国家标准 GB/T15805.5一2018 代替GB/T15805.52008 鲤春病毒血症诊断规程 Protoeolofdiagnsisforspringviraemiaofearp 2018-12-28发布 2019-07-01实施国家市场监督管理总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB;/T15805.5一2018 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准代替GB/T15805.5一2008《鱼类检疫方法第5部分;鲤春病毒血症病毒(sVvCV)》与 GB/T15805.5一2008相比,除编辑性修改外,主要技术变化如下 -增加了缩略语; -增加了酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)检测鲤春病毒血症 viraemiaofcarpvirus, 病毒(spring ,SVCV)抗原的方法; 增加了间接免疫荧光抗体试验(indirect iimmunofluorescentantibodytest,IFAT)检测sVCV 抗原的方法; -增加了实时定量PCR(real-timePCR)检测sVCV核酸的方法; -增加了鲤春病毒血症(sp 1ofcarp.svC)的综合判定 DrIngVIraemia 请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业农村部提出本标准由全国水产标准化技术委员会(SAc/Tc156)归口本标准起草单位;宁波市海洋与渔业研究院、全国水产技术推广总站、北京海关、中华人民共和国蛇口海关本标准主要起草人;王建平、张利峰、江育林、徐胜威、高隆英、吴雄飞、陈爱平、沈伟良本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T15805.1一1995; GB/T15805.52008
GB;/T15805.5一2018 鲤春病毒血症诊断规程范围本标准规定了鲤春病毒血症的采样、病毒分离培养,RT-PCR,实时定量RT-PCR,酶联免疫吸附试验,间接免疫荧光抗体试验、综合判定的方法本标准适用于鲤春病毒血症的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范缩略语下列缩略语适用于本文件 cellline CO:草鱼卵巢细胞系(grasscarpovary CPE;细胞病变效应(eytopathiceffeet EB;溴化乙锭(ethidiumbromide) enzyme-linkedimmunosorbentassay ELISA;酶联免疫吸附试验(e EPC鲤上皮瘤细胞系(epithelo cellline )mmapapulosumcyprini FCS;胎牛血清(fetalcalfserum monnowcellline FHM胖头鳞肌肉细胞系(fathead luoresceinisothiocyanate FITC;异硫氮酸荧光素(lu G蛋白;糖蛋白(glyeoprotein) immunofluorescentantibodytest) IFAT:间接免疫荧光抗体试验(indirect polymerasechainrceaction) RT-PCR;逆转录-聚合酶链式反应(r reVersetranscription sVC;鲤春病毒血症(springviraemiaofc carp sVCV;鲤春病毒血症病毒(springviraemiaofcarpirus) 试剂和材料 4.1水;符合GB/T6682中一级水的规格;核酸抽提和RT-PCR应使用无RNA酶的去离子水 4.2sVCV参考株;由农业农村部相关部门指定单位提供 4.3鱼类细胞系:EP(CFHMcO. 4.4鱼类细胞生长液;用Earle's平衡盐的M199培养基配制,另加10%胎牛血清(FCS) 4.5鱼类细胞维持液;用Earle's平衡盐的M199培养基配制,另加2%FCS. 4.6细胞消化液:见附录A中A.1
