国家标准 GB/T18638一2021 代替GB/T18638一2002 流行性乙型脑炎诊断技术 DiugmostictechmiqesforJapaneseeneephalitis 2021-03-09发布 2021-10-01实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花警理委员会国家标准
GB/T18638一2021 目次前言引言范围规范性引用文件缩略语临床诊断实验室诊断样品采集及处理病毒分离鉴定病毒RT-PCR检测方法补体结合试验检测方法血凝抑制试验检测方法 1C 间接ELISA抗体检测方法间接免疫荧光试验(FA)检测方法 13 12病毒中和试验检测方法 13综合判定 16 附录A(规范性附录)病毒RT-PCR检测方法试验用试剂配制 17 附录B(规范性附录补体结合试验检测方法和血凝抑制试验检测方法用试剂配制 18 附录c规范性附录)补体结合试验检测方法的预备试验 20 附录D(资料性附录)补体结合试验检测方法及血凝抑制试验检测方法结果判定示意图 23 附录E规范性附录间接ELISA抗体检测方法试验用试剂配制 24 附录F规范性附录)间接免疫荧光试验(IFA)检测方法试验用试剂配制 26
GB/T18638一2021 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准代替GB/T18638一2002《流行性乙型脑炎诊断技术》,与GB/T18638一2002相比,除编辑性修改外,主要技术变化如下增加了“规范性引用文件”见第2章); 增加了“缩略语”(见第3章); 增加了“病毒RT-PCR检测方法”见第7章); 增加了“间接ELISA抗体检测方法”(见第10章); 增加了“间接免疫荧光试验(IFA)检测方法”见第11章) 增加了“病毒中和试验检测方法"(见第12章). -增加了病毒RT-PCR检测方法试验用试剂配制见附录A) 增加了补体结合试验检测方法及血凝抑制试验检测方法结果判定示意图(见附录D) 增加了间接ELISA抗体检测方法试验用试剂配制(见附录E) -增加了间接免疫荧光试验(IFA)检测方法试验用试剂配制见附录F) 本标准由农业农村部提出本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(S.Ac/TC181)归口本标准起草单位军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所、温州大学、华中农业大学、吉林本标准主要起草人:;金宁一、肖朋朋、鲁会军、曹胜波、黄少梅、张英、田明尧、李霄、李昌本标准所代替标准的历次版本发布情况为: GB/T186382002
GB/T18638一2021 引言流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis)又称日本乙型脑炎,是由流行性乙型脑炎病毒引起的一种蚁媒性人兽共患传染病马呈现脑炎症状,猪表现流产,死胎和睾丸炎,其他家畜和家禽大多呈隐性感染有明显的季节性,于夏、秋季多发本病分布很广,主要存在亚洲地区,给人畜健康和国民经济造成很大的危害和损失引起本病的病原体为流行性乙型脑炎病毒(Japaneseenceh haliisirus),该病毒属于黄病毒科 Faviviridae)黄病毒属(Flaiuirus),是一种单股RNA病毒,病毒粒子呈球形,有脂蛋白的囊膜,具有血凝活性,能凝集鸡、鸭、鹅及绵羊红细胞该病毒对外界抵抗力不强,对化学药品较敏感,常用消毒药都有良好的灭活作用,对胰酶、乙艇、三氯甲婉等亦敏感世界动物卫生组织(OIE)推荐采用病毒分离鉴定、免疫荧光试验,血凝抑制试验、补体结合试验、血清中和试验等方法进行诊断我国对该病的研究报道较多，目前比较常用的诊断方法仍是本标准规定的临床诊断、病毒分离鉴定,血凝抑制试验、补体结合试验,RT-PCR试验、间接LISA试验、间接免疫荧光试验和病毒中和试验进行病毒分离鉴定时,要求所有样品处理应在可保证生物安全的相应级别实验室内进行操作;处理样品使用过的容器、物品实验材料均应经有效消毒处理后方可运离实验室本标准的修订参考了oIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》2018版(ManualofDiagnostic TestsandVaceinesforTerrestrialAnimals,2018),并结合了我国相关技术研究新成果本标准的实施对提高流行性乙型脑炎的诊断和疫情预测水平,及时采取防制措施,保证人畜健康,将起到重要作用
GB/T18638一2021 流行性乙型脑炎诊断技术范围本标准规定了流行性乙型脑炎Japaneseencephalittis,JE)的临床诊断和实验室诊断的技术要求本标准适用于猪、马、骡、驴、牛、羊、狗、鸭、鹅和鸟等动物的流行性乙型脑炎的诊断和检疫规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求缩略语下列缩略语适用于本文件 BEBS碉酸盐缓冲液(boratebufferedsaline' FT补体结合试验(omplemeafsxationtesn) CPE细胞病变效应(eytopathiceffect) DEPC焦碳酸二乙酯diethylpyrocarbonate) DNA脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) iNT脱银核糖三确酸(dowribonudlesidetumiphophate) ELIsA酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay》) FITc异硫氮酸荧光素(luoresceinisothioeyanate) HR辣根过就化物陈horSd xidase perox apaneseencephalitisvirus 流行性乙型脑炎病毒(Ja im 磷酸盐缓冲液(phosphatebuferedsaline) RNA核糖核酸(ribonucleicaced) RT-PCR反转录-聚合酶链式反应(G transeription-polymerasechainreaction) reverse TCID50半数组织培养感染剂量(mediantissuecultureinfectivedose) 临床诊断 4.1易感动物猪、马、骡、驴,牛,羊、狗、鸭、鹅和鸟等多种动物均可被感染,其中猪的感染最为常见 4.2临床症状 4.2.1猪感染后出现发热,少数猪会出现神经症状怀孕母猪可引起流产,产死胎,公猪出现睾丸肿大， 4.2.2马感染后体温升高(39C一41C),出现神经症状沉郁或狂躁不安),姿势异常,走路摇晃或转圈,四肢呈游泳状态
