国家标准 GB/T18935一2018 代替GB/T18935一2003 口蹄疫诊断技术 Diagnosticteehniquesforfootandmouthdisease 2018-09-17发布 2019-04-01实施国家市场监督管理总局发布币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/T18935一2018 目次前言引言范围 2 规范性引用文件缩略语临床诊断 4.1易感动物 4,2临床症状 4.3病理变化结果判定 4,4 实验室诊断样品采集 5.1器材 5,2试剂 5.3样品采集 5.4样品处理病毒分离 6.1器材 6.2试剂 6.3试验动物与细胞 6.4试验程序 6.5病毒鉴定 6.6结果判定定型酶联免疫吸附试验(定型ELISA 7.1器材 7.2试剂 7.3试验程序 7.4试验成立条件 7.5结果判定多重反转录-聚合酶链式反应(多重RT-PCR 8.1器材 8.2引物 8.3试剂 8.4样品准备 8.5试验程序 8.6试验成立条件 8.7结果判定
GB/T18935一2018 定型反转录-聚合酶链式反应(定型RT-PCR 9 9.1器材 9.2引物 9.3试剂 9.4样品准备 9.5试验程序 9.6试验成立条件 9.7结果判定 10病毒VP1基因序列分析 0.1器材 0.2引物 10 0.3试剂 0.4样品准备 0 10 0.5试验程序 10.6试验成立条件 0.7结果判定与分析 1 11 荧光定量反转录聚合酶链式反应(荧光定量RT-PCR 11 1器材 1.2引物和探针 11 1.3试剂 11 12 1样品准备 1.5试验程序 12 l.6试验成立条件 2 1.7结果判定 12 12 12病毒中和试验(VN 12.1器材 12 12.2试剂 12 12.3试验程序 13 2.4试验成立条件 13 13 12.5结果判定 14 13液相阻断酶联免疫吸附试验(LPBELISA) 13.1器材 14 14 13.2试剂 3.3对照血清 3.4试验程序 13.5试验成立条件 3.6结果判定 15 4固相竞争酶联免疫吸附试验(SPC-ELISA 14.1器材 15 14.2试剂 5 15 14.3试验程序
GB/T18935一2018 15 14.4试验成立条件 15 14.5结果判定 15 5非结构蛋白3ABC抗体间接酶联免疫吸附试验(3ABC-I-ELISA 15 15.1器材 l6 15.2试剂 15.3试验程序 l6 15.4试验成立条件 I6 15.5结果计算与判定 6非结构蛋白3ABC抗体阻断酶联免疫吸附试验(3AEBC-B-ELISA l6 16.1器材 l6 16.2试剂 16.3试验程序 16.4试验结果有效性判定 6.5结果判定 7综合判定附录A规范性附录)样品保存液和细胞培养液 18 附录B(规范性附录)酶联免疫吸附试验用溶液的配制 20 附录c(规范性附录)核酸检测用液体配制
GB/T18935一2018 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准代替GB/T18935一2003《口蹄疫诊断技术》本标准与G;B/T18935一2003相比,除编辑性修改外,主要技术变化如下 -增加了临床诊断 -删除了微量补体结合试验; -取消了查毒试验部分,其相关内容在其他部分规定; 删除了病毒感染相关(VIA)抗原琼脂凝胶免疫扩散试验(VIA-AGID),增加了非结构蛋白 3ABC抗体间接酶联免疫吸附试验(3ABC-I-ELISA)和非结构蛋白3ABC抗体阻断酶联免疫吸附试验(3ABC-BELISA)以替代VIA-AGID; -增加了定型反转录-聚合酶链式反应增加了病毒VP1基因序列分析; -增加了荧光定量反转录聚合附链式反应本标准由农业农村部提出本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(sAC/TC181)归口本标准起草单位;农业科学院兰州兽医研究所本标准主要起草人;刘湘涛、张强、郭建宏,何继军、刘在新、卢曾军,包慧芳、常惠芸,田宏.郑海学、尚佑军、马军武、吴国华、斯野、林密、马维民、卢永干,朱彩珠本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T189352003.
GB/T18935一2018 引言口蹄疫(Footandmouthdisease, e,FMD)是由口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus. s,FMDV)感染引起偶蹄动物的一种急性、烈性、接触性传染病口蹄疫可造成巨大经济损失和社会影响,世界动物卫生组织(OIE)将口蹄疫列为必须报告的动物传染病,我国规定口蹄疫为一类动物疫病口蹄疫的传染源主要为潜伏期感染及临床发病动物易感动物可通过呼吸道、消化道、生殖道和伤口感染病毒,通常以直接或间接接触飞沫等)方式传播,或通过人或犬、蛹、卿,鸟等动物媒介,或经车辆、器具等被污染物传播如果环境气候适宜适宜,病毒可随风远距离传播感染动物呼出物、唾液,粪便、尿液、乳、精液及肉和副产品均可带毒乌动物感染后,病毒可在食道-咽喉部持续带毒口蹄疫病毒在分类上属小RNA病毒科(Pieornairidae),口蹄疫病毒属,有7个血清型,即0A Asia1、C、SAT1、SAT2和SAT3型 ,免疫防控时相当于面临7种不适于口蹄疫诊断的样品是未破裂或刚破裂的水泡皮和水泡液 ,可采集血液和或用食道探杯采集反鱼动物食道-咽部分泌物样品,这些样品中也存在病毒检测特异性抗体也用于诊断如果样品酶链反应(RT-PCR),和(或)用敏感细胞培养或吮乳小白鼠对样品中可能存在的核酸或活病毒进行增殖后再用酶联免疫吸附试验ELISA)或RT-PCR进行检测血清学诊断中,若未接种疫苗的动物体内检出特异性抗体,即可作出和不易采到水泡性上皮样品的病例十分有用前病毒感染的证据用于口蹄疫病毒型别鉴定的方法有定型酶联免疫吸附试验(定型ELIsA)、定型反转录-聚合酶链式反应(定型RT-PCR),用于口蹄疫病毒抗原和核酸诊断的方法有多重反转录-聚合酶链式反应(多重RT-PCR)、病毒VP1基因序列分析和荧光定量反转录-聚合酶链式反应(荧光定量RT PCR),用于口蹄疫病毒结构蛋白抗体检测的方法有病毒中和试验(VN)、液相阻断酶联免疫吸附试验 LPB-ELISA)和固相竟争酶联免疫吸附试验(sPC-ELISA),用于检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体诊断的方法有非结构蛋白(NsP)3ABC抗体间接酶联免疫吸附试验(3ABC-1-ELISsA)和非结构蛋白(NNSP) 3ABC抗体阻断酶联免疫吸附试验(3ABC-BELISA) 本标准的修订参考了oIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册)(2017版),并结合我国相关技术研究新成果制定,在技术上与国际先进技术保持一致订