GB/T15805.5一2018 4.7HEPES(N-2-胫乙基哌嗓-N'-2-乙磺酸) 4.8逆转录酶AMV:一20C保存,避免反复冻融或温度剧烈变化 4.9RNA酶抑制剂(RNasin或RNaseInhibitor :一20C保存,避免反复冻融或温度剧烈变化 4.10RT-PCR逆转录酶浓缩缓冲液、Taq酶用浓缩缓冲液;分别见A.2,A.3 /L 4.11Mg(Cl;25mmol 4.12dNTP:含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10" mmol/L,-20C保存 4.13Ta酶一20C保存,避免反复冻融或温度剧烈变化 4.14无水乙醇;分析纯,使用前预冷到-20C 4.15DNAMarker2000 4.16琼脂糖 4.17TBE电泳缓冲液见A.4 4.18引物和探针:参照OIE《水生动物疾病诊断手册》2016年版,sVCV糖蛋白(G蛋白)基因片段(参见附录B)及SN/T1l52 RT-PCR和实时定量RTPCR检测sVCV的引物和探针如下 CR扩增svCVG蛋白714p片段的引物,嵌套CR扩增606p片段的引物使用时浓度 a 为40"mol/L 引物按以下序列合成: RT-PCR引物正向引物F1:5'-TcT-TGG-AGcCAA-ATA-GcT-CAR-RTc-3'; 反向引物R25'-AGA-TGG-TAT-GGA-CCcCAA-TAC-ATHACN-CAY-3' 嵌套PCR引物正向引物F1:5'-TcT-TGG-AGCcCAA-ATA-GcT-CAR-RTC-3'; 反向引物R4:5'-CTG-GGG-TTT-CCN-CCT-CAA-AGY-TGY-3' 实时定量RT-PCR检测svcV的引物和探针,按以下序列合成 b 引物391ul:5'-ATc-ATT-CAA-AGG-ATT-GCA-TcA-G-3' 引物391rl:5'-CAT-ATGGcTcTA-AAT-GAA-CAGAA-3'; 探针;5'-(FAM)-TccC-CcCC-TCA-AAGTTGCG(G-ATG-G(TAMRA)-3' 4.19包被稀释液;pH9.6,0.02mol/L的碳酸盐缓冲液(见A.5). 4.20羊抗svCV免疫球蛋白(Ig);由农业农村部有关部门指定机构提供,并经过实验确认 4.21鼠抗sVcV的单克隆抗体;由农业农村部有关部门指定机构提供,并经过实验确认 4.22辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠抗体 4.23封闭液;1%明胶(用包被液配制 4.24终止液;2mol/L的硫酸 4.25异硫汛酸荧光素(FITC)标记的抗鼠抗体 4.26样品缓冲液:见A.6 器材和设备 5.1倒置显微镜 5.2生化培养箱 5.3普通冰箱和超低温冰箱 5.4组织研磨器 5.5冷冻离心机和离心管
GB;/T15805.5一2018 5.6PCR仪、荧光PCR仪 5.7电泳仪 5.8微量移液器 5.9紫外透射仪或凝胶成像仪 5.10高压灭菌钢 5.11微波炉 5.12水浴锅 5.13制冰机 5.14磁力搅拌器 5.15过滤系统 5.16酶标仪和洗板机 5.1724孔、96孔细胞培养板,细胞培养瓶临床症状参见附录C 采样 7.1采样对象根据SVCV宿主易感性,优先采集鲤;次选杂交鲤如鲤和卿的杂交品种)和鲫、金鱼、草鱼、鳞、雏等其他鲤科鱼类,最后是易感的非鲤科鱼类 7.2采样水温与数量采样应在水温低于22C进行,采样数量应符合sC/T7103的要求 7.3样品采集体长<4cm的鱼去头和尾后取整条鱼;体长为4cm一6cm的鱼,取内脏包括肾);体长>6cm的鱼则取脑、肝、肾和脾,各器官、组织大致等量收集病毒分离和鉴定 8.1病毒分离培养 8.1.1样品处理最多5尾鱼为1个样品,样品匀浆,用含有1000IU/mL青霉素和10004g/mL链霉索的鱼细胞生长液1:10稀释,混匀悬浮于15C下孵育2h一4h或4C下孵育6h24h 7000r/min,4C离心15min,收集上清液 8.1.2病毒分离将1:10的组织匀浆上清液再做两次10倍稀释,将1:10、1:100和1:1000三个稀释度的上清液接种到生长约24内的EPC或者cO或者FHM细胞中,每稀释度接种2孔,每2em'最多接种 00AL 接种后的细胞板置于20C士2C培养7d 接种的细胞板需设2孔阳性对照(接种SvCV参
GB/T15805.5一2018 考株的细胞)和2孔空白对照(未接种病毒的细胞. 阳性对照和待测样品都接种细胞后,7d内每天用40倍~100倍倒置显微镜检查空白对照细胞应正常,阳性对照细胞应出现CPE 如接种被检匀浆上清稀释液的细胞在培养中出现CPE,立即进行 sVCV的鉴定在培养7d后如无CPE出现应进行盲传盲传时,将接种了组织匀浆上清稀释液的单层细胞培养物冻融1次,以7000r/nmin,4C离心15min,收集上清液,将上清液接种于24h内新鲜培养的单层细胞中,再培养7d 每天用40倍~100倍倒置显微镜检查如果阳性对照也未出现CPE,则应换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行病毒分离 