GB/T18638一2021 4.2.3其他动物多为隐性感染,无明显临床症状 4.3病理变化 4.3.1感染猪病理变化流产胎儿脑水肿,皮下血样浸润肌肉似水煮样,腹水增多 4.3.1.1 4.3.1.2肝,脾、肾有坏死灶 4.3.1.3全身淋巴结出血,肺瘀血、水肿,子宫黏膜充血、出血和有黏液,胎盘水肿或见出血 4.3.1.4公猪睾丸实质充血、出血和小坏死灶,睾丸硬化,体积缩小,与阴囊粘连,实质结缔组织化 4.3.2感染马病理变化 4.3.2.1脑脊液增量,血管充血,脑膜下出血 4.3.2.2脑组织有不同形态的软化灶,脑神经细胞浓缩、变性、坏死,甚至有脱髓现象 4.3.2.3呈小胶质细胞增生反应,并呈卫星现象 -假嗜神经或嗜神经 4.3.2.4皮下组织轻度黄染,心冠脂肪胶样浸润,心内膜和心外膜有出血点,肾包膜下出血 4.4初步诊断 4.4.1易感动物出现上述临床症状和病理变化,可判定为疑似JEV感染 4.4.2确诊应采集样品进行实验室诊断实验室诊断样品采集及处理 5 5.1器材 5.1.1组织研磨器 5.1.2G5级玻璃滤器 5.1.3孔径0,454m的微孔滤膜 5.1.4注射器(0.2mL和10mL)及针头 5.1.5离心管(1.5mL和10mL). 5.1.6医用防护服 5.1.7灭菌玻璃瓶(10mL 5.2试剂 5.2.1汉克氏(Hank's)液 5.2.20.5%水解乳蛋白Hanlk's液 5.2.320000IU/mL青霉素液 5.2.4200004g/mL链霉素液 5.3样品采集 5.3.1生物安全措施样品采集的生物安全措施符合GB/T18088的规定 5.3.2脑脊髓液样品采集在流行性乙型脑炎流行早期和发病早期即病毒血症阶段),无菌采集动物的脑脊髓液,每头应不少
GB/T18638一2021 于1mL,穿刺部位在两骼连线中点稍下方第七腰椎间隙 5.3.3睾丸样品采集采集种公病畜的异常肿胀或萎缩)睾丸,切成小块,置于灭菌玻璃瓶 5.3.4病死动物脑组织样品采集应在病畜(包括流产死胎)死亡后3h内采取脑组织(选大脑皮质、脑干,中脑、海马回及桥脑)数小块,置于灭菌玻璃瓶 5.3.5血清样品采集无菌采集病畜血液,每头应不少于5ml,无菌分离血清,装人离心管中,加盖密封后冷藏或冷冻保存 5.4样品处理 5.4.1生物安全措施样品处理的生物安全措施符合GB19489的规定 5.4.2组织样品处理将采集的动物脑组织或睾丸组织在组织研磨器中充分研磨,加人青霉素500lU/mL 和链霉素 5004g/mL，加人0.5%水解乳蛋白Hank's液,制成10%悬液,4浸泡3h4h,3000r/min离心 30min，取上清液备用 5.4.3怀疑有污染的样品,可用0.45Am微孔滤膜过滤法处理病毒分离鉴定 6. 器材 6.1.1 25 cm细胞培养瓶 6.1.2吸管 6.1.3试管 6.1.4水浴箱 6.1.5恒温培养箱 6.1.6倒置显微镜 6.2试剂 6.2.17%碳酸氢钠液 6.2.21%胰蛋白酶液 6.2.31%盼红(中性)液 6.2.4最低必要成分培养液(MEM). 6.2.5小牛血清 6.3试验动物与细胞 6.3.1清洁级BALB/c小鼠(6g一8g)
GB/T18638一2021 6.3.23日龄乳鼠 6.3.3乳仓鼠肾细胞系(BHK-21) 6.3.4非洲绿猴肾细胞系(Vero) 6.3.5白纹伊蚊传代细胞系(C6/36) 6.4操作程序 6.4.1乳鼠分离病毒 6.4.1.1接种;5.3.2中采集的脑脊髓液和5.4.2中制备的上清液,取6g8g小鼠10只或3日龄乳鼠 1窝),用左手固定,在耳与眼之间用碘酒消毒,右手持吸取接种样品的0.5ml注射器在消毒部位刺人硬脑膜下,每只小鼠注射0.03nmL(或乳鼠0.01nmL) 然后用左手拇指及食指抓住小鼠头顶部皮肤,翻转左手,使小鼠腹部朝上,将其尾部夹在左手掌与小手指之间,消毒腹部,右手持注射器向腹腔内注人样品0.5mL或乳鼠0.2mL) 同时设健康对照,对照鼠按同法同剂量接种MEM培养液 6.4.1.2观察记录;接种12h以后,对小鼠(或乳鼠)进行连续观察健康对照鼠接种后应无异常表现若被检样品中含有JEV,通常在接种7d内,实验鼠出现JEV感染症状,表现为松毛、弓背、沉郁、震颤、绕圈、后肢麻痹,死亡 6.41.3盲传;若接种小鼠(或孔鼠)第一代96h后未见发病症状,则处死第一代乳鼠,拨5.4. 所述力法将小鼠(或乳鼠)脑组织制成1:5组织悬液,按6.4.1.1所述方法再次接种小鼠(或乳鼠) 如此盲传 3代 6.4.1.4收集发病死亡鼠,无菌解剖取鼠脑组织,按5.4.,2所述方法将乳鼠脑组织制成样品,置一70C 保存,用于病毒鉴定 6.4.2细胞分离病毒 6.4.2.1制备单层细胞:按常规法将传代细胞(BHIK-21、Vero或C6/36)分装在25cm'细胞培养瓶中每瓶分装细胞悬液5ml,细胞浓度应为2×10个/ml~3×10个/mL,37C培养48h 6.4.2.2接种细胞:5.3.2中采集的脑脊髓液和5.4.2中制备的上清液,或6.4.1.4中制备的鼠脑组织样本离心后取上清液,接种BHK-21、Vero或C6/36传代细胞每份样品接种2瓶细胞,另设对照细胞2 瓶接种前,先倒去细胞培养瓶中营养液,加人1ml已经处理好的病料液,37C吸附1h,用Hank's 液洗1次,再加人4m细胞维持液对照细胞不接种样品,倒去营养液后加4mL 细胞维持液,37 培养3d~5d 6.4.2.3观察和记录;若被检样品中含有JEV,通常在接种2d~3d后出现CPE,主要呈现细胞萎缩、脱落形成空斑对照细胞单层完好,细胞形态基本正常收获细胞液.置一70C保存,用于病毒鉴定 6.4.2.4盲传;如接种细胞第1代72h后未出现CPE,收获细胞/病毒液按6.4.2.2所述方法再接种生长48h的单层细胞进行盲传,即1ml第1代细胞/病毒液加4ml细胞维持液.7C培养如此盲传 3代 6.5病毒鉴定对发病死亡的小鼠(或乳鼠)和出现CPE的细胞培养液,选用病毒RT-PCR检测方法(第7章)通过核酸鉴定和分析进行病毒鉴定 6.6结果判定 6.6.1小鼠(或乳鼠)盲传3代无发病症状,细胞盲传3代未见细胞病变，且经6.5所述方法检测阴性者,判定为JEV分离阴性
