.0588L 3 式中 w体重(湿重),单位为克(g) 全甲宽,单位为厘米(G L cm 6.2繁殖 6.2.1性成熟年龄 三疣梭子蟹雌雄异体 雌性和雄性个体,均在其成体型的第12龄期或第13龄期达到性成熟 6.2.2生物学最小型 野生三犹梭子蟹雌,雄蟹的生物学最小型均为全甲宽13 m 6.2. 性腺发育周期 雄蟹在当年秋季性腺发育成熟,并与雌蟹交尾,雌蟹性腺从当年的秋季开始发育,到第二年的春季 发育成熟产卵 三犹梭子蟹进行多次产卵,一般产卵两次,大型雌蟹可连续产卵3次一4次,个别可达 5次 春季孵化出的幼蟹生长速度很快,当年体重长到150g左右即可达到性成熟,成为补充群体 冬 眠后的雌蟹来年产卵后,可继续蜕壳生长,第三年还可产卵繁殖 雄蟹在第二年越冬洞游前大量死亡 6.2.4产卵量 三疣梭子蟹一次产卵的数量,同亲蟹的大小大体成正比,为80×10'粒一450×10'粒,同一雌蟹的 抱卵数,第二批和第三批次均小于第一批次,例如,全甲宽为20cmm的雌蟹,至产出第三批次的年产卵 量,约为600×10'粒一660×10'粒(见图3)
GB20556一2006 400 300 200 100 2D 1618 全甲宽/emn 图3三疣梭子蟹的抱卵量 6.2.5繁殖水温 在勒海,7月是越年蟹交配的盛期,春夏之交是梭子蟹的繁殖季节,三梭子蟹的产卵活动集中分 布于沿海河口附近 4月下旬底层水温升至14C一26C时开始产卵,在我国沿海产卵期由南向北向后 推移 生化遗传学特征 主要同工酶的谱型 三犹梭子蟹肌肉中超氧化物歧化酶(sOD),磷酸葡萄糖变位酶(PGM),腺苷酸激酶(AK)同工酶的 电泳图谱分别见图4、图5和图6. 图 三疣梭子蟹soD电泳图谱(单态) 图5 三疣梭子蟹PGM电泳图谱多态) 图6三疣梭子蟹AK电泳图谱(多态 7.2生化遗传特征 采用水平淀粉凝胶电泳技术,对40个三疣梭子蟹进行了同工酶分析 在11种同工酶中共检测到 了23个基因位点 根据Pn多态位点判别标准,多态位点比例为14.7%;根据标准计算,平均杂合度 观察值(H,)为0.086士0.018;平均杂合度期望值为(H.)0.103土0.01l;平均有效等位基因数(N.)为 1.375士0.117
GB20556一2006 分子遗传学特征 采用PCR技术,分子克隆技术及DNA序列测定技术,对三梭子蟹的线粒体16SrRNA(核糖体 6SrRNA)基因片段进行了PCR扩增(引物序列见“检测方法”)和序列测定,获得了长度为566bp的 核昔酸序列 16SrRNA基因片段序列 CCGGTcC'TGAA cTCAGATcAC GTAAAAAATT AAAGGTcGAA CAGAccTTcT TATATAGCTG 61 cTGcAcTATA AAGAcATTTT AATTcAAcATcGAGGTcGcA AAcTTATTc TTGATAAGGA cccTTTcAGG 121 CTCTCAGAAT AAGTAACTTG ATCTTT'TAAT TTATTAATAA TTTTCTTTAT GACAAAAACA ATTGTAATAC TTTCTAGCAG 181GATCAACTAN GTTGC(C('(AA TTTCAAAAGA 241TTATACC'TTTT CCCAATAAAT TTATCATTATTAAAAAAATAN 301TATAAAATT" C'TAAATTTAT AAAG;CTTTAT AG;GG;Tc'TTAT CG;TcCCcTCTA AAATATCTAA 361GcCTTTTcAc TTAGAAGTTAAATTcAATTTTAATGAAAGA GACAGcTTTT TcTTTGTccA 421AccATTcATA cAAGTTTTcA ATTAAAAAA TAATGATTAT GCTAcCTTTG CACGGTCAAG 481ATAccGcGGc TTTTTATcAGGAGcAGGcT AGAcTATAAA TAcccTcTAA TATTTAATAA TTTGATAAAC AAGGCG 541TAGACATGTT 检测方法 9.1繁殖力的测定 用天平或杆秤称产卵前、后雌蟹的质量,前后两次称量之差即为产卵的质量 用电子天平称刚产出 的卵1.0g,在解剖镜下计数,平行两次,平均值为卵密度(粒/g) 产卵量按式(4)计算 G= m一m(n/2m样1十n/2m样2 式中 产卵量,单位为粒; 产卵前亲蟹质量,单位为克(g); m 产卵后亲蟹质量,单位为克(g); m 试样1的卵粒数,单位为粒; 试样1质量,单位为克(g) 7样1 试样2的卵粒数,单位为粒 1 试样1质量,单位为克(e) m样2 