GB/T18935一2018 口蹄疫诊断技术范围本标准规定了口蹄疫(Footandmouthdisease,FMD)临床诊断和实验室诊断的技术要求本标准适用于猪、牛、羊等偶蹄动物及其他易感动物口蹄疫的诊断规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求缩略语下列缩略语适用于本文件 CPE;致细胞病变(Cytopathiceffect DNA;脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleeacd) 1zymelinkedimmunosorbentassay ELISA:酶联免疫吸附试验(Enz FMD;口蹄疫(Footandmouthdisease) FMDV;口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus) HRP;辣根过氧化物酶(Ho Iorsera adishperoxidase) Da:半数感染剂量(Medianinfectivedose) LPB:液相阻断Liquidphaseblock MEM;最低必需培养基(Minimumessentialnmediunm) NsP;非结构蛋白 Nonstructuralprotein O-P液:食道-咽喉部分泌物(Oesophageal -pharyngealfluids) OPD;邻苯二胺(O-Phenylenediamine) PS;磷酸盐缓冲液(Phosphatebufferedsalinebuffer) RNA;核糖核酸(Ribonucleicaeid) ymerasechainreaction RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(Rever erSetranscriptio ionpoly SPC;固相竟争(Solidphasecompetition) TCID:半数细胞感染量(Mediantissueeultureinfectivedose) TMB四甲基联苯胺(3,3',5,5'teramethylbenzidine) VN;病毒中和试验(Vir irusneutralisationtest 临床诊断 4.1易感动物偶蹄目动物,包括牛科动物(牛,瘤牛,水牛、耗牛),绵羊,山羊及所有野生反刍动物和猪科动物对口蹄疫病毒均易感,驼科动物易感性较低马属动物不感染口蹄疫
GB/T18935一2018 4.2临床症状 4.2.1易感动物卧地不起或跛行,牛可见呆立流涎易感动物唇部、舌面,齿眼、鼻镜、蹄踵、蹄叉、乳房等部位出现水泡 4.2.2 4.2.3发病后期,水泡破溃、结痴,严重者蹄壳脱落,恢复期可见癫痕、新生蹄甲 4.2.4传播速度快,发病率高;成年动物死亡率低,幼畜常突然死亡且死亡率高,仔猪常成窝死亡 4.3病理变化 4.3.1消化道可见水泡、溃疡 4.3.2幼畜可见骨骼肌、心肌表面出现灰白色条纹,形色酷似虎斑 4.4结果判定易感动物出现上述临床症状和病理变化,可判定为疑似口蹄疫确诊应采集有临床症状动物的水泡皮、水泡液,也可采集未见明显临床症状易感动物的血清、反鱼动物O-P液进行实验室诊断 5 实验室诊断样品采集 5.1器材食道探杯 5.1.1 5.1.2猪扁桃体取样器 5.1.3手术剪刀和锻子 5.1.4样品保存管 5.1.5离心管(2mL.10nL. 5.1.610ml一20mL注射器 5.17防水标签 5.1.8医用防护服 5.1.9组织匀浆器 5.1.10高速组织匀浆机 5.2试剂 5.2.10.lmol/L.PBs(pH7.4),配方见附录A的A.1 5.2.20.04nmol/LPBs(pH7.4),配方见A.2 5.2.350%甘油-PEBS保存液,配方见A.3 5.2.4O-P液保存液,配方见A.4 5.2.50.2%柠檬酸或2%氢氧化钠 5.2.6青霉素1000IU/ml 5.2.7链霉素500IU/mlL 5.2.8三氯三氟乙烧或氯仿 5.3样品采集 5.3.1水泡液采集典型临床发病动物水泡液用灭菌注射器吸出后装人样品保存管,加青霉素1000IU/mL、链霉素
GB/T18935一2018 500IU/mL,加盖封口,冷冻保存 5.3.2水泡皮采集用0.04mol/LPBs(pH7.4)清洗水泡表面,然后用灭菌手术剪刀剪取水泡皮,2g一5g为宜采集到的水泡皮,装人样品保存管,加50%甘油-PEBS保存液,使保存液液面没过样品,加盖封口,冷冻保存 5.3.3组织样品采集若采集不到典型的水泡皮,则采集病灶周围破溃组织2g一5g,装人样品保存管,加50%甘油-PBs 保存液,使保存液液面没过样品,加盖封口,冷冻保存临床表现健康,但需做口蹄疫病原学检测的动物,可在屠宰时采集淋巴结、脊髓、扁桃体、心脏肌肉对肉品进行口蹄疫病原学检测时,可采集骨骼肌组织样品应不少于2g,装人样品保存管中,密封、冷冻保存 5.3.4反刍动物o-P液样品采集被检动物在采样前禁食(可饮水)12h 食道探杯在使用前经0.2%柠檬酸或2%氢氧化钠浸泡 5min消毒,再用洁净水充分冲洗每采完一头(只)动物,探杯都要进行消毒并充分清洗采样时动物处,轻轻来回移动艺-3次,然后将站立保定,将探杯随吞咽动作送人被检动物食道上部10cm一15cm 探杯拉出如采集的O-P液被胃内容物严重污染,用水冲洗被检动物口腔后重新采样在10ml离心管中加3ml5mLO-P液保存液,将采集到的O-P液倒人离心管中,密封后充分摇匀,冷冻保存 5.3.5血清样品采集采集动物血液,每头应不少于5ml 无菌分离血清,装人2mL离心管中,加盖密封后冷藏或冷冻保存 5.4样品处理 5.4.1生物安全措施样品处理的生物安全措施按照GB19489进行 5.4.2组织样品处理将采集的动物机体组织,置组织匀浆器中充分研磨,加人青霉素1000U/ml,链霉素500IU/ml 0.04mol/LPBS(pHI7.4)制成1:5的组织悬液,4C浸毒过夜次日以3000r/min离心10min,取上清液备用 5.4.3水泡液样品处理水泡液以3000r/min离心10min,取上清液备用 5.4.40-P液样品处理将OP液倒人灭菌塑料离心管内再加人不少于样品1/3体积量的三氯三氟乙炕或氯仿用高速组织匀浆机以10000r/min搅拌3min.然后以3000r/min离心10min 此时液体分成两相,将上层水相分装人样品保存管中备用病毒分离 6.1器材 6.1.1倒置生物显微镜