GB/T18638一2021 6.6.2对发病死亡小鼠(或乳鼠)和出现CPE的细胞培养液,，经6.5所述方法检测阳性者,判定为JEV 分离阳性病毒Rr-CR检测方法 7.1器材 7.1.1台式高速(12000r/min)离心机 7.1.2基因扩增仪 7.1.3稳压稳流电泳仪 71水平电泳梢 7.1.5电泳凝胶成像分析系统(或紫外透射仪). 7.1.6成套可调移液器(量程范围0.5AL1000AL)及匹配的吸头 7.1.7带盖的塑料离心管 7.1.8无RNA酶的离心管与吸头 7.1.9PCR管 7.2试剂 7.2.1通用试剂 7.2.1.1变性液:6mol/L异硫氢酸肌或Trizol裂解液 7.2.1.2酚氯仿抽提液;苯酚-三氯甲炕-异戊醉(25;24;1)混合液 7.2.1.3异丙醇;分析纯 7.2.1.475%乙醇;无水乙醇(分析纯)与DEPC水按3:1配制而成 7.2.1.5DEPC水:将DEPC按0.1%体积分数)加人双蒸水(ddH.O)配制而成 7.2.2RT-CR试剂 0×一步RNAPCR缓冲液 7.2.2.1 7.2.2.2逆转录酶(AMV):5U/L 7.2.2.3 Nase抑制剂:40U/L 7.2.2.4优化的AMVTaq:5U/AlL mmol/L 7.2.2.5dNTP混合液;包括dATP,dTTP,dCTP,dGTP,各10 7.2.2.6MgCl;25mmol/L 7.2.2.7引物:PAGE纯度,在PCR反应体系中的终浓度各50pmol/L 7.2.2.7.1上游引物:5'-GACACTGGATGTGcCATTGAC-3' 7.2.2.7.2下游引物:5'-GGCATTcCTTTGTCTCAGGTC-3' 7.2.3 电泳试剂 7.2.3.1电泳缓冲液50×TAE贮存液(见附录A),临用时加蒸僧水配成1×TAE缓冲液琼脂糖;国产或进口的低熔点琼脂糖,制胶时用 7.2.3.2 7.2.3.3电泳加样缓冲液:含澳酚蓝0.25g、丙三醇(甘油)30mL、双燕水70m 7.2.3.4DNA分子质量标准;分子大小范围100bp1000bp,100bp梯度 7.3样品准备 7.3.1在生物安全柜中,将采集到的病料组织(如脑,死胎、睾丸)置乳钵中(冰上操作),剪碎,加灭菌石
GB/T18638一2021 英砂研磨;然后加0.04mol/LPBs(pH7.4)(见附录B中B.5)制成1;5的悬液;置4C冰箱过夜,再于 -20C -30C冻融2次,3000r/min离心10min ,取上清液作为检测材料 7.3.2液体样品(如脑脊液、病毒细胞培养物)可直接用于提取总RNA,而组织研磨液(若混有脂肪)在提取总RNA之前,需用等量酚氯仿抽提 7.3.3阳性对照样品:以已知病毒材料(如JEV感染乳鼠或细胞培养物)为阳性对照,与待检病料同时提取总RNA冰上操作),再进行定性RT-PCR,其扩增产物可作为电泳阳性对照样品 7.4操作程序 7.4.1总RNA提取 7.4.1.1在核酸提取室操作 RNA提取使用变性液手工提取,也可使用等效的商品化试剂盒 7.4.1.2取"个灭菌的1.5mL无RNA酶离心管,其中"为待检样品数十阳性对照十阴性对照,对每个离心管进行编号 7.4.1.3每管加人600AL变性液,再分别加人被检样品、阳性对照及阴性对照各200AL,颠倒10次混匀,最后加人200AL酚氧仿抽提液,涡旋振荡5s,4丫条件下12000r/min离心15min. 7.4.1.4将上层透明液体(约400L)转移到一个新的无RNA酶离心管中,加人等体积预冷的异丙醇每个离心管对应编号弃去上清液,沿管壁缓缓加人08mL75%乙醇颠倒3次一6次混 7.4.1.512000r/min离心15min 匀,12000r/min离心10min 反复洗涤两次后,将离心管倒扣于吸水纸上,自然晾干或用移液器移去残液 7.418加人20L.DERC水,轻轻混匀游解RNA 提取的RNA应尽快进行反转录扩增或放置于 -70冰箱保存 7.4.1.7提取过程中要注意交叉污染,移液过程每份样品都需更换吸头,不同样品离心管倒扣在吸水纸上不同位置 7.4.2一步法RI-PCR 7.4.2.1反应体系配制扩增体系配制如下 10×一步RNAPCR缓冲液 2.5 MgCl.(25mmol/L) 54L dNTP(各10mmol/IL 2.5L RNase抑制剂(40U/L 0.5L AMv(5U/L) 0.5L 优化的AMVTaq(5U/L) 0.5L 下游引物(50pmol/L) 0.54L 上游引物(50pmol/L) 0.5L DEPC水 12.5ML 7.4.2.2反应程序设置扩增程序设置如下 50,30min; a b 94C,5min: 94C,0s;55C,30s;72C,30s;30次循环 c
GB/T18638一2021 d72C,7min 7.4.3扩增产物电泳检测 7.4.3.1琼脂糖凝胶板的制备;称取1g琼脂糖,加人100mL1×TAE缓冲液中,加热融化后加5"l 10 nmg/mL)澳化乙锭,混匀后倒人放置在水平台面上的凝胶盘中,胶板厚5mm左右依据样品数选用适宜的梳子,待凝胶冷却凝固后拔出梳子胶中形成加样孔),放人电泳槽中,加1×TAE缓冲液淹没胶面 7.4.3.2加样;取6AL~8ALPCR扩增产物和2AL~3AL加样缓冲液混匀后加人一个加样孔每次电泳至少加1孔阳性样品的扩增产物作为对照同时加DNAMarker作分子量大小对照 7.4.3.3电泳:在电压80V100V或电流25mA40mA条件下电泳10min. 7.434凝胶成像;电汰结束后,取出凝胶板,置于紫外透射仪上打开紫外灯观张用性样品cR产物条带大小应为430bp,与阳性对照一致,同时阴性对照无条带 7.4.3.5DNA测序分析;将阳性样品PCR产物测序分析,验证阳性样品DNA条带是否属于流行性乙型脑炎病毒 7.5结果判定扩增产物的NA条带为480bp,与阳性对照一致.,同时阴性对照无条带;且测序分析验证为流行性乙型脑炎病毒,即判为阳性补体结合试验检测方法 8.1器材 8.1.1试管(7.5cem×1.0em) 8.1.2吸管(10ml、2mL、lmL) 8.1.3试管架 8.1.4水浴锅(37C一38C). 8.1.5离心机 8.1.6离心管 8.2试剂 8.2.1抗原;流行性乙型脑炎抗原和病毒阳性对照抗原 8.2.2溶血素;效价大于1:5000 8.2.3补体;取3只5只成年豚鼠新鲜血清混合而成 8.2.41%绵羊红细胞悬液;采集适量健康绵羊抗凝血,加人2.5倍一3倍体积的阿氏液(见B.1),可放于4C冰箱保存1个月用时取适量绵羊红细胞悬液,加人5倍10倍体积的生理盐水(见B.2),充分混匀,以2000r/min离心15min,弃上清液如此洗涤3次再加人5倍~10倍体积的生理盐水悬浮红细胞,充分混匀,以2500r/min离心15min,弃上清液,沉淀的红细胞以生理盐水配成1%红细胞悬液 8.2.5标准阳性对照血清 8.2.6标准阴性对照血清 8.2.7钙镁溶液:见B.3