8.1.3结果判定在空白对照细胞正常,阳性对照细胞出现CPE的情况下,样品接种细胞并盲传后均无CPE出现判为阴性;如有CPE出现,需要RT-PCR反应或者实时定量RT-PCR或者ELIsA或者IFAT方法进行SVCV鉴定 8.2RT-PCR 8.2.1RNA提取 8.2.1.1 样品处理将450AL细胞悬液放人1.5mL的离心管,再加人450ALcTAB(HexadeylTimethyAmmoni um Bromide)溶液(见A.8)并混匀 25笔作用2h2.5h 8.2.1.2RNA抽提在含有样品的离心管中加人600L抽提液I见A.9)，用力混合至少30s 12000r/min离心 5 nmin,小心取上层水相(约800AL) 再加人700L抽提液I见A.10)，用力混合至少30s 12000r/min离心5min,小心取上层水相(约600AL) 再加人一20C预冷的1.5倍体积的无水乙醉 (约900L),倒置数次混匀后，一20C冷冻8h以上沉淀核酸 12000r/min离心30min,小心弃去上清干燥后加1lAL水溶解,用作RT-PCR模板也可以采用等效商品化的RNA抽提试剂盒 8.2.2RT-PCR扩增 8.2.2.1eDNA合成在PCR管中,加人10L模板、2.5L反向引物R2(40pmol/L),2.5L.水,使总体积为15L 70C反应5min 立即冰浴,低速离心约5s,使液体集中在底部在上述反应管中继续加人5AL逆转录酶缓冲液(5倍浓缩液),2L.dNTP(10mmol/L),0.5AL.RNA酶抑制剂(20U)、1ALAMV逆转录酶(10U/L)和1.5L水,总体积25L 42C反应60min以合成模板的cDNA 同时设立阳性对照,阴性对照,以及DEPC处理的水为模板的空白对照 8.2.2.2DNA扩增在上逃反应管中再继续加人&儿LHq腾浓缩缓冲戒(0信浓缩液)入.s儿飘化镇溶液(c5nmlL 2ALdNTP(10mmol/L)、2pL正向引物F1(40Mmol/L)、2AL反向引物R2(40mol/L),0.5pLTae 酶(10U/AL),加水到总体积为l00lL 如CR仪没有热盖,每管还需加人50AL矿物油混匀后短时间低速离心让试剂集中在底部再将反应管置于PCR扩增仪设置PCR反应程序为94C预变性 94C变性1min,55退火1min,72C延伸lmin,30次循环,72C延伸8min,最后4C保温
GB;/T15805.5一2018 8.2.3琼脂糖电泳将TBE电泳缓冲液稀释10倍,制备1.5%的琼脂糖凝胶(含1g/mEB,见A.11) 将凝胶板放人水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面,将6从L.PCR扩增产物和2AL样品缓冲液混匀后加人样品孔在电泳时设立DNAMarker2000作对照 5V/emm电泳0.5h,当澳酚蓝到达底部时停止,在紫外透射仪或凝胶成像仪下观察 8.2.4嵌套式CR 扩增后无DNA带的,直接取PCR产物作为模板;扩增后有DNA带的,将PCR产物按1:1000稀释后,作为模板在PCR管中加人10LTaq酶浓缩缓冲液(10倍浓缩液),10ML氯化镁溶液(25mmol/L),2l 小NTP(10mmol/L)2.5L正向引物F1(40mmol/L)2.5L反向引物R4(40pmol/L),0.5l Taq酶(10U/AL),5"L 模板DNA,加水到总体积为100L 如PCR仪没有热盖,每管还需加人 50L矿物油混匀后短时间低速离心让试剂集中在底部再将反应管置于PCR仪设置PCR反应程序为94预变性,94C变性1min,55退火1min 1,72C延伸1 1,30个循环,72C延伸8 min， mln，最后4C保温 8.2.5结果判定在阴性对照和空白对照嵌套式PCR中均无扩增出DNA片段,阳性对照第一次扩增出现714bp片段、嵌套式PCR扩增出现606bp片段情况下,待测样品第一次RT-PCR扩增出714bpDNA片段、或嵌套PCR后扩增出606bpDNA片段,并经测序验证为svCVG蛋白片段序列,结果判定为阳性无扩增片段或扩增片段大小不是714bp或606p的均判为PCR阴性 8.3实时定量RT-CR 8.3.1样品处理及RNA的抽提方法同8.2.1 8.3.2扩增试剂准备在反应混合物配制区进行每个反应体系为;RT-PCR逆转录酶浓缩缓冲液(5倍浓缩液)5AL,MgCl,25mmol/L2.2L dNTP(10mmol/L)0.5AL、引物391ul(10Amol /L0.5AL、引物391rl(10Amol/L)0.5LSVC 探针(10mol/L)0.25AL模板RNA10AL、MLVv(200U/L)0.5AlLRNA酶抑制剂(400U/AL 0.25AL、Taq酶(5U/L)0.25AL,补DEPC水至25L 每个反应体系设置平行反应,按8.2.2.1要求设立对照也可采用荧光定量RT-PCR商品试剂盒 8.3.3加样根据检测样品的数量计算好各试剂的使用量,加人到适当体积试管中,充分混匀,向每个实时定量 RT-PCR管中各分装154L,转移至样本处理区在各设定的实时定量RT-PCR管中分别加人8.2.1.2中制备的RNA提取液各10AL,500r/min 离心30s、 8.3.4检测在检测区进行