GB/T18935一2018 6.1.2冰箱(2C一8C、一20C、一70C不同温度) 6.1.3恒温培养箱 6.1.44C离心机 6.1.5微量移液器(54l10Al,100L、200l,1000AL等不同规格) 6.1.61mL注射器 6.1.725cm细胞培养瓶 6.2试剂 6.2.10.04nmol/儿PBS(pH7.4),配方见A.2 6.2.2细胞培养液与细胞维持液,配方见A.5 6.3试验动物与细胞 6.3.13日龄吮乳小白鼠(乳鼠) 6.3.2犊牛甲状腺细胞原代细胞 6.3.3仔猪肾细胞系(IBRS-2). 幼仓鼠臂细胞系(BHK21. 6.3.4 6.4试验程序 6.4.1乳鼠分离病毒 6.4.1.1接种乳鼠5.4中浸毒过夜后的组织悬液或水泡液上清液,或O-P液上层水相接种3日龄乳鼠,每只乳鼠颈背部皮下接种0.2mL 同时设健康对照,对照乳鼠颈背部皮下接种0.2ml.0.04mol/1 PBs(pH7.4) 6.4.1.2观察记录;接种12h以后,对乳鼠进行连续观察健康对照乳鼠整个病毒分离期间应无异常表现若被检样品中有口蹄疫病毒,通常在接种2d3d后,实验乳鼠出现口蹄疫感染症状,表现为后腿运动障碍,麻痹,头部不能抬起,呼吸紧张,以致死亡发病或发病死亡乳鼠在解剖时常见膀胱积尿现象 6.4.1.3盲传:若接种乳鼠第一代72h后未见发病症状,则处死第一代乳鼠,按5.4.2所述方法将乳鼠胭体制成1;5组织悬液,按6.4.1.1所述方法在乳鼠上接种如此盲传3代 6.4.1.4收集发病死亡乳鼠朋体,保存于50%甘油-PBs保存液中,置一70C保存,用于病毒鉴定 6.4.2细胞分离病毒 6.4.2.1制备单层细胞:按常规法将原代细胞(犊牛甲状腺细胞)或继代细胞(IBRSs-2,BHK-21)分装在 25em'细胞培养瓶中,每瓶分装细胞悬液5ml,细胞浓度应为2×10个/ml一3×10个/ml,37C培养48h 6.4.2.2接种细胞:5.4中浸毒过夜后的组织悬液或水泡液上清液,或O-P液上层水相接种细胞牛源样品接种犊牛甲状腺细胞或BHK-21细胞,猪源样品接种IBRs2或BHK-21细胞,其他来源样品接种 BHIK-21细胞每份样品接种24瓶细胞,另设细胞对照24瓶接种前,先倒去细胞培养瓶中的营养液,加人1mL已经处理好的病料液,室温静置30min 然后再加4mL细胞维持液细胞对照瓶不接种样品,倒去营养液后加5mL细胞维持液,37C培养 6.4.2.3观察和记录;若被检样品中有口蹄疫病毒,通常在接种1d~2d后可出现CPE,主要呈现细胞圆缩、聚集,最后溶解脱落对照细胞单层应完好,细胞形态基本正常或稍有衰老收获细胞液，置 -70保存,用于病毒鉴定 6.4.2.4盲传;如接种细胞第1代72h后未出现CPE,收获细胞/病毒液按6.4.2.2所述方法再接种生长 48h的单层细胞进行盲传,即1ml第1代细胞/病毒液加4ml细胞维持液,37C培养如此盲传3代
GB/T18935一2018 6.5病毒鉴定对发病死亡乳鼠和出现CPE的细胞培养液,选用第7章(定型ELISA,第9章(定型RT-PCR)进行血清型鉴定,也可选用第8章(多重RT-PCR)第10章(病毒VP1基因序列分析)、第11章(荧光定量RT-PCR)进行核酸鉴定和分析 6.6结果判定 6.6.1乳鼠盲传3代无发病症状、细胞盲传3代未见细胞病变,且经6.5所述方法检测阴性者,判定病毒分离阴性对发稍死亡乳鼠和出现CPE的细胞培养液,经6.5所述方法任一项检测阳性者,判为病毒分离 6.6.2 阳性定型酶联免疫吸附试验(定型ELISA 7.1器材 7.1.1酶标仪 7.1.2与96孔酶标板配套使用的旋转振荡器 7.1.3恒温培养箱 7.1.4洗板机或洗涤瓶 715n孔平底聚桨乙怖朋标板 71sU"型8孔稻释板 7.1.7微量可调移液器5AL,.10L.lIo0AL.,200AL.l00L等不同规格》) 7.1.8与移液器匹配的吸头 7.1.9贮液槽 7.1.10封板膜 7.1.11吸水纸巾 7.2试剂捕获抗体;各型兔抗FMDV146s抗原抗血清由提纯的各型FMID148s完整病毒粒子免疫兔 7.2.1 子制备而成,用pH9.6的包被缓冲液将捕获抗体稀释至工作浓度 7.2.2检测抗体;各型豚鼠抗FMDV146S抗原抗血清,用与制备捕获抗体同源的各型FMDV146S完整病毒粒子免疫豚鼠制备而成;或者是辣根过氧化物酶(HRP)标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体,用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度 7.2.3对照抗原:FMDV灭活抗原 FMDV于单层BHK-21细胞上繁殖,病毒培养液经二乙烯亚胺灭活后离心除去细胞碎片,上清液作为对照抗原,使用时用样品稀释液稀释至工作浓度 7.2.4包被缓冲液;碳酸盐缓冲液,0.05mol/几Na,CO,-NaHcO.,pH9.6,配方见附录B的B.1 7.2.5样品稀释液;含0.05%体积分数)吐温-20的0.0mol/LPIs,pH7.2一7.4,配方见B2 7.2.6酶标抗体稀释液;按5%(质量浓度)比例在样品稀释液中加人脱脂奶粉 7.2.7洗涤缓冲液:含0.01%体积分数)吐温-20的0.002mol/PBS,配方见B.3 7.2.8底物溶液:OPD底物溶液,配方见B.4.l;TMD底物溶液,配方见B.4.2 7.2.9终止液:l.25mol/L硫酸,配方见B.5.1;2mol/L硫酸,配方见B.5.2 7.2.10兔抗豚鼠IgGHRP标记物;用健康兔血清阻断,用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度
GB/T18935一2018 7.3试验程序 7.3.1包被酶标板;将工作浓度的捕获抗体分别包被ELISA板第1列至第12列(也可根据待检样品数量调整包被孔数),按o,A,Asia1型的顺序包被酶标板,每个血清型包被1列,每孔加50AL,用封板膜封板,置于4C过夜(或38C士0.,5C,100r/min一200r/min振荡孵育2h). 7.3.2洗涤;每孔中加满洗涤缓冲液,放置30s后弃去,重复洗涤6次后在吸水纸巾上拍干酶标板 7.3.3加对照抗原和待检病原样品;ELISA板第1列A,B两孔加O型抗原,第2列A,B两孔加A型抗原,第3列A、B两孔加Asial型抗原,以此类推,其余孔加被检样品,每份样品每个血清型加2孔,每孔加50AL 每型设2孔阴性对照,阴性对照孔每孔加50AL样品稀释液用封板膜封板,置于38C士 0.5C旋转振荡器中振荡6o 同7.3.2洗涤 min 7.3.4加豚鼠抗血清和兔抗豚鼠IgGHRP标记物或加各型抗FMDV型特异性单克隆抗体工作液:将工作浓度的豚鼠抗FMDV各型抗血清逐个加人与包被兔抗FMDV血清同型的各孔,即包被兔抗型 FMDV抗血清的孔则加豚鼠抗O型FMDV抗血清,包被兔抗A型FMDV抗血清的孔则加豚鼠抗A 型FMDV抗血清,以此类推,每孔加50L,封板后同前振荡孵育60min,同7.3.2洗涤后加兔抗豚鼠 IgGHRP标记物,每孔加50L,封板后同前振荡孵育45min,同7.3.2洗涤或者将工作浓度HRP标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体加人到包被同型兔抗血清的各孔和阴性对照孔,每孔加50AL 封板后同前振荡孵育60min,同7.3.2洗涤 7.3.5加底物溶液、终止液,判读结果加豚鼠抗FMIV各型抗血清和兔抗豚鼠lGHIRP标记物时,洗涤板子后加人预热至38C士0.5 