GB/T18638一2021 8.3被检样品 8.3.1被检血清:;应于发病早期和病后第4周各采血1次,无菌分离血清,密封装人灭菌小瓶,2C 8 C保存或一20C长期保存操作过程中应避免污染,且须保证血清新鲜透明不溶血 8.3.2灭活处理:试验前应将标准阳性血清、标准阴性血清及被检血清进行灭活灭活时间均为 30 min 不同种类动物灭活温度存在差异,其中豚鼠56C,马58C60C,人、猴及小鼠60C,牛、水牛,山羊、狗、猪及仓鼠62C,骡和驴6364,家兔65C 8.4操作程序 8.4.1预备试验见附录C 8.4.2正式试验 8.4.2.1试剂的稀释 8.4.2.1.1将溶血素、抗原及补体按预备实验测定的结果进行稀释 8.4.2.1.2将灭活后的标准阳性血清、标准阴性血清及被检血清分别进行2倍连续系列稀释标准阳性血清稀释倍数要大于其标注效价,标准阴性血清一般作3个连续稀释梯度 8.4.2.2操作程序 8.4.2.2.1取3排小试管,每排6支,按照拟加人的抗原类型均分为3组,即流行性乙型脑炎抗原组、正常对照抗原组、钙镁溶液组 8. .4.2.2.2将倍比稀释的被检血清分别加人到对应的小试管中,具体操作程序见表1 8.4.2.2.3于各稀释度的血清中分别加人0.1mL抗原,即流行性乙型脑炎抗原、正常对照抗原、钙镁溶液 8.4.2.2.4于各管中加人补体0.2mL 8.4.2.2.5振荡摇匀,4C冰箱过夜感作 8.4.2.2.6于各管中加人致敏绵羊红细胞悬液0.2mL 8.4.2.2.7 37C水浴感作30min,而后对结果进行判定表1试验组滴加法试管号 l 血清稀释度 1;2 l:4 :8 l:16 1:32 1:64 被检血清 0.l 0.1 加人量/ml 0.1 0.1 0. 0.l 流行性乙型脑炎抗原(或正常对照抗原、 0.1 0.1 0.1 0.1 0. 0.1 钙镁溶液)加人量/ml 0.2 0.2 0.2 0.2 补体加人量/ ml 0.2 0.2 4 第一次感作 C冰箱过夜 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0,.2 致敏绵羊红细胞量/ml 第二次感作 37C水浴30min 十十十斗 +++ 十十十十结果判定示例
GB/T18638一2021 8.4.2.3对照 8.4.2.3.1标准阳性血清:按照8.4.2.2操作进行 8.4.2.3.2标准阴性血清;按照8.4.2.2操作进行 8.4.2.3.3血清抗补体稀释对照;按照表2操作进行 8.4.2.3.4红细胞对照;按照表2操作进行 8.4.2.3.5抗原对照;按照表2操作进行 8.4.2.3.6补体对照;按照表2操作进行表2对照组滴加法不同稀释度血清抗补体对照红细胞抗原补体对照组别对照对照对照 1 1;2 ;8 1:16 1:32 1;64 0.l 血清加人量/ml 0. 0.l 0.l 0,1 0,l 抗原加人量/ml 0,1 稀释液加人量/ml 0.1 0.2 0.l 0.l 0.1 0.l 0.l 0.4 0.l 补体加人量" ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 第一次感作 4笔冰箱过夜致敏绵羊红细胞量/mL 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 第二次感作 37 C水浴30min 结果判定示例 8.5结果判定 8.5.1 判定标准各对照组结果均成立时方可进行结果判定,否则应考虑重新采集血液或改用其他方法各对照组结果如下标准阳性血清;抑制溶血结果与已知效价相差土1个滴度" a b 标准阴性血清100%溶血(一) 血清抗补体对照组:100%溶血(一); d 红细胞对照组:不溶血(十+++); 抗原对照组:不溶血十十十+); f 补体对照组:50%溶血(十十). 8.5.2结果表示方法见C.3.2 血清效价以50%抑制溶血(+)为判定终点(溶血判定示意图见图Dl) 8.5.3结果判定:患畜恢复期血清比急性期血清的抗体滴度增长4倍以上,可诊断为JEV感染病畜单份血清抗体滴度1:16以上,结合临床症状,可诊断为JEV感染病畜 1:4可作为马骡感染的最低抗体滴度,重复试验仍达到l:4,结合临床症状,可诊断为JEV感染病畜血凝抑制试验检测方法器材 9.1.196孔V型微量血凝板 9.1.2多通道与单通道可调移液器及加样头
GB/T18638一2021 g.1.310ml无菌注射器 g.1.4天平(0.0001g. 9.1.5微型振荡器 g.1.6普通低速离心机 9.1.7离心管 9.2试剂 g.2.10.4%牛血清白蛋白pH9.0碉酸盐缓冲液(BBS);见B.4 9.2.2pH6.4的磷酸盐缓冲液(PBS);见B.5 9.2.325%的白陶土悬液见B.6 9.2.4鹅红细胞悬液,配制步骤如下鹅红细胞的采集和处理10mL针筒抽吸1.5mL抗凝剂,从鹅翅翼下静脉抽吸约8.5mL鹅 a 血,分装于2mL离心管,每管1mL b 加人高压灭菌过后的PBS至2mL,用1ml移液枪轻轻将鹅红细胞吹匀,500r/min,4C离心 5min,移除上清液 PBS重悬沉淀的红细胞,500r/min,4C离心15min,弃上清液重悬离心3次放置于4C 冰箱备用用1mL吸管在红细胞泥中吸取所需的红细胞,用pH6.4PEs配制8%的红细胞悬液,余下的 d 红细胞泥放置于4冰箱备用使用pH6.4PBs,将其作24倍稀释,制成0.33%的工作浓度的鹅红细胞悬液此红细胞悬液在4C冰箱中储存时间最长为三周在使用前,轻轻重悬红细胞,再用于血凝抑制试验血凝素,制备;JEV经C6/36培养一周,无菌条件下取细胞上清液,3000r/min,4C离心5min 9.2.5 取上清液,以鹅的红细胞测定其血凝效价用含0.4%牛血清白蛋白(sA)的pH9.0砌酸盐缓冲液(0.4%BBS)将JEV稀释至8个血凝单位，4C保存备用 9.2.6血清,处理步骤如下取无溶血、澄清的血清,经56C,30min灭活 a b) 取30L上述灭活血清,加人120l.0.4%pH9.0酬酸盐缓冲液(BBS),再加150l.25%的白陶土悬液室温作用20min,间歇振摇 1000r/min,4C离心30nmin,上清液即为10倍稀释的血清 c 吸出上清液加人新的离心管,用1/50体积的沉积鹅红细胞泥加人到血清中,轻轻吹打均匀,使 d 鹅红细胞能充分吸附血清中非特异性的凝血因子,冰浴或4C放置20min 800r/min,4C 离心10min,上清液即为处理好的待检血清(1:10). 9.3操作程序 g.3.1在96孔V型板第2行至第8行滴加4%的BBS25L/孔(按照表3操作进行). 9.3.2在第1至11列的第1、2,8孔滴加处理好的血清25AL/孔,第2孔倍比稀释至第7孔,弃去 25AL按照表3操作进行 9.3.3在第1至11列各孔加25AL8个血凝单位的乙脑病毒第12列的第1,2孔加8个血凝单位的病毒,从第2孔倍比稀释到第7孔,第8孔作为阴性对照孔;第12列的第1至第8孔各加25ML4% min30min BBS,使整块板的反应体积达到50L/孔盖上96孔板塑料盖,将血凝板放置于室温201 按照表3操作进行 9.3.4轻轻摇匀PBS稀释好的鹅红细胞悬液,每孔加人鹅红细胞50AL,盖上96孔板塑料盖,再置室温作用301 min45min或过夜后判定结果 10