GB/T15805.5一2018 将8.3.3中离心后的PCR管放人荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序反应条件设置为;42C 反转录30min;92C预变性3min;92C变性10s,60C退火延伸30s,40个循环在60C时收集荧光检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果 8.3.5结果判定 8.3.5.1结果分析条件设定直接读取检测结果阂值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阂值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准 8.3.5.2质控阴性对照Ct值>30,并且无扩增曲线阳性对照的Ct值应<30,并出现典型的扩增曲线,否则,此次实验视为无效 8.3.5.3判定 C值>30或者无扩增曲线为阴性;C值<30,且出现典型的扩增曲线为阳性;Ct值>30且Ct值 35的样本应重做重做结果c值仍然大于0为阴性,否则为阳性 8.4酶联免疫吸附试验 8.4.1用0.02mol/L的碳酸盐缓冲液(pH9.6)按说明书要求稀释纯化的羊抗SVCV免疫球蛋白(Ig 100AL/孔),包被96孔酶标板 8.4.2包被后的酶标板4C孵育过夜用含0.05%吐温20的0.01mol/LPBsT(见A.12)洗3次 8.4.3 8.4.4用5%脱脂牛奶(用碳酸盐缓冲液配制)或其他封闭液在37C封闭1h(200"L/孔;再用PBST 洗3次 8.4.5每孔加人100L经2倍或4倍系列稀释的待检病毒、未感染的细胞悬液(阴性对照)和SVCV 病毒悬液(阳性对照)及PBST(空白对照),于37C下和包被的抗SvCV抗体反应1.5h;再用PBST洗 3次 8.4.6每孔加100l用细胞培养液稀释到工作浓度的鼠抗SVCV的单克隆抗体 37孵育1.5h;用 PBST洗2次 8.4.7每孔加100l.0.1%的H,O.(用双蒸水稀释) 37C反应15min以除掉非特异性的过氧化物酶去除孔内液体,用PBST洗2次 8.4.8每孔加人100AL用细胞培养液稀释到工作浓度的辣根过氧化物酶标抗鼠抗体lgG(酶标二抗) 37C反应1.5h 8.4.9TMB溶液(见A.13)每孔加人100AL 室温下避光观察,当阳性对照出现明显蓝色,阴性对照即将出现蓝色时加人终止液,每孔150l,并立即用酶标仪测量各孔在波长450nm时的光吸收值(OD 值 8.4.10结果判定以空白对照的光吸收值调零,测量各孔的光吸收值先计算阳性对照和阴性对照的 OD值之比即P/N值) 如果P/N>2.1,表明对照成立再计算待测样品孔和阴性对照孔的P/N 值当P/N>2.1时判为阳性 8.5间接免疫荧光抗体试验 8.5.1在2cm'的塑料细胞培养板中或盖玻片上制备单层EPC细胞或FHM细胞或CO细胞,25C孵
GB;/T15805.5一2018 育至长满80%单层细胞 8.5.2在传人细胞的24h内,当用作感染的细胞单层准备好后,直接将10倍稀释的待鉴定的病毒悬液接种到细胞培养孔每个待鉴定的病毒分离物接种6孔,阳性对照2个、阴性对照2个其中阳性对照病毒滴度要达到5000PFU/ml10000PFU/ml 8.5.3在20C士2培养24h 8.5.4孵育结束后,吸出细胞培养液,立即用0.01mol/LpH7.2的PHBS(见A.l4)漂洗1次,然后用冷的固定液(见A.15)快速漂洗3次 8.5.5每2cm'细胞单层用0.5ml固定液固定15" min 8.5.6 使细胞单层在空气中干燥至少30 ,立即继续下步实验或置于一20C保存 m1n 8.5.7将单层细胞用含有0.05%吐温20的PBST浸洗4次用PBST配制5%的脱脂牛奶或1%的小牛血清白蛋白37C下处理30min n进行封闭 8.5.8 用PBST浸洗4次,每次5min 每次浸洗时,可以将载玻片或塑料材质的细胞板做轻微的摇动 8.5.9用含有0.05%吐温80的PBST把鼠抗sVCV的单克隆抗体稀释到工作浓度 8.5.10加人抗体溶液,每2cm孔加0.25mL 将加人抗体的细胞单层在37C湿盒内反应1h;再用 PBST洗4次将FITC标记的抗鼠抗体按照供应商的操作说明稀释到工作浓度,每2cm'孔加0.25ml 在 8.5.11 c下反应1h;再用T缓冲液襟洗4次 37 立即观察,或用pH8.