的OPD底物溶液,每孔加50AL,封板,避光38C士0.,5C振荡孵育15min 每孔加50L.1.25nmol/I 终止液,混匀后在酶标仪492nm下判读结果加HRP标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体时,洗涤板子后加人预热至38C士0.5C的 TMD底物溶液,每孔加50L,封板,避光38C士0.5C振荡孵育15min 每孔加50L2mol/L硫酸终止液,混匀后在酶标仪450nm下判读结果 7.4试验成立条件 7.4.1 结果计算;相对oD值一被检解品各血请翠平均oD值一同型阴性对照(N)早均oD值某型阴性对照(N)平均oD值大于0.20,试验不成立 7.4.2 7.4.3阳性对照OD值应大于或等于0.6,阴性对照应小于或等于0.20,试验成立 7.5结果判定在试验成立的前提下;如果样品各型的相对OD值小于或等于0.20,则该样品为阴性;如果样品某型的相对OD值大于或等于0.3,则判定该样品此血清型阳性;如果样品某型的相对OD值大于0.2但小于0.3,则判为可疑,需要重新测定,再次测定结果,若某型的相对OD值小于0.30,则该样品为阴性，如果样品某型的相对OD值大于或等于0.3,则判定该样品该型口蹄疫抗原阳性 8 多重反转录-聚合酶链式反应(多重RT-CR 8.1器材 8.1.1PCR扩增仪 8.1.2台式低温高速离心机 8.1.3稳压稳流电泳仪和水平电泳槽
GB/T18935一2018 8.1.4凝胶成像仪(或紫外透射仪). 8.1.5微量可调移液器(5L,10L、100L,200MlL、1000L等不同规格). 8.1.6无核酸酶水处理的离心管与吸头 8.1.7PCR扩增管 8.2引物上游引物 8.2.1 下列3条引物为上游引物 5'GACTCGACGTCTCCCGCCAACT3' b5'ACGACGGGGGCTTTTGCTTTCAC3' 5'cGGGAAACGCACGAGCAGTATC3' 8.2.2下游引物下列3条引物为下游引物 a)5'TGcGGAcGGcCAcCTAcTACTTc3' b)5'AGcTcCcAcGAAAAAGTGTcCGAG3' 5'CGTGATGTGGCGAGAATGAAGAA3' c 8.3试剂 8.3.1总RNA提取试剂 8.3.1.1变性液;6mol/1异硫酸呱或Trizol reagent 8.3.1.22mol/L乙酸钠(pH4.0) 8.3.1.3酚氯仿抽提液;苯酚-三氯甲烧-异戊醇(25:24:1)混合液 8.3.1.4异丙醇(分析纯无核酸酶水;可将焦碳酸二乙酷按0.1%(质量浓度)的量加人双蒸溜水(dH.)中制备 8.3.1.5 8.3.1.675%乙醇;无水乙醉(分析纯)与无核酸酶水按3配制而成 8.3.2RI-PCR试剂 8.3.2.110×一步RNAPCR缓冲液 8.3.2.2反转录酶(AMV):5U/L 8.3.2.3核糖核酸酶抑制剂(RNaseinhibitor);40U/L AMvoprimiadT叫爵sU/AL. 8.3.2.4 8.3.2.5dNTP预混液;包括dATP,dTTP,dcTP,dGTP,各10mmol/儿 8.3.2.6MgCl;25mmol/L 8.3.3电泳试剂 8.3.3.1电泳缓冲液;50×TAE贮存液(配方见附录C的C.1),临用时加燕馏水配成1×TAE缓冲液配方见C.2) 8.3.3.2琼脂糖;国产或进口的低熔点琼脂糖 8.3.3.3电泳加样缓冲液:配方见C.3 8.3.3.4DNAMarker(标准分子量);分子大小范围100bp1000bp,.100bp梯度
GB/T18935一2018 8.4样品准备 8.4.1本方法适用所有的FMD病原样品种类,包括水泡皮、水泡液、O-P液、扁桃体、淋巴结、骨髓、肌肉、病毒接种乳鼠与细胞培养物等 8.4.2阳性对照:已知病毒材料,如FMDV感染的乳鼠或细胞,与待检样品同时提取总RNA,再反转录和PCR扩增,其扩增产物作为电泳对照样品 8.4.3阴性对照:未感染的乳鼠或细胞,与待检样品同时提取总RNA,再反转录和PCR扩增 8.5试验程序 8.5.1核酸提取 8.5.1.1 酚氧仿法抽提核酸 mL离心管中,每管加人300儿空 8.5.1.1.1取待检样品、阴性对照、阳性对照各300L分别置于1.5 性液,反复混匀冰水浴5min 每管分别加人60L.2mol几乙酸钠(pH4.0),混匀 8.5.1.1.2 8.5.1.1.3每管加.800L苯盼-三氧甲婉-异戊醉(25124:1)混合液,冰水浴5min. 8.5.1.1.48000r/min离心10min 将上清液转人另一洁净离心管 8.5.1.1.5加800L异丙醇,混匀,室温放置15min 8.5.1.1.64C,12000r/min,离心10min,小心的倒掉上清液尽量倒干液体,留下RNA沉淀 8.5.1.1.7加1000L75%乙醇颠倒洗涤沉淀,4,10000r/min,离心5min,小心倒干液体,室温干燥5min~10min 8.5.1.1.8每管加10L无核酸酶水,用于溶解RNA 总NA提取液可立即用于PCR扩增,也可 -70C冰箱保存备用 8.5.1.2核酸提取等效方法可采用等效RNA提取试剂和方法,如采用自动化核酸提取仪和配套核酸抽提试剂进行核酸提取 8.5.2核酸扩增 8.5.2.1PCR反应混合液配制:10×一步RNAPCR缓冲液50AL,MgC1004L..dNTPs50l,上下游引物对各30L,无核酸酶水110L,在超净工作台中混匀,分装人PCR扩增管中,一20C保存备用 8.5.2.2多重RT-PCR扩增;在已分装有PCR反应混合液的PCR扩增管中分别加人已制备好的总 RNA提取液5AL,盖紧管盖,放人扩增仪中按照设定程序扩增:50C反转录30tmin,94C预变性 2min;然后94C变性50s58退火50s,72C延伸60s,共进行35次循环;最后72C延伸8min 8.5.3扩增产物电泳检测 8.5.3.11.5%琼脂糖凝胶板的制备;称取1.5g琼脂糖,加人100ml1×TAE缓冲液中加热融化后加5AL(10mg/mL)澳乙锭,混匀后倒人放置在水平台面上的凝胶盘中,胶板厚5mm左右依据样品数选用适宜的梳子待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔),放人电泳槽中,加1×TAE缓冲液淹没胶面 8.5.3.2加样;取6AL~8L，PCR扩增产物和2L 加样缓冲液混匀后加人一个加样孔每次电泳同时设标准DNAMarker,阴性对照、阳性对照 40 8.5.3.3电泳:电压80V100V或电流40mA50mA,电泳30min min