GB/T18638一2021 表3微量血凝试验孔号 10 12 病毒 :16--1:32-1:64--:128--:256-:512-:1024-:2048对照 l;2- 稀释度生理 25 25 25 盐水加 25 25 25 25 25 25 25 25 25 人量/ml 病毒液 25 25 25 加人量 25 25 25 25 25 25 25 25 mL 0.5% 25 25 25 25 25 25 25 25 红细胞 25 25 25 25 加人量/ /ml 弃液体 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 量/ ml 结果十十开+十开+十十+十++++十十+十十++++十十+十观察 9.4结果判定 g.4.1判定标准 00%凝集(十十十十),呈薄膜状,凝集颗粒均匀分布整个孔底 9.4.1.1 9.4.1.275%凝集(十十十),孔底有红细胞呈滴状,周围已形成膜状 9.4.1.350%凝集(十十),血滴周围有凝集颗粒,不呈膜状 9.4.1.425%凝集(十),血滴周围仅有少量凝集颗粒 g.4.1.50%凝集(一),呈圆滴状沉淀于孔底,无凝集颗粒 9.4.2结果判定参考判定标准(示意图见图D.2),患畜血清H效价达到1:16,同时50%红细胞发生凝集,判为 JEV抗体阳性 10间接ELISA抗体检测方法 10.1器材 10.1.1酶标仪(含630nm滤光片 0.1.2恒温孵育箱 10.1.3多通道连续移液器(规格300AL. 10.1.4 自动洗板机 10.15精确单道移液器(规格0.5AL~10L.10AL一200L和1ml~10mL). 10.1.6多道移液器(规格30Al300L) 0.1.7U底8×12孔血清稀释板 10.1.8计时器 11
GB/T18638一2021 0.1.9V底型加样槽 10.1.10量简(规格100ml和2000mL) 10.1.11其他不同规格标准吸头(与移液器配套》. 10.1.12 -次性PE手套 10.1.13封板膜 10.1.14吸水纸 10.2试剂血请稀释液,见附录E中EI1. 10.2.1 0.2.2PBS,见E.2 0.2.3碳酸盐缓冲液,见E.3 10.2.4PBST,见E.4 10.2.5封闭液,见E.5. 10.2.6底物液A,见E.6. 10.2.7底物液B,见E.7 0.2.8终止液,见E.8. 10.3血清样品准备 10.3.1样本的采集与处理采集动物血时,每只动物使用一个注射器建议进行前腔静脉或耳静脉无菌采血,不少于2ml 室温静置于斜面2h,待血液自然凝固后,置2C一8C冰箱中放置不少于2h,800r/min,4C离心 0 min 用移液器小心吸出上层血清 10.3.2血清样本的存放与运送血清样本若在 C条件下保存若超过一周检测,应置一20C以下冷冻一周内检测,可置2C8 保存运输时注意冷藏,确保样品有效采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输,运输时间应尽量缩短按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识 10.4抗原与抗体 10.4.1JEV灭活抗原 JEVsAI4142于单层BHK细胞上增殖,经甲醛灭活后离心除去细胞碎片.收集上清液后采用碗酸铵法对病毒进行浓缩,浓缩的病毒作为试验用抗原采用方阵滴定方法,选取P/N比值最大的所对应的抗原稀释度作为最终的使用浓度 0.4.2IHRP标记羊抗被检动物lgG 将其用PBST稀释至最适浓度 10,4.3阳性对照血清用乙脑活疫苗免疫正常被检动物制备的高免血清,测定其抗体效价后作为试验中的阳性对照血清同待检血清一起作同样稀释 0.4.4阴性对照血清阴性对照血清来自健康被检动物,间接ELISA抗体检测方法检测的OD,训值应<0.2 12
GB/T18638一2021 10.5操作程序 10.5.1抗原的包被:将灭活浓缩的乙脑病毒用包被液稀释后加到96孔酶标板中,100L孔,4放置 5h 10.5.2洗涤:弃去板孔中的溶液,加人稀释好的洗涤液200AL/孔,静置3min后倒掉,再在吸水纸上拍干,共计洗涤3次 0.5.3封闭;加人封闭液100L/孔,置37C下温育1h 10.5.4洗涤;方法同10.5.2 10.5.5加人待检血清:将待检血清、阴性对照血清及阳性对照血清用血清稀释液按照1:40稀释,将已稀释血清各取100L加至抗原包被板中,待检血清设1孔,阴、阳性对照各设2孔轻轻振匀孔中样品,置37C下温育30nmin. 10.5.6洗涤;方法同10,5.2,共计洗涤5次 10.5.7加酶标二抗;每孔加羊抗被检动物酶标二抗100AL,置37C下温育30min 10.5.8洗涤;方法同10.5.2,共计洗涤5次 10.5.9加底物;每个反应孔加人底物液A1滴(约50L)和底物液B1滴(约50L),混匀,置室温避光显色10min 10.5.10加终止液;待显色结束后每个反应孔中加人终止液1滴(约50L),l0min内测定结果 0.5.11结果测定;在酶标仪上采用630nm处的吸光光度值(OD训值)测定检测结果 10.6结果判定试验成立条件;阳性对照孔OD,0值均应>l.0,阴性对照孔ODn值均应<0.2 计算样品的 S/P值(S为样品ODw0n值，尸为阳性对照OD,0值平均值) 若S/P值0.21,判为被检动物JEV 抗体阳性;若s/P值<0.21,判为被检动物JEV抗体阴性间接免疫荧光试验(IFA)检测方法 1.1器材 11.1.1抗原片 1.1.2湿盒 11.1.3 恒温培养箱 1.1.4荧光显微镜 1.2试剂 1.2.1JEVSAl4-14-2株 1.2.2阴性和阳性血清 1.2.3待检血清缓冲甘油(见附录F中F.1) 11.2.4 11.2.5异硫氮荧光素(FITc)标记抗被检动物lgG(按说明稀释使用) 1.2.6磷酸盐缓冲液(PBS)(见F.2) 11.2.7 丙酮 11.3操作程序 1.3.1感染细胞的制备用含5%胎牛血清的DMEM培养基在37C和5%CO环境中培养BHIK-21细胞待细胞长满单 13
