牛尿中β-雌二醇残留量的测定气相色谱-负化学电离质谱法

牛尿中β-雌二醇残留量的测定气相色谱-负化学电离质谱法

国家标准 GB/T20749一2006 牛尿中卜雌二醇残留量的测定 气相色谱-负化学电离质谱法 Methodfordeterminationmo-estradiolresiduesinb0vineurine gaschromatographty-megative-ionchemicaliomizationm massspectrometrymethodl 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20749一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、山东出人境检验检 疫局 本标准主要起草人;庞国芳,王建华,李杰、刘靖靖、蔡发 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20749一2006 牛尿中卜-雌二醇残留量的测定 气相色谱-负化学电离质谱法 范围 本标准规定了牛尿中8雌二醇残留量气相色谱-负化学电离质谱测定方法 本标准适用于牛尿中雌二醇残留量的测定 本标准的方法检出限:0.254g/L 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004,Iso5725-l:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T66821992,neqISO3696;1987) 原理 牛尿中雌二醇经过酶水解和固相萃取柱净化后、经酰化衍生化后,用气相色谱-负化学电离质谱选 择离子监测模式测定,内标法定量 试剂和材料 除另有规定外,试剂均为分析纯;水为GB/T6682规定的一级水 ?葡糖苷酸酶和芳基硫酸苷酶,Hdlix ,含葡糖苷酸酶100000单位/mL,硫酸酯酶 pOmat1a， 000单位/mL 4.2甲醉色谱纯 四丁基甲哒(MTBE);色谱纯 4.4乙酸乙酯:色谱纯 正己炕色谱纯 毗:色谱纯 异辛炕:色谱纯 4.8衍生化试剂,五氧苯甲酰氧,在避光、防潮环境冷冻储藏 4.9碳酸氢钾 4.10三水乙酸钠 4.11无水硫酸钠 4.12甲醉醇十水溶液(1十1);取100mL甲醉(4.2)和100mL水充分混合 4.13甲醇十四丁基甲酥溶液(19);取20ml的甲醇(4.2)和180mlL四丁基甲酥(4.3)充分混合 4.14乙酸钠缓冲液(pH=5.2);称取43g三水乙酸钠(4.10)用水溶解,加人25.2g冰乙酸用水定容
GB/T20749一2006 至1000ml,有效期6个月 4.15干燥乙酸乙酯;在密封试管中加人500 mg无水硫酸钠和20mL乙酸乙酯,振荡混合约30min 后,2000r/min离心10min 4 16乙酸乙醋十毗唁(90+10):将10mL毗唁和90mL干燥的乙酸乙酯混合,室温保存 一周内 使用 4.17碳酸氢钾(KHcO.)溶液:0.5mol/L 称5gKHcO于100ml容量瓶中,用水定容至刻度 -周内有效 4.18Oasi、HLB固相萃取柱:60mg,3mL或相当者 使用前分别依次用3ml四丁基甲酥(4.3). 3ml甲醉(4.2),3ml纯水活化,保持柱体湿润 4.19标准物质;}雕二醉,纯度>99% 4.20内标标准物质?雌二醇-2,4,16,l6-D4,纯度>99% 4.21}雌二醉标准溶液;准确称量10mg标准物分别于100ml容量瓶中,用甲醉(4.2)定容至刻度 /nmL,储备液贮存于一20c,有效期一年 再以甲醇稀释成适用浓度的溶液,保存于4C冰 浓度100 从g/n 箱中 内标标准溶液;准确称量10mg标准物分别于100mL容量瓶中,用甲醇(4.2)定容至刻度,浓度 4.22 /nmL,储备液贮存于一20C,有效期一年 再以甲醇稀释成适用浓度溶液,保存于4C冰箱中,可 100 从g 使用三个月 标准工作溶液;将}雌二醉标准溶液(4.21)和}耀二醉D4(4.22)混合,按照7.3步骤衍生化后 4.23 备用 仪器 5.1气相色谱-质谱仪;配有负化学源 5.2离心管;5mL和10mL,具塞 5.3了移液器;20l一In0aLl,200l100L 5.4分析天平:感量0.1mg和0.01g 5.5离心机 5.6涡旋混匀器 5.7氮气浓缩仪 试样的制备与保存 试样的制备 6. 取有代表性样品,制成实验室样品 试样分为两份,置于样品瓶中,密封,并做上标记 试样保存 6. 2 将试样置于2C8C下保存 测定步骤 提取 准确移取2.0mL牛尿,置于5nmL具塞离心管中,加人2mL乙酸钠缓冲液(4.14、20L葡糖 苷酸酶和芳基硫酸昔酶(4.1),100L内标溶液(4.22)于每个样品中,混匀,于37C过夜 7.2净化 将提取液(7.1)移人下接OasisHLB柱(4.18)的贮液器中,溶液以<1mL/min的流速通过Oasis HLB柱,待溶液完全流出后,用甲醇十水(4.12)洗柱,弃去全部淋出液 最后用6mL甲醉十四丁基甲 酥(4.13)洗脱,收集洗脱液于10ml具塞离心管(5.2)中,用氮气浓缩仪(5.6)吹至约剩余500L溶