GB/T18935一2018 8.6试验成立条件电泳结束后,取出凝胶板置凝胶成像仪(或紫外透射仪上观察阳性对照电泳结果应为三个条带分别为634bp,483bp和278bp,阴性对照应无扩增条带 8.7结果判定符合8.6的条件,被检样品至少扩增出一条DNA条带,且与阳性对照条带分子量大小相符,则该样品判定为FMDV核酸阳性被检样品无扩增条带,判为FMDV核酸阴性定型反转录-聚合酶链式反应(定型RT-PCR g.1器材同8.1 9.2引物下列为下游引物和分别检测FMDV7个血清型的上游引物下游引物通用):5'-AGCTTGTAcCAGGGTTTGGC-3 a b 上游引物(0型):5'-GCTGCCYACYTCYTTCAA-3' 上游引物(A型);5'-GTCATTGACCTYATGCAVACYCAC-3" c d 上游引物(C型):5'-GTTTCTGCACTTGACAACACA 上游引物(Asia1型):5'-GACAcCACHCARRAccGccG3 f 上游引物(SAT1型):5'-AGGATTGCHAGYGAGACVCACAT-3" 上游引物(SAT2型):5” -GGCGTYGARAAACARYTBTG-3 g h)上游引物(SAT3型);5'-TTcGGDAGAYTGTTGTGTG,3'" 其中,Y,R、H、V,D为简并碱基,Y对应C/T,R对应A/G,H对应A/T/C,V对应G/A/C,D对应 A/T/G g.3试剂同8.3 g.4样品准备同8.4 9.5试验程序 9.5.1核酸提取同8.5.1 9.5.2 -步法RT-PCR扩增 9.5.2.1RT-PCR反应体系配制,采用25L反应体系,扩增体系配制如下: 0×一步RNAPCR缓冲液 2.5L MgCl.(25mmol/L 5l. dNTP(各10mmol/L 2.5L
GB/T18935一2018 RNase酶抑制剂(40U/L) 0.5L AMV(5U/pL) 0.5L AMV-OptimizedTaq(5U/!L 0.5L 下游通用引物(50pma/L) 0.5AL 上游型特异性引物混合(各50pmol/uL) 0.5l 总RNA水溶液 12.5L g.5.2.2扩增程序将CR扩增管盖紧管盖,放人扩增仪中按照设定程序扩增;50C反转录30nmin. 94C预变性4min;然后94C变性50s,58C60C退火40s,72C延伸40s,共进行30次循环;最后72C延伸8 min 9.5.3扩增产物电泳检测同8.5.3 9.6试验成立条件电泳结束后,取出凝胶板置于凝胶成像仪(或紫外透射仪)上观察阳性对照扩增产物电泳结果应分别为o型400bp,.A型730bp,C型600bp,Asia1型300bp,SAT1型430bp,sAT2型260bp sAT3型380bp,阴性对照应无扩增条带 9.7结果判定符合9.6的条件样品扩增产物的DNA条带与某型阳性对照条带分子量大小一致,则该待检样品为某型FMDV 如被检样品无扩增条带,则该样品为FMDV核酸阴性 10病毒VP1基因序列分析 0.1器材同8.1 0.2引物 FMDVO型、A型、Asia1型通用VP1扩增引物;VPIF;5'-GcGCTGGCAAAGACTTTGA-3'; VPIR:5'-GACATGTcCTcCTGCATCTGGTTGA-3' 10.3试剂同8.3 0.4样品准备同8.4 10.5试验程序 10.5.1核酸提取同8.5.1 0.5.2Rr-PCR反应 0.5.2.1RT-PCR反应体系配制,采用50AL反应体系,扩增体系配制如下 10
GB/T18935一2018 0X一步RNAPCR缓冲液 L 5 dNTP(10 mmolL) 5 l A mmol/L 10 MgCl,(25 RNase酶抑制剂(40U/AL ll 1儿反转录酶(AMV)(5U/L TaqDNA聚合酶(5U/L i" 正向引物VPIF(25pmol/aL IW 反向引物VPI1R(25pmol/aL 总RNA提取液 104L 无核酸酶水 15L. 10.5.2.2扩增程序;将PCR扩增管盖紧管盖,放人扩增仪中按照设定程序扩增;42C反转录30min 95C变性2min;然后95C变性60s,55C退火60s,72延伸8min,共进行30一35次循环 10.5.3扩增产物电泳检测同8.5.3. 10.6试验成立条件电泳结束后,取出凝胶板置于凝胶成像仪(或紫外透射仪)上观察阳性对照扩增产物目标条带大小应为810bp,阴性对照应无扩增条带 10.7结果判定与分析样品扩增产物的DNA条带与阳性对照条带分子量大小一致,则表明扩增出该样品FMDvVP1基因扩增DNA片段测序:RT-PCR产物纯化后,可直接用于DNA序列测定,测序引物与RT-PCR扩增引物相同应用DNA序列分析软件(如DNNAStar,MEGA等)进行序列分析参考序列见FAO/OIE 世界口蹄疫参考实验室网站http://www.wrlfmd.org/fmd_genotyping/prototypes.htmm 通过序列同源性分析,即可确定病毒的基因型,进行遗传关系分析荧光定量反转录聚合酶链式反应(荧光定量RI-PCR 11.1器材荧光定量PCR仪 1.1.2其余器材同8.1 11.2引物和探针下列两个引物和探针组合中,任一个都可以用于FMDv的荧光定量PCR 5'UTR正向引物:CACYTYAAGRTGACAYTGRTACTGGTAc;反向引物.CAGANTYCCRAGT aa GwCICITGTIA;IaeMan探针:CCTcGGGGTACCTGAAGGGCATcCC 3D正向引物;ACTGGGTTTTACAAAccTGTGA;反向引物GcGAGTcCcTGcCAcGGA b TaqMan探针;TcCTTTGCACGccGTGGGAC 其中,Y,R、w为简并碱基,Y对应C/T,R对应AG,w对应A/T;1为修饰碱基 11.3试剂同8.3 11
GB/T18935一2018 11.4样品准备同8.4 11.5试验程序 11.5.1核酸提取同8.5.1 11.5.2荧光定量RT-PCR反应 11.5.2.1在离心机中旋转平板或PCR管1min,混匀每管内容物,反应总体系25l 2 × 一步RT-PCR缓冲液 12.5AL TaKaRaExTaqHs(5U/L) 0.5L PrimeSeriptRTEnzymeMixI 0.5L PCR正向引物(104mol/L 0.5L PCR反向引物(10pmoal/L) 0.5L 探针(54mol/L 1 l. 总RNA 2 L 无核酸酶水 7.5L 1.5.2.2把平板或PCR管放在荧光定量PCR仪器上进行RT-PCR扩增,按照下面的程序扩增:42C 反转录15min;然后95C变性10s,55C退火30s72C延伸30s,共进行40次循环 11.6试验成立条件 11.6.1阳性对照扩增曲线应呈标准的S曲线,且C值应小于25 11.6.2阴性对照扩增曲线应为基线下的水平线 11.7结果判定若样品曲线呈标准的S形曲线,且Ct值小于35为阳性;C值大于或等于35为阴性 12病毒中和试验(VN 2.1器材 12.1.1恒温CO培养箱 12.1.2倒置生物显微镜 12.1.396孔细胞培养板 12.1.4微量可调移液器及配套吸头 12.2试剂 12.2.1阳性对照血清FMDV感染动物或口蹄疫疫苗免疫动物血清,56C水浴灭活30 mln 12.2.2阴性对照血清:未接触过FMDV的动物血清,56C水浴灭活30min. 12.2.3待检血清;待检血清经56笔水浴灭活30min 12.2.4病毒FMDV分别适应于BHK-21或1BRRS-2单层细胞收获的病毒液测定TCID后,分装于小管，一70C保存备用 12