的甘油生理盐水封片或其他商品化的封片剂封片 8.5.12 8.5.13荧光显微镜观察,人射紫外光490nm一495nm,选用520nm一530nm的绿色滤光片(使用 10倍目镜,20倍或40倍的物镜、数值孔径分别>0.65和>1.3) 在观察前首先要观察阳性对照和阴性对照 8.5.14结果判定;在阳性对照出现特异的黄绿色荧光点,阴性对照无黄绿色荧光点或仅有微弱绿色背景的情况下,待检样品在细胞质上有特异的黄绿色荧光点,判定为阳性;只有微弱的绿色背景,判定为阴性综合判定 9.1疑似病例的判定鱼体有临床症状,或组织中出现典型的病理学特征,或在分离培养中出现典型的CPE,则判定为疑似病例 9.2确诊病例判定符合9.1疑似病例的判定,且细胞培养出现CPE后,用RT-PCR,实时定量RT-PCR、酶联免疫吸附试验,间接免疫荧光抗体试验中的任何一种方法检测为阳性时,则可判定为确诊病例
GB/T15805.5一2018 附录 A 规范性附录) 试剂及其配置本附录中所有化学试剂,除特别注明外,全部为分析纯试剂细胞消化液 A.1 在10L灭菌的去离子水中,顺序加人NaCl80g、KCl2g、KHPO1g、Na.HPO12H.O 3g,EDTA2g,胰酶6g,NaHcO4g~6g使pH为7.48.0 完全溶解后过滤除菌,分装，一20C 保存 A.2逆转录酶缓冲液(5倍浓缩液含Tris-HCl(pH=8.3)250mmol/儿LKCl250mmol/LMg(Cl 50mmol/LDTT50mmol/儿L A.3Iaq酶缓冲液(10倍浓缩液含 Tris-HClpH8.8)500 nmmol/LKCl500mmol/LTritonX-10010g/儿L A.4TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液在1000mL水中,分别加人Tris54g、碉酸27.5g、EDTA2.922g,用5mol/的HCl调到pH一 8.0 A.5包被稀释液(pH9.6》在1000mL.水中,分别加人Na.co1.59g,NaHco2.93g,充分搅拌完全溶解后,4C保存 A.6样品缓冲液每100mL水溶液中含:祺酚兰0.25g,蔗糖40g A.7氯化镁溶液 25mmol/L氯化镁 A.8CTAB溶液其中含CTAB2%,NaCl1.4mol/儿L,EDTA20mmol/L,Tris-HClpH7.5)20mmol/儿L 配制方法是在60mL水中顺序加人NaCl8.19g、EDTA0.744g,Tris1.21g、浓HCcl0.25mL~0.3mL,使 pH7.5~8.0,再加人CTAB2g,完全溶解后加水到100mL CTAB溶液使用前加筑基乙醇至终浓度
GB;/T15805.5一2018 为0.25% 抽提液I 异戊醇,三氯甲烧、饱和酚分别按1;24;25的比例混合,密闭避光保存 A.10抽提液I 异戊醇与三氯甲婉按1:24的比例混合,密闭避光保存 A.11EB溶液用去离子水配制成10mug/ml的浓缩液用时每10mL电泳液或琼脂中加1AL A.12PBSTpH7.4 在1000mL水中,分别加人NaC8g,Kcl0.2g.KH.PO,0.2g.NaIHPO,.12H.02.9g 、吐温20 0.05mL,摇匀后,4C保存 A.13IMIB四甲基联苯胺)使用液在10ml底物稀释液(见A.l6)中依次加人2n m说/mlTMB(使用无水乙醉溶解)0.5ml.0,75% H.O32.0Al. A.140.01mol/L.Ps(pH7.2~7.4 在1000mL水中,分别加人NaCl8g、Kcl0.2g,KH,PO.0.2g,NaHPo12H.,02.9g,充分搅拌完全溶解后,4C保存 A.15固定液将丙酬与无水乙醇以3;7(体积比)混合的溶液 A.16底物稀释液(pH5.5磷酸盐柠檬酸在50ml蒸水中加人0.2nmol/L.NaHPo,(28.4g/L)25.7mL.0.1mol/儿柠檬酸(19.2g/L) 24.3ml