GB/T18638一2021 层时接种JEVSAl4-14-2株,并换成含2%胎牛血清的DMEM培养基,继续培养36h~48h 11.3.2抗原片的制备 1.32.1细胞榈变(细胞圆缩、破裂)约达0%一80%时收集细胞培养物,以sor/n离心 10nmin，弃上清液,用PBS洗涤细胞沉淀物3次,用PBS重悬细胞 1.3.2.2取10L细胞悬液,滴加于抗原片各孔中,同时制备正常细胞对照片 1.3.2.3吹干滴好的抗原片,用4C预冷的丙酮固定10min,保存于-20C,一周内使用 11.3.3间接荧光抗体染色 1.3.3.1取出抗原片室温放置10min待用 1.3.3.2用PBS将待检血清、阴性血清及阳性血清分别稀释成1:100和1:500两个稀释度,分别取 104L滴加于抗原片各孔中 11.3.3.3将加样抗原片置于湿盒内,37C孵育30min 1.3.3.4用PBS浸洗3次,每次10min. 1.3.3.5取20LFITC标记的抗被检动物Ig(G滴加于上述处理过的抗原片各孔中,孵育同11.3.3.3. 洗涤同11.3.3.4 11.3.3.6取缓冲甘油封片,置于荧光显微镜下观察 11.4试验成立条件 11.4.1未感染病毒细胞对照:正常细胞制备的抗原片中,加人阳性血清,细胞内无荧光颗粒阴性对照血请JEV感染细胞制备的抗原片中,加人阴性血清,细胞内无荧光颗粒 11.4.2 11.4.3阳性对照血清;JEV感染细胞制备的抗原片中,加人阳性血清,细胞内可见清晰的黄绿色荧光颗粒 11.4.4在以上条件成立的基础上,进行检验血清判断 11.5结果判定 JEV感染细胞制备的抗原片中,加人待检血清，细胞内可见清晰的荧光颗粒,判为血清中JEV抗体阳性 12病毒中和试验检测方法 12.1器材 12.1.1恒温cO 培养箱 12.1.2倒置生物显微镜 12.1.396孔细胞培养板(平底). 12.1.4单道微量加样器(0.5AL~10L2AL一20AL.20l一200L及200AL一1000)及吸头 12.1.5多道微量加样器(10L100AL和30AL一300L)及吸头 12.1.64C及一20C冰箱 2.2试剂阳性对照血清JEV感染动物或JEV疫苗免疫动物血清,56C水浴灭活30min. 12.2.1 12.2.2阴性对照血清;JEV中和抗体阴性血清,56C水浴灭活30min 12.2.3待检血清;待检血清经56C水浴灭活30min 2.2.4病毒:JEV接种于BHK-21单层细胞,收获的病毒液测定TCID后,分装于小管，一70笔保存 14
GB/T18638一2021 备用 12.2.5细胞:BHIK-21传代细胞细胞生长液.DMEM+5%胎牛血清十青霉素、,链霉素(终浓度为100U或1004g/mL.4C保存) 12.2.6 2.2.7细胞维持液;DMEM十2%胎牛血清十青霉素、链霉素(终浓度为100IU或1004g/mL,4C保存) 12.2.8细胞染色液;用10%福尔马林配制成0.05%亚甲基蓝溶液 12.3试验准备 12.3.1病毒增殖;在铺满BHIK-21单层细胞接种JEV,置于37C,5%CO恒温培养箱中孵育1h后，加新鲜细胞维持液,再置37C、5%cO恒温培养箱中培养,逐日观察,待CPE达到75%以上时进行病毒收获将收集的病毒在一70C和4C间反复冻融3次,无菌离心(2000r/min)20nmin,取上清液分装于1mL小管，！C保存备用 2.3.2毒价滴定;用含抗生素(1000U/mL青霉素和10004g/mL 链霉素)及5%血清的稀释液将 JEv作10,.10,I0',I0'.10'及10"稀释,然后接种6孔微量板,每个稀释度接种&孔,每孔 25AL，每孔再补加25L细胞生长液每孔人BHK-21细胞悬液(使用浓度3.0×10个/mL)50AlL 同时设置8孔细胞对照,即用50L细胞生长液十50AlBHK-21细胞悬液将96孔细胞培养板置于 7C,5%cO的恒温培养箱内,连续观察7d,在细胞对照成立的前提下,记录结果,按细胞半数感染量方法计算病毒的每25L中所含TcCD 2.3.3病毒工作液的配制;将待检病毒用细胞生长液稀释为每25AL含100个~l000个TCID作为病毒工作液 12.3.4血清准备阳性血清、阴性血清和待检血清经5630min灭活后,自1:2倍比稀释至1:32. 2.4操作程序 12.4.1将10-',10-?、10-,10-、I0-及10-"稀释的JEV和待检血清等体积混合后置37笔恒温培养箱内孵育1h或4C冰箱孵育过夜 2.4.2将病毒和血清的混合液接种到96孔细胞培养板内,每组接种8孔,每孔50AL病毒和血清混合液,再向96孔细胞培养板内补加50AL.BHIK-21细胞 2.4.3置于37C,5%CO恒温培养箱内,并连续观察细胞状态7d 12.4.4 每次试验每块培养板都应设立下列对照细胞正常对照;每块培养板上均设立2孔一4孔不接种病毒的正常细胞对照,每孔分别加人 50L不含病毒的培养液和50AL BHK-21细胞 b 阴性对照血清;设8孔,每孔加人1:2或1:10稀释的阴性血清和病毒混合液50AL,立即补加.50l.BHK-21绷胞悬液阳性对照血清:设8孔,每孔加人1:2或1:10稀释的阳性血清和病毒混合液50AL,立即补加50BHK-21细胞悬液; 病毒对照;取病毒工作液,用细胞生长液作10-1、10-、10-及10-'四个稀释度,每个稀释度 8孔，每孔25AL,加50L细胞悬液,补生长液25L达到总量100L 12.4.5染色:7d后将96孔细胞培养板固定并作常规染色 2.5试验成立条件 12.5.1正常细胞对照在整个试验中应一直保持良好的生长形态,染色呈蓝色 2.5.2阴性对照血清:阴性对照血清孔应全部出现CPE,染色不着色 2.5.3阳性对照血清;阳性对照血清孔应不出现CPE,染色呈蓝色 2.5.4病毒对照,应保证在1000个TcCID的病毒液10-'和10-"稀释度的各个孔均出现CPE,10- 有1个3个孔出现CPE,l0-'有8个孔全无CPE 15
GB/T18638一2021 12.6结果判定 12.6.1细胞层染色呈蓝色为阳性孔(病毒被中和),不着色为阴性孔(病毒未被中和),以血清能够中和 50%病毒时的稀释度为血清最终滴度 12.6.2被检血清最终滴度为1:4或更高者判定为阳性 2.6.3被检血清最终滴度低于1;4判定为阴性 2.6.4被检血清最终滴度在12和1:4之间判定为可疑,重复试验结果为1;4或更高时判定为阳性 13 综合判定 3.1使用临床诊断(第4章)可判定流行性乙型脑炎疑似感染,使用血凝抑制试验检测方法(第9章或间接ELIsA抗体检测方法(第10章)或间接免疫荧光试验(IFA)检测方法(第1章)或病毒中和试验检测方法(第12章)可对疑似感染样品进行筛查,如需确诊,可进一步使用病毒分离鉴定(第6章)或病毒RT-PCR检测方法(第7章)或补体结合试验检测方法(第8章) 13.2使用临床诊断(第4章)可判定流行性乙型脑炎疑似感染,可使用病毒分离鉴定(第6章)或病毒 RT-PCR检测方法(第7章)或补体结合试验检测方法(第8章)确诊流行性乙型脑炎病毒感染 3.3非免疫动物流行性乙型脑炎病毒抗体阳性排除母源抗体原因后可确诊曾经感染过流行性乙型脑炎病毒 16