9.2生化遗传学特征的测定 样品处理测定 样本活体低温保存带回实验室 活体解剂取样后,密封放人超低温冰箱(-70c)或液氨罐中贮存 将部分组织(约0.5g)取出放人玻璃匀浆器中,加人1;1体积比质量)的0.1mol/1 磷酸缓冲液 pHH7.0),0.1mol/L磷酸缓冲液的配置见附录A 冰水浴中匀浆后,倒人1.5mlL离心管内,4C冰箱 r/min离心l0min 中抽提0.5h~1h,然后在04C冷冻离心机中14000r 1,离心后的上清液作为电 泳样品 9.2.2电泳分析 采用水平淀粉凝胶电泳方法,凝胶浓度为12%,TC制胶缓冲液见附录A 电泳缓冲系统为TC电 极缓冲液(pH7.0),TC电极缓冲液的配置见附录A,恒流(电流大小为12mA)电泳12h 电泳过程在 4C冰箱中进行 凝胶厚度为6mm,电泳后切成4片一5片,分别进行各种酶的染色,染色过程在37C 恒温箱中进行,同工酶染色液的配制见附录B. 9.2.3数据处理 数据处理见式(5,式(6),式(7)和式(8)
GB20556一2006 多态位点比例(P)=(多态位点数/所测位点总数)×100% 5 平均杂合度观察值(H,=多态位点杂合度观察值之和/观察位点总和 6 平均杂合度期望值(H=多态位点杂合度期望值之和/观察位点总和 平均有效等位基因数(N,)= (其中N =1一H >(N.)" 9.3分子遗传学特征的测定 9.3.1DNA提取 取肌肉组织,尽量剪碎,用DNA提取试剂盒或常规酚方法提取基因组DNA,TE溶解后一20C保 存备用,TE溶液的配置见附录A .3.2PCR扩增 9. l6SrRNA引物16sAR/BR)序列为 5'-GCCTGTTTATCAAAAACAT-3'(16sAR) 5'-CcGGTCTGAACTCAGATCACGT-3'16sBR 25l.PCR扩增反应体积内含;2.0mmol/LMg(Cl,0.2mmol/L.每种dNTP,0.2pmol/几每种引 物,lL.DNA模板,lUTaq酶及1×缓冲液 PCR反应程序为;94C预变性2"m min;94C45s,50C1min,72C1min,循环35次;最后72C延伸 5 min rPCR产物1.4%琼脂糖凝胶电泳,EB染色.凝胶成像系统观察、照相 cR产物克隆 9.3.3 RCR产物经回收纯化后,连接到丁载体上 连接反应体积10L,其中载体1AL.连接酶I5AL CR产物4L，18C连接1h或4C过夜,然后连接液转化感受态大肠杆菌,涂平板,蓝-白斑贿选阳性 克隆,液体培养基培养,提纯质粒后用EcoRI和Hhind酶切检测有无插人片段 9.3.4序列测定 对回收质粒进行测序反应,产物纯化后在DNA测序仪上测序;为保证测序的可靠性和准确性,采 用双向测序,并进行人工核对、校正 0判定规则 检测结果不符合5.1和5.2要求的,则判定为不合格项;有不合格项的样品为不合格样品
GB20556?2006 ? A 淶?? ? A.10.1mol/??(pl7.0 0.01mol/L?57.7mL,0.01mol/?42.3mL,?1000mL pHH7.0 A.2Ic?? ??3.028g,pH7.0,??1L A.3TC缫? ??42.65g,pH7.0,?10L A.4TE?(p8.0) 10mmol/LTri-HCl(pH8.0),lmmol/LEDTA(pH8.0).
GB20556?2006 ? B (淶??) ????? B.1???????? B.1????? ?? ?д ? ? Tris-HCI 0.2mol/L,pH8.5 15ml MrT(± 0.5% 0,5ml Suprroxidedesmutase 绯? (S(OD) 0.5% PMS (?Ρ 0.5ml 1.0% ? 10ml 0.2mol/L,pH8,0 15mL Tris-HCI NADP? 0.25% 0.5ml MgC 1.0mol/I 0.1ml G6PD 6 6-? Phosphoglucoutase λ? P(GM Glucose-l-phosphate 13mg 1- MTT 0.5% 0.5mL PMS (?) 0.5% 0.5ml ? l.0% 10ml 0.2mol/LpH8.0 15ml Tris-HCI NADP(?I 0.25% 0,5ml MgC 1.0ol/L 00.25mL g~0.2g ADP? 14mg?20mg ? AdenylateKinase G6PD ? AK 12u 6-? ? 1.5mg?3mg MTT(? 0.5% 0.5ml 0.5ml PMS(? 0.5% ? 1.0% 10ml