GB/T18935一2018 2.2.5细胞;BHK-21或IBRRs2传代细胞 12.2.6细胞维持液;Eagle'sMEM与含5%水解乳蛋白的Earle's液等量混合配成,pH7.67.8,在中和试验中作稀释液用 12.2.7细胞营养液;含10%犊牛血清的细胞维持液(pH7.4),培养细胞用 12.2.8细胞染色液;用10%福尔马林配制的0.05%亚甲基蓝溶液 12.3试验程序 2.3.1FMDVTCID,预测定;将FMDV在96孔培养板上作10倍连续稀释,即10-',10-',l0-" 10-l,每孔50AL病毒液,l00ML细胞悬液(细胞悬液的浓度以在24h内长满单层为度，一般每毫升 00万个150万个细胞),每个稀释度8孔每块板的最后一列设8孔细胞对照,每孔补加50L稀释液(不加病毒) 置37仑5%co温箱培养混察CP,72h时将板固定并作常规染色(先用10%桶尔马林固定30min,然后置于用10%福尔马林配制的0.05%亚甲基兰溶液中浸泡染色30min,最后将培养板用水冲洗) 未病变细胞呈蓝色,病变细胞脱落或不着色依据CPE情况,按ReeMuench法计算病毒TcID 2.3.2稀释血清;用细胞维持液将待检血清在培养板上从1;4开始作2倍连续稀释,每份血清至少平行稀释2排孔,每孔50L 2.3.3加人病毒;在上述每孔中加人50AL含100rcD的病毒液 12.3.4对照设立;每次试验每块培养板都应设立下列对照正常细胞对照;每块培养板上均设立24孔不接种病毒的正常细胞对照,每孔加人50AL 阴性对照血清;设24孔,每孔加50L 血清及50AL含100TCID的病毒液阳性对照血清;阳性对照血清与被检血清平行稀释如;2排孔),每孔加人50l含100TCID.的病毒液病毒对照;另设一块培养板测定本次试验中病毒的实际滴度(TcD),用以计算病毒的实际使用量 2.3.5中和反应;封闭培养板,37C培养1 2.3.6加人细胞;血清与病毒中和1h后,每孔加人50AL细胞悬液,置37C5%cO温箱培养对照孔体积不足150L时,用稀释液补全体积 12.3.7染色;48h后，显微镜下预先作适当判读第3天,将板固定并作常规染色 2.4试验成立条件正常细胞对照:在整个试验中应一直保持良好的生长形态,染色呈蓝色阴性对照血清;阴性对照血清孔应全部出现CPE,染色不着色阳性对照血清:阳性对照血清抗体滴度应在预期2倍以内病毒对照,根据试验中病毒的实际滴度(TCID.).计算病毒的实际使用量每孔使用的病毒量应在32TcID一320TcD范围内当以上对照均成立时,试验有效 2.5结果判定 2.5.1细胞层染色呈蓝色为阳性孔(病毒被中和),不着色为阴性孔(病毒未被中和),以血清能够中和 0%病毒时的稀释度为血清最终滴度被检血清最终滴度为145或更高者为阳性 12.5.2 12.5.3被检血清最终滴度低于1:16为阴性 2.5.4被检血清最终滴度在1:l61;32之间为可疑,需要重复试验,再次试验结果为l:16或更高时判定为阳性 13
GB/T18935一2018 3液相阻断酶联免疫吸附试验(LPB-ELISA 3.1器材同7.1 3.2试剂同7.2 13.3对照血清 3.3.1阳性对照血清;用与制备免抗FMDV抗血清抗原同源的FMDV灭活疫苗免疫正常牛制备的高免血清,预先测定其抗体效价同待检血清一起作同样稀释 13.3.2阴性对照血清:阴性对照血清来自健康牛,各型口蹄疫LB-ELISA抗体效价均小于1:4 13.4试验程序 13.4.1ELISA板每孔用50AlLpH9.6碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的兔抗血清包被,封板膜封板,置室温过夜 13.4.2洗涤:每孔中加满洗涤缓冲液,放置30s后弃去,重复洗涤6次后在吸水纸巾上拍干酶标板 3.4.3在“U”型96孔稀释板内,按50AL/孔的量用样品稀释液将待检血清从1;4开始做2倍连续稀释,每份待检血清都做2个重复,然后向每孔内加人相应的50L同型病毒抗原,封板混合后置4过夜或37C孵育1h 加人病毒抗原后血清的实际稀释度变为从1:8开始的2倍连续稀释度 3.4.4用洗涤缓冲液洗ELISA板6次,将各孔血清/抗原混合物从稀释板转移至兔抗血清包被的 ELISA板中,每孔50L,封板,37C孵育1h 13.4.5洗ELISA板6次,将与试验抗原同源的豚鼠抗血清用样品稀释液稀释至预定的最佳工作浓度每孔50AL,封板,37C孵育1h 3.4.6洗ELISA板6次,每孔加50AL用酶标抗体稀释液稀释的兔抗豚鼠lgG辣根过氧化物酶结合物,封板,37C孵育1h 13.4.7 洗ELISA板6次,每孔加50ALTMB底物溶液 37C温育15min后每孔再加50l 1.25mol儿硫酸终止反应,混匀后在酶标仪450nm下判读结果对照设立;每次试验,每块板设8孔连续2倍稀释的阳性血清对照,2孔连续2倍稀释的阴性血 13.4.8 清对照,设4孔抗原对照,抗原对照不加血清稀释液 13.5试验成立条件病毒抗原对照至少两孔ODo值应在1.02.0范围内;阳性血清对照抗体滴度应在1;512 :2048之间;阴性血清对照抗体滴度应小于1:4 3.6结果判定 13.6.1以病毒抗原对照ODM平均值的1/2为临界值,被检血清稀释孔OD0值大于临界值为阴性孔,小于或等于临界值为阳性孔抗体滴度以50%终点滴度表示,即该稀释度50%孔的抑制率大于抗原对照孔抑制率的50% 13.6.2被检血清抗体滴度大于或等于1:128判为阳性被检血清抗体滴度小于164判为阴性被检血清抗体大于或等于1:64并小于1:128判为可疑,可疑样品经再次测定后,如果有一个滴度为 1:64或更高可判为阳性 14
GB/T18935一2018 14固相竟争酶联免疫吸附试验(SsPC-ELISA 14.1器材同7.1 4.2试剂 14.2.1检测抗体;口蹄疫型特异性HRP标记的单克隆抗体,用样品稀释液稀释至最佳工作浓度 14.2.2其余试剂同7.2 14.2.3 对照血清;同13.3 14.3试验程序 4.3.1酶标板每孔用50LpH9.6碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的兔抗血清包被,封板膜封板,置 C过夜 14.3.2用洗涤缓冲液洗板5次 14.3.3酶标板每孔用50ALpH9.6碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的FMDV灭活抗原,封板膜封板,置 C过夜 14.3.4用洗涤缓冲液洗板5次 14.3.5在“U”型96孔稀释板内,按50Al/孔量用样品稀释液将待检血清从1:4开始做2倍连续稀释,每份待检血清都做2个重复,然后整体平移至已包被抗体抗原复合物的ELIsA反应板中向每孔内加人相应的50L同型酶标单抗工作液,封板混合后,置37C孵育30min 加人酶标抗体工作液后血清的实际稀释度变为从1:8开始的2倍连续稀释度 