GB/T18638?2021 ? A 淶?? RT-PCR?? 50TAE: ??(Tris) 242g ?(Na,EDTA2H,.O) 37.2g ??(H,O) 800ml (C,H,O. 57.1mL ??1000mL 17
GB/T18638一2021 录附 B 规范性附录) 补体结合试验检测方法和血凝抑制试验检测方法用试剂配制 B.1 阿氏液(用于补体结合试验检测方法和血凝抑制试验检测方法) 葡萄糖(CHO, 2.05g 柠檬酸钠(Na.CH.O2H.O) 0.8g 氯化钠(NaCI 0.42g 加双蒸溜水或无离子水至100mL,56kPa20min 高压灭菌 B.2生理盐水(用于补体结合试验检测方法和血凝抑制试验检测方法 8.5g 氯化钠(NaCl g 加双蒸溜水或无离子水至1000ml,l05kPa20min高压灭菌 B.3 钙镁溶液(用于补体结合试验检测方法 10.0g 氧化镁(MgCl 6H.O) 4.0g 氧化钙(CaCl 2H.O) 加蒸馏水至100mL,105kPa20min高压灭菌 B.40.4%牛血清白蛋白plg.0碉酸盐缓冲液(BBSs)(用于血凝抑制试验检测方法母液1.0.05mol/儿研砂(NaB,O12H.o)溶液,砌砂5.2g,加双蒸僧水或无离子水至250ml. 母液H,0.2mol/几棚酸(HBo)溶液,棚酸1.2g,加双蒸溜水或无离子水至100mL 使用液;母液I132mL十母液I18mL十生理盐水460mL 配制后测定pH值,如不到9,.0,可加适量0.05mol/L酬砂溶液 105kPa20min高压灭菌临用前,在使用液中添加0.4%牛血清白蛋白 B.5不同pH值磷酸盐缓冲液(PBs) 母液I:1/15mol/I磷酸氢二钠(Na,HPO)溶液,无水磷酸氢二钠9.47g,加双燕僧水或无离子水至1000mL 母液I,1/15mol/儿磷酸二氢钾(KH,PO)溶液,磷酸二氢钾9.08g,加双燕僧水或无离子水至 1000mL pH5.8PBSs;母液18.0ml十母液II92ml十生理盐水566ml pH6.0PBS;母液I12.2mL十母液II87.8ml十生理盐水566mL pH6.2PBS;母液I18.6mL十母液I81.4m十生理盐水566 ml H6.4PBs,母液126.了ml十母液I73.3mL十生理盐水566 ml pH6.6PBS;母液I37.5mL十母液I62.5mL十生理盐水566 ml pH7.4PBS;母液180.8mL十母液II19.2mL十生理盐水566 ml 18
GB/T18638一2021 校正pH值后,105kPa20min高压灭菌 B.625%白陶土悬液用于血凝抑制试验检测方法取优质白陶土粉末25g,加pH7.4磷酸盐缓冲液至100ml,105kPa20min高压灭菌4C保存可用1个月临用前摇匀 19
GB/T18638一2021 录附 C 规范性附录) 补体结合试验检测方法的预备试验 C.1溶血素效价滴定 C.1.1溶血素的稀释吸取溶血素0.1ml(含50%甘油者用0.2nmL),加钙镁盐水9.9nmlL含50%甘油者加9.8mL),混匀后即为1:100的溶血素,然后取1:100溶血素1mL加钙镁盐水4mL.,即为1;500的溶血素再按表C.1进行稀释表C.1溶血素稀释液制备管号溶血素浓度溶血素量/ml. VBD量/mL 溶血素稀释度溶血素最终浓度 1:100 ;250 1:500 1.0 1.5 l:100 0.5 2.0 1:500 1:1000 l;100 1.0 9.0 1000 1;2000 D 1:1000 2.0 1.0 1500 1:3000 1;1000 1.5 1.5 l;2000 :4000 1:1000 l.0 1.5 2500 15000 1:1000 0.5 1.0 l:3000 1:6000 H 1:1000 0.5 14000 18000 1.5 C.1.2溶血素的滴定取一支1mL吸管,由高稀释度开始,将各管已稀释的溶血素吸到另一排小试管内,每管0.1mL,然后按表C.2依次加人补体、钙镁盐水及1%绵羊红细胞,摇匀后,置37C水浴中30 1,观察结果 min 表c.2溶血素的滴定管号稀释用补体浓度补体加人量/mL VBD量/ml 补体最终浓度 1:10 2.0 3.0 1:25 1:10 1.0 4.0 1:50 1;25 1.0 2.0 1:75 1:5o 1.5 1:100 1.5 1:25 0.5 2.0 125 1;50 1.0 2.0 150 1:25 0.5 3.0 175 1:100 1.0 1.0 l:200 1:5o 2.0 1:250 0,5 1:150 1.0 1.0 1:300 0 1:175 1.0 1.0 l:350 12 1:100 0.5 1.5 l:400 20
GB/T18638一2021 C.1.3溶血素单位计算能使红细胞完全溶解的溶血素的最高稀释度称为1个溶血素单位表C.1中的G管,即0.1ml 16000的溶血素含有1个单位试验中应用2个单位的溶血素即将溶血素稀释成1;3000,则 0.1ml中含有2个单位溶血素 C.2 补体效价滴定 C.2.1滴定方法;吸取补体0.1ml,加钙镁溶液4.9mL,即1;50稀释补体然后按表C.3的量,分别加人三排小试管中,再依次加人钙镁溶液、4个单位溶血素或1:5稀释抗原,混匀后,放37水浴中 30min，再加人致敏绵羊红细胞(1%绵羊红细胞悬液与等量2个单位溶血素相混合,放37C水浴中 5min)，摇匀后,放37笔水浴中301 min ,观察结果 n 表c.3补体效价的滴定补体加稀释抗原钙镁溶液致敏红细胞第二次 -次抗原类型管号结果举例人量/mL 加人量/mL 加人量/ml 孵育加人量/ml 孵育 0.05 0.25 不浴 0.l 0.2 0.08 0.,1 0.22 0." 微浴 0.10 0,1 0.20 0,2 微济病毒抗原 0.12 0,1 0,18 0,2 全溶 0.14 0,1 0,16 0,2 全溶 0,16 0.1 0,14 0,2 全溶 0,25 0.05 0,1 0,2 不溶 0.22 微游 0.l 0.08 0,2 正常脑放置37 放置37c 0.10 0.1 0.20 0.2 微溶组织对照水浴中水浴中 10 0.12 0.1 0.18 0.2 全溶 30min 30min 抗原 0.14 0.1 0.16 0.2 全溶 1 12 0.1 0.14 全溶 0.16 0.2 13 0.05 0.35 0.2 不溶 14 0,08 0,32 0,2 微溶微浴 1 0.10 0.30 0.2 盐水对照 0.12 0.28 0." 全溶 l 17 0.26 0.14 0,2 全济 18 0.16 0.24 0.2 全溶 C.2.2补体稀释倍数的计算;能使红细胞完全溶解的最小补体量为一个单位,正式试验和抗原滴定时都用2个补体单位计算方法如下 0.12ml的1:50补体为1个单位,2个单位补体应为0.24ml的1:50补体补体稀释倍数以数值x表示,按下列公式计算 21