GB/T15805.5一2018 录附 B 资料性附录) SvcVG蛋白片段下列为sVcVG蛋白基因片段序列,其中带下划的基因片段为RT-PCR扩增引物,阴影处为荧光 PCR的引物和探针 aacagacatcatgtctatcatcagctacatcgcattccttttgctaattgactccaactt 6 aggaatcccc catctggtcgaaatatatcatggcagcctgtgattcagcc 121atttgattatcaatgtccaatccatggaaacctacccaac acgatgggtttgagtgccac 181caaattgacaataaaatctccatctgtatt gatggatct 30lccacagtatt 36 gcatcaggg cacaacggtg eeaHLaL2L992OL2t tggaggacattggatcgatcacgaatttaa a9 29a aatcactcta aatgaaaggg 60lacatatagaggaagttgaaggaattatgtacgggaatgtt 66 gctaacaactttattatagatagacatcacagagtatac gatgaaattctgtaataaagatggtataaaattcgcgagaggagactggg agcCggaacattaacaacgattcatgacaatgtgcctaaa ctccggtcaccgccccggattagacttgattgacacagtc aaaatgtag 901ggaatatactttgtgtgaagggactaaaaggaaaatcaataaacaagagaagctgacatG 961 agtggatttgagctatttggctccaagaatcggagggttcggatcagtatttagagtgag 注:引物SVCVR2的碱基位置275304;引物SVCR4的碱基位置383406;引物sVCF1的碱基位置965988; 荧光RT-PCR上游引物的碱基位置347一368;荧光RT-PCR探针的碱基位置391一412;荧光RT-PCR下游引物的碱基位置459~482 0
GB;/T15805.5一2018 录附 C 资料性附录鲤春病毒血症(SvC) 疾病描述 C.1 鲤春病毒血症(SsVC)是由弹状病毒科水泡性病毒属的暂定种鲤春病毒血症病毒(SVCV)感染鱼类引起的急性、出血性疾病该病具较高的传染性、致死率病鱼以全身出血及腹水为特征该病通常于春季低水温期暴发并引起幼鱼和成鱼死亡为此被视为寒冷地区的一种地方性疾病(endemieincool region) 鲤春病毒血症最早流行于欧洲、中东和俄罗斯,近年来传播到美洲和亚洲世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报的疫病种类,为我国一类动物疫病 C.2 宿主有记录的自然发生sVC感染的宿主有鲤Cyprin inuscarpiocarpio、锦鲤Cypr iuus carpiokoi.欧洲鲫arassiuscarassiu4s、 ,六须射silwrwsglanis,鲑Hypophhalmichhymolitrir,躺Aritichhys" o Leuciscusidus,丁鲷Tinca bilis,草鱼Cenopharymgodoidella,金鱼Carassiusauratus ,圆腹雅罗鱼Le ti7nca 通过浸浴实验能感染SVCV的鲤科鱼类有拟鲤Rutilwsrutilus和斑马鱼Daniorerio 在实验条件下也可被传染的鱼类有北方梭子鱼 Eso.rlucius，虹朗Lebistesreticulatus，太阳鱼Lepomis Eibwu等所有年龄组的鱼都可被感染,通常1龄以下的幼鱼最易感根据易感性排序,鲤为svcV最易感宿主,其次是杂交鲤(如鲤和娜的杂交品种)和鲫,金鱼、草鱼、躺、鲑等其他鲤科鱼类,最后是易感的非鲤科鱼类流行水温 sVcV通常于春季暴发并引起幼鱼和成鱼死亡,通常在水温8C一22C,尤其是在11C17C时流行在水温17C以上,1龄或更大规格的鱼感染后无明显的症状,不易被察觉鱼苗在22C一23C 时也能够被感染 C.4临床症状病鱼有体色变黑,眼球突出,飓灰白,体表、鳍基部和泄殖腔出血,腹部膨大,泄殖腔突出,拖曳粪便等症状 C.5组织病理腹腔中有过量的含有血液的腹水,腮丝变性和肠炎,黏液充满了肠道脏器组织通常会发现有水肿和出血肌肉,脂肪和缥上能看到出血点在所有的主要器官上能够发现组织病变在肝,血管中能观察到进行性的水肿坏死
GB/T15805.5一2018 C.6病原sVcy 是弹状病毒科的鲤春病毒血症病毒,暂定于水泡性病毒属该病毒基因不分节段,是负义单股 RNA病毒基因组含有11019个核苷酸,编码的5种蛋白分别为:核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白 M),糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA多聚酶(L) sVCV主要侵染宿主(鱼)肝、肾、、脾和脑 sVCV在宿主体外可存活时间分别为:l0C水体中存活超过4星期,4C泥浆中存活超过6星期