14.3.6洗板5次,每孔加50ALTMB底物溶液 37C温育15min后,每孔再加50AL2mol/L，硫酸终止反应,混匀后在酶标仪450nm波长下判读结果 14.3.7对照设立;每次试验,每块板设8孔连续2倍稀释的阳性血清对照、2孔连续2倍稀释的阴性血清对照,以及不加血清稀释液的4孔酶标单抗对照 4.4试验成立条件在酶标仪OD动波长处,测定酶标板的每孔光吸收值,求出每份被检血清和同板酶标抗体对照的平均光吸收值酶标抗体对照孔的OD值应大于1.0;阳性血清抗体滴度应在1:5121:2048范围内;阴性血清对照滴度应小于1:8 14.5结果判定 14.5.1以酶标抗体对照孔平均ODo值的60%为临界值,被检血清ODo值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔以阳性孔的最高稀释倍数为被检血清的抗体滴度 14.5.2被检血清抗体滴度大于或等于1;64判为阳性被检血清抗体滴度小于或等于1;32判为阴性被检血清抗体滴度介于l:32和1;64为可疑,需再次测定;若再次测定抗体滴度大于或等于1 64判为阳性,小于164判为阴性 15非结构蛋白3ABC抗体间接酶联免疫吸附试验(3Ac-I-ELIsA 5.1器材同7.1 15
GB/T18935一2018 5.2试剂 5.2.1阴性对照血清:无FMDV非结构蛋白抗体的健康牛、羊、猪血清 15.2.2阳性对照血清:FMDvV非结构蛋白3ABC抗体阳性的牛、羊、猪血清 15.2.3洗涤缓冲液;配方见B.6 5.2.425倍浓缩PBS缓冲液;配方见B.7 5.2.5兔抗牛、羊或猪IgGHRP酶结合物,使用时用血清稀释液稀释至工作浓度 15.2.6血清稀释液;配方见B.8 5.2.7TMB底物溶液;配方见B4.2 15.2.8终止液:0.3mol/L硫酸,配方见B.5.3 5.2.9纯化的3ABC蛋白:将基因工程表达、纯化复性的3ABC蛋白,用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被至酶标板,抽真空密封包装，4C保存备用 15.3试验程序 15.3.1血清稀释板每孔加人血清稀释液120AL,然后依次加人阳性对照血清,阴性对照血清和待检血清,每孔6AL(1:21倍稀释);标准阴阳性对照血清平行加两孔,待测血清加1孔留两孔不加血清作为空白对照,轻振混匀;然后,将稀释好的血清按对应的位置转移至包被3AC抗原的ELISA板上,每孔 100AL,用封口膜封口,37C结合30min 5.3.2去掉封口膜,每孔加满洗涤缓冲液,洗涤5次,最后一次拍干 100L用封口膜封口,37C结合30min. 15.3.3准备工作浓度的酶结合物,每孔加人 15.3.4去掉封口膜,每孔加满洗涤液,洗涤5次,最后一次拍干 15.3.5每孔加人100AL TMB底物,封口膜封口,37C避光作用10min~15min 显色过程中监测 OD. ,值接近0.7时终止反应每孔加人10L终止液(终止后测定阳性对照孔oD 0值应小于2.1. 15.3.6 15.3.7轻轻摇振混匀,测定波长450nm吸光值 15.4试验成立条件阳性对照平均OD0值应大于0.6;阴性对照平均OD动值应小于0.2. 15.5结果计算与判定 15.5.1样品效价=(oD.样品-oD,阴性对照)-(oD..阳性对照-oDm 阴性对照) 5.5.2被检血清样品效价小于0.2,判为阴性被检血清样品效价大于或等于0.3,判为阳性被检血清样品效价介于0.20.3之间为可疑;可疑样品复测效价大于或等于0.2,则判定为阳性 6非结构蛋白3ABC抗体阻断酶联免疫吸附试验(3ABC-B-ELISA 16.1器材同7.1 6.2试剂 6.2.1阴性对照血清,来自无FMDV抗体的健康动物 6.2.2阳性对照血清,来自FMDV感染康复动物,血清经灭活检验后无传染性因子存在 16.2.3弱阳性对照血清,来自FMDV感染康复动物,血清经灭活检验后无传染性因子存在 6.2.425倍浓缩PBS缓冲液;配方见附录B的B.7 16
GB/T18935一2018 6.2.53ABC蛋白捕获抗体,利用3A蛋白免疫小鼠制备的可特异性捕获3ABC蛋白的单克隆抗体 16.2.6酶标检测抗体贮存液,利用3B蛋白免疫小鼠制备的针对保守的免疫优势抗原表位的单克隆抗体,经辣根过氧化物酶标记后,用作检测抗体,通常用酶标抗体保存液配制为100倍工作浓度 6.2.7血清稀释液;配方见B.8 16.2.8ELISA用TMB底物溶液;配方见B4.2 6.2.9终止液,0.3mol/硫酸,见B.5.3 16.2.10捕获3ABC抗原反应板;饱和浓度的3A单克隆抗体包被酶标板,与基因工程表达、纯化复性的3ABC蛋白结合,干燥酶标板后,抽真空密封包装,4C保存备用 6.3试验程序 16.3.1取出密封的捕获3ABC抗原反应板,所有的试剂在使用前应先恢复至15笔25笔,通过涡旋振荡器轻振血清样品混匀 6.3.2加血清;每孔加人80L血清稀释液,然后依次加人20待测血清和阳、弱阳性与阴性对照血清待测样品加1孔,阴性、弱阳性与阳性对照血清平行加2孔,振荡混匀,封口膜封口,在15C 25笔条加下振荡孵育检测牛、羊血清时,孵育1h;检测猪血清时,孵育16h20h 小心去掉封口膜,每孔加约300L洗涤液洗板5次,最后一次拍干 16.3.3加酶标单抗;用血清稀释液1:100比例稀释100倍浓缩酶标单抗每孔加人100AL.封口膜封口,置15~25C孵育1h 小心去掉封口膜,每孔加约300L洗涤液洗板5次,最后一次拍干 16.3.4加底物每孔加人I00LTMB底物溶液,封口膜封口,置15C一25C避光孵育10min一l5nmim 16.3.5终止反应测吸光值;每孔加人100L终止液,在450nm测量和记录各样品和对照品的吸光值加终止液之前,可以测定oD.值,将OD.0值控制在0.50.6之间.保证最佳的检测效果,终止前OD,值约为终止后OD0值的1/3. 16.4试验结果有效性判定计算阴性,弱阳性与阳性对照血清平均oD 根据公式计算测试样本(弱阳性、阳性对照 16.4.1 n值血请与待测血请)阻断率(P),.P-(I一测试样本oD_值/阴性对照平均oDm-值)xI0% 16.4.2结果有效性判定阴性对照平均OD,o值应大于1.0;弱阳性对照血清阻断率应大于50%,阳性对照血清阻断率应大于70%,试验有效 16.5结果判定试验结果有效,被检血清样品P1值大于或等于50%,判定为FMDvNsP3ABC抗体阳性;被检血清样品PI值小于50%,判定为FMDVNSP3ABC抗体阴性 17 综合判定 17.1临床判定为疑似的易感动物,经第6章(病毒分离)分离出口蹄疫病毒,或经第7章(定型ELISA 检测出口蹄疫病毒抗原,或经第8章(多重RT-PCR),第9章(定型RT-PCR),第10章(病毒VP1基因序列分析),第11章(荧光定量RT-PCR)任一项检测出口蹄疫病毒核酸的,可判定为口蹄疫发病 7.2临床无明显特异症状的非免疫动物经第12章(VN),第13章(LPBELISA、第14章(SPC ELISA),第15章(3ABCIELIsA),第16章(3AIC-BELISA)任一项检测出口蹄疫病毒抗体的,或从免疫动物中检测出非免疫所致的口蹄疫病毒抗体的,可判定该动物曾经感染过口蹄疫病毒 7.3临床无明显特异症状的易感动物,采集0-P液或组织样品经第6章(病毒分离第7章(定型 ELISA,第8章(多重RT-PCR),第9章(定型RT-PCR),第10章(病毒VP1基因序列分析,第11章荧光定量RT-PCR)任一项检测出阳性的,可判定为口蹄疫带毒(潜伏感染或持续感染) 17