GB/T20749一2006 液 加人2×2mL异辛炕于上述10mL离心管中提取两次,以2000r/min离心5min 取上层液体于 5mL具塞离心管(6.2),于40c下氮气吹干 7.3衍生化 在上述5ml具塞试管中依次加人85L干燥乙酸乙醋(4.15),500山乙酸乙酯十毗唉(4.16). 20L五氟苯甲酰氯(4.8),混匀,于60C放置20min后,用氮气浓缩仪吹干 加人500L.0.5mol/I KHCO溶液(4.17),涡旋振荡,待溶液澄清后,准确加人0.4mL异辛烧,混合提取,静置,取上清液进 行测定 7.4测定 7.4.1气相色谱-质谐测定条件 色谱柱HP5Ms(30mx0.25mm×0.25m)石英毛细管柱或相当者 a 载气;复气,纯度>99.999%; b 流速初始流速1.0mL/min,保持5min,然后以1.0mL/min速度升至3mL/min c 柱温,120C保持2min,然后以15c/min程序升温至250c,再以5C/min升温至300C保持 d 8min; 进样量lL. 进样方式;无分流进样; 进样口温度:300C g 接口温度;280C， h 负化学源:l50eV 离子源温度:150C k) 四极杆温度;106C 反应气:甲烧,纯度>99.99%; m)反应气流量;2mL/nmins n)选择离子监测,见表1 表1选择离子监测表 允许相对偏差/% 监测离子(m/2 离子比/% 660 100 661 40 士20 448 80 士20 450 士20 44 7.4.2定性测定 定性测定的依据为 被测样品色谱峰的保留时间与标准工作溶液相一致 a bb 所选择的离子均出现,被测样品的监测离子的相对丰度与标准工作溶液的相对丰度两者之差 不大于允许相对偏差(7.4.1) 7.4.3定量测定 配制系列标准工作溶液(4.23)分别进样,仪器测定3-雌二醇以m/660为定量离子,内标已-雌二醇 D4以m/664为定量离子,以峰面积比对浓度绘制标准工作曲线,用标准工作曲线内标法对样品进行 定量,样品溶液中待测物质的响应值均应在仪器测定的线性范围内 在上述色谱条件下,雌二醉衍生物 参考保留时间约为26nmin 雌二醇和内标衍生物总离子流图和质谱图参见图A.1,图A.2,图A.3 7.5平行试验 以上步骤,对同一试样进行平行试验测定
GB/T20749一2006 7.6空白试验 除不称取试样外,均按上述步骤进行 结果计算 结果按式(1)计算 00o x X= -× 000 式中 试样中被测组分残留量,单位为微克每升(ug/L); -从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL.); 样品溶液定容体积,单位为毫升(mL); 样品溶液所代表试样的质量,单位为克(g) 7 注:计算结果应扣除空白值 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,其重复性和再现性的 值以95%的可信度来计算 9.1重复性 在重复性条件下,牛尿中雕二醇的含量在0.25g/L一2.0gL范围内,获得的两次独立测试结果 的绝对差值不超过重复性限(r),本标准的重复性限按式(2)计算 r=0.155m一0.010l 式中 雕二醉测定值的浓度,单位为微克每升(ue/L). 71 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 再现性 在再现性条件下,牛尿中雕二醉的含量在0.25k儿-2.0pg儿范围内,获得的两次独立剥试结果 的绝对差值不超过再现性限(R),本标准的再现性限按式(3)计算 lgR=1.102lg一0.885 式中 雌二醇测定值的浓度,单位为微克每升 m
GB/T20749一2006 附 录 A 资料性附录 雌二醇和内标衍生物总离子流图和质谱图 雌二醇和内标衍生物总离子流图,见图A.1 A.1 Abundance TIC:5.D 550000 500000 25.98 450000 400000 350000 300000 25000o 200000 150000 100000 5000o 蓝城新豆数放w新 /minm 图A.1雌二醇和内标衍生物总离子流图 A.2雌二醇标准物质衍生物质谱图,见图A.2. Abundance 148 Scan274026.044min):4.D(一2788)(- 280000 0 66o 448 180000 00 196240 0O说s490_548e 20000 594 702740796 50100150200250300350400450500550600650700750800 m/2- 图A.2雌二醇标准物质衍生物质谱图 A.3雌二醇D4标准物质衍生物质谱图,见图A.3 Abundance Scan273225.977min:5.D(一2853)(- 148 100000 90000 664 80000 7000o 452 60000 50000 40000 30000 20000 1000o 196 -4sa，.斟,蹭.-攀聪.l,焦 0 50100150200250300350400450500550600650700750 m/2-- 3 图 雌二醇D4标准物质衍生物质谱图 A，
GB/T20749一2006 附录 资料性附录 教 收 本方法中雌二醇添加浓度及其平均回收率的试验数据 在0.25返/L时,回收率为100.0% 在0.5只g/L时，回收率为71.7%; 在1.04g/L时，回收率为100.7% 在2.04g/儿时，回收率为86.0%