鲤春病毒血症诊断规程GB/T15805.5-2018

一、鲤春病毒血症概述

鲤春病毒血症是由鲤春病毒引起的一种水生动物急性传染病，主要发生在鱼类中的鲤科和鳙科。该病毒可经过污染的水源、池塘、河流等侵入鱼体内，引起疾病爆发。该病毒具有高度传染性，可以在感染的鱼群中迅速扩散。

二、病因及传播途径

鲤春病毒属于单股RNA病毒，是一种外壳病毒。该病毒主要通过水源、池塘、河流等途径传播，感染鱼类后可以引起急性血症，在短时间内迅速导致死亡。此外，感染的鱼体中也会释放出大量病毒颗粒，进一步加剧疫情的扩散。

三、诊断规程

GB/T15805.5-2018是国家标准化管理委员会发布的《水生动物病原微生物检验与诊断技术规范》第5部分，主要介绍了用于检测鲤春病毒的诊断规程。根据该规程，鲤春病毒血症诊断主要包括以下内容：

样品采集：从患鱼中采集心脏、肝脏、脾脏、肾脏等组织进行检测。
样品处理：将采集的样品进行处理，得到可行的检测样本。
检测方法：主要采用PCR扩增技术、ELISA等方法进行检测。
结果分析：通过对检测结果进行分析，确定样品是否感染鲤春病毒。

四、预防和控制

目前，鲤春病毒血症的主要预防和控制措施包括：

加强鱼类养殖环境卫生管理，尽量减少水质污染。
定期对鱼类进行检查，发现疑似病例及时隔离治疗。
采用合适的消毒方法，杀灭水中的病毒颗粒。
加强相关研究，提高对该病的认识，进一步改进预防和控制策略的有效性。

五、总结

鲤春病毒血症是一种极具传染性的水生动物急性传染病，对鱼类养殖业产生了严重威胁。GB/T15805.5-2018规定了用于检测该病毒的诊断规程，为疾病的预防和控制提供了重要参考。同时，加强鱼类养殖环境卫生管理、定期检查等措施也是预防和控制鲤春病毒血症的关键措施。