GB/T18935?2018 ? A 淶??) ???? A.10.1nmol/Lλ?(PBS,pH7.4) (NaCI) 85.00g (NagHPO 15,49g (NaH,PO) 2.03g 1000 ? ml ?(NaCI 80.0g ?KCl 2.0 g 30.0 (NaHPO12H,O) g 2.0 (KHPO. g 1000mL ?? A.20.04mol/LPEBS(pH7.4) 0.1mol/LPBS 400mL 600mL ?? 103kPa?30min,?4C? A.350%-PBS? nmol/LPBs??,pH7.4,?С?103kPa?30min. 0.04 ?4?档 A.40-P?? Eagle's-MEM?? 50mL 05%???/Eiale;? 50nml 5%?(NaHHcO.)pH7.6~7.8. A.5????? Eagle's-MEM A.5.1 10Eagle'MEM??;Eagle's-MEM?9.5g,??100.0mL?? ??10??1:10?,100mL??м900mL??м?? ???,4C汸á A.5.20.5%??/Earle's? (NaCI 6.8g ?KCl 0.4g ?(CaCl. 0.2g ?MgSO7H,O) 0.2g (NaH,POH.O) 0.14g 1.0g 10%? 2.0ml ?? 5.0g ?????,??1000mL,?4C汸á A.5.3??? 18
GB/T18935?2018 50mL Eagle's-MEM?? 50mL 0.5%??/Earle's? 5%?(NaHcO.)pH7.67.8. A.5.4??? 45ml Eagle's-MEM?? 45mL 0.5%??/Earle's? 10ml ?? 5%?NaHcO.)pH7.2~7.4 19
GB/T18935一2018 附录 B 规范性附录) 酶联免疫吸附试验用溶液的配制包被缓冲液;碳酸盐缓冲液(0.05mol/几Na.,co.-NaHco,pH9.6) B.1 A液:NagCO. 1.68g 燕水 400ml B液:NaHcO 2.86g 200mL 蒸馏水将400mLA液与150mLB液混合,调整pH至9.6,4C放置1个月有效 B.2样品稀释液[含0.05%(体积分数)吐温-20的0.01mol/LPEBS,pH7.2一7.4] Na;HPO12H.O 0.30g KHPO. 0.02g 0.80 NaCI g KCI 0.02 g 吐温-20 0.05ml 加蒸憎水至100mL B.3定型ELISA,液相阻断ELISA、固相竟争ELISA洗涤缓冲液(0.002mol/LPBS，pH7.4士0.2) NaHPOH.O 0.60g KH.PO. 0.04 g NaCl 1.60g KCI 0.04g 加蒸水至1000ml B.4底物溶液 B.4.1oPD底物溶液 Na,HPO12H.o 1.84g 柠檬酸(C,H,O,分析纯 0.52g 0.05只邻苯二胺(OPD) 加去离子水100mL 分装成3mL/瓶,一20C避光保存使用前避光融化,每3mL上述溶液加15L3%双氧水 H.O.) B.4.2TMD底物溶液 200 A液TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) mg 100mL 无水乙醇蒸僧水加至1000ml B液磷酸氢二钠(NaHPO,分析纯 71.7g 柠檬酸(C,H,O,分析纯) 9.33g 6.4m 0.75%过氧化氢尿素加蒸僧水至1000ml.,调整pH至5.0~5.4 将底物溶液A和底物溶液B按1:1混合,现配现用 B.5终止液 B.5.11.25mol/几硫酸取68ml分析纯浓硫酸缓慢加人到932mL去离子水中,分装室温保存 20
GB/T18935?2018 B.5.22mol/ ll6mL??884ml??,?±档 B.5.30.3mol/1 16.6mL??983.4mL??,?±档 B.6NSP3ABC/ELISA??? NaCl 8.0g KC 0.2 g KH,PO. 0.2 g 2.9 NaHPO12H,O g 0.5mL -20 ?1000mL,pH7.4 B.725?λ?(25PBS) 200.0g NaCI 5.0 KCl g NaHPO12HO 72.5 8 KH,PO 5.0" ??1000mL103kPa?30 ,±汸á min B.8NsP3ABC/ELISA??? ? 100ml ? 2.5g 0.l g 40.0mL 25?λ? ??????1000ml 21
GB/T18935?2018 ? 淶??) ? C.150TAE? ?(Tris) 242.0g 57.1mL 0.5mol/?(EDTA)(pH8.0) 100.0mL ??1000mL C.21TAE? ??50TAE50??ɡ C3?? ? 0.25g 30.0 m ?? 70.0mL 22

口蹄疫诊断技术GB/T18935-2018

口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的急性传染病，对牛、猪、羊等偶蹄动物具有极强的传染性，因此对口蹄疫的快速检测和确诊显得尤为重要。现在，GB/T18935-2018已经成为我国口蹄疫诊断领域的标准，该标准规定了口蹄疫的诊断方法和技术要求，有效提高了口蹄疫的诊断准确率和检测效率。

GB/T18935-2018的主要内容

GB/T18935-2018主要包括以下几个方面：

样品采集和处理：标准中详细规定了采集样品的方法、样品的保存和运输条件，以及如何处理可能受到污染的样品。
检测方法：标准中规定了口蹄疫病毒的检测方法，包括病原学检测和血清学检测。
技术要求：标准对检测设备、试剂盒、检测人员等方面提出了具体的技术要求。

GB/T18935-2018的优势

相较于之前的口蹄疫诊断技术，GB/T18935-2018具有以下几个优势：

快速性：新技术能够在较短的时间内进行样品检测和结果分析，大大缩短了检测周期。
灵敏度：新技术的灵敏度高，能够检测到更低浓度的病毒，并且可以针对不同种类的口蹄疫病毒进行检测。
专属性：新技术具有更强的专属性，可以区分其他相关病毒和细菌，减少了误诊率。

总结

GB/T18935-2018是我国目前口蹄疫诊断技术的标准，对于口蹄疫的快速检测和确诊具有重要作用。随着技术的不断发展，我们相信口蹄疫的诊断技术将会更加完善，并且能够更好地服务于人类。