GB/T18638一2021 XV X = 式中 x 2个单位补体稀释倍数的数值,为50 V. 滴加补体溶液的体积的数值,为0.2,单位为毫升(mL); V -含2个单位补体的溶液体积的数值,为0.24,单位为毫升(mL). 计算结果表示到小数点后两位 c.3病毒抗原效价的滴定 C.3.1 滴定方法 c.3.1.1按表C.4纵横排列试管,分别加人稀释的抗原和免疫血清各0.1ml,每管加人稀释补体 0.2mL.含2个单位) C3.1.2加抗原:除对照A5、A6,A8,A9孔外,各孔加待检样品25Al C3.1.3加补体:除空白对照A9孔外,各孔加补体工作液50!L C3.1.437C振荡60min min 备 C.3.1.5制备敏化红细胞和加样;2.8%红细胞悬液与溶血素工作液等体积混合,25C敏化20 反应孔加25AL孔 C.3.1.637C振荡30n min,l000r/min离心301 m1n 表C.4微量补体结合试验抗原类型正常脑组织对照抗原病毒抗原盐水对照孔号 A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4 A5 A6 B7 A8 A9 血清稀释度 l:81:121:181:271:8 :121:181:271:81:8 25 25 缓冲液加人量/AL 25 25 25 25 25 25 25 50 100 50 50 5050 50 50 50 高免血清量加人量/L 25 N25 25 弃50 弃50 25 25 25 25 25 25 25 25 25 被检抗原加人量/l. 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 补体加人量/L 50 50 第一次孵育 37振荡60min 25 25 25 25 25 敏化红细胞加人量/l 25 25 25 25 25 25 25 25 第二次孵育 37C振荡30min 结果 ”完全溶血,"十+十+”完全不溶血,“十+"50%溶血注 C.3.2结果判定完全抑制溶血者为“十十十+”,50%抑制溶血者为“十+”,完全不抑制溶血者为“一与最高稀释度免疫血清发生100%抑制溶血的抗原,其抗原的最高稀释倍数就是抗原的效价正式试验时须用较高浓度(约4倍8倍)的抗原,一般用抗原原液的1:4或18稀释液 22
GB/T18638一2021 附录D 资料性附录补体结合试验检测方法及血凝抑制试验检测方法结果判定示意图图D1指示了判定补体结合试验检测方法结果的方法不溶血(+++ 50%溶血(++ 100%溶血(- 图D.1补体结合试验检测方法结果判定示意图图D.2指示了判定血凝抑制试验检测方法结果的方法 100%凝集(++++ 75%凝集(+++) 50%凝集(++) 25%凝集( 0%凝集(- 图D.2血凝抑制试验检测方法结果判定示意图 23
GB/T18638?2021 ? 淶??) ELISsA?? E.1??? (Na,HPO12H,(O) 0.30g" (KHPO. 0.02g ?(NaCI 0.80" ?(KCI 0.02 g -20 0.5 -20(Tween- ml ???(EBSA 5g ??100mL E.20.1mol/Lλ?(PBS,pH7.4) 8.0 ?(NaCI g 0.2g ?(KCI 1.42g (NaHPO12H.O) (KHP(O 0.2g ??(H.O 1000mL E.3?λ?(0.05mol/LNa.co,-NaHco,p9.6 ?(Na.cO. l1.59g ?(NaHco. 2.93g и?(H,O) 1000m E.4PBST -20(Tween-20) 0.5mL 1000ml λ?(1PBS) E.5? 0.30g" (Na,HPO12H,(O) (KH,PO 0.02g" 0.80g" ?(NaCI 0.02g" ?(KCI ween-20 0.5ml -20(Tw ???(EBSA 5g 24
GB/T18638一2021 加去离子水至100mL E.6底物液A 14.6 磷酸氢二钠(NaHPO12H.O) g 柠檬酸(C,H,O 9.33g 30%过氧化氢(H.O. 200AL 1000 蒸憎水(H,O) nL 调pH值至5.05.4 底物液B 20 3,3,5,5-四甲基联苯二胺(TMB mmg 10ml 无水乙醇(CH,O 加蒸水至1000mL E.8终止液 250ml 硫酸(HLsO 1000mL 蒸僧水(H.O) 25
GB/T18638?2021 ? F 淶??) ?(IFA)?? F.1 ????10.2mol/L?λ?(pH9.2)?ɡ P.2PBs(0.01mol/LpH7.4 8??(NaCl),0.2??(KCI),2.9?(Naa.HPO12H.O),0.2g (KH,PO.),??1000mL4Cá 26

流行性乙型脑炎诊断技术GB/T18638-2021

流行性乙型脑炎是由乙型脑炎病毒引起的急性病毒感染，常见于夏秋季节，主要通过蚊子叮咬传播。该疾病病死率较高，因此及早诊断十分重要。目前常用的诊断技术包括临床表现、实验室检查和影像学检查等方法。

临床表现

流行性乙型脑炎的临床表现多样，常见症状包括发热、头痛、恶心、呕吐、颈部僵硬等。在重症患者中，还可能出现意识障碍、抽搐和肌阵挛等症状。但是，该疾病的临床表现缺乏特异性，容易被误诊为其他感染性疾病。

实验室检查

实验室检查可以帮助确认流行性乙型脑炎的诊断。常用的检测方法包括血清学检测和脑脊液检测。

血清学检测

血清学检测是通过检测患者血清中的抗体水平来诊断流行性乙型脑炎。常用的检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光法（IFA）等。

脑脊液检测

脑脊液检测是诊断流行性乙型脑炎的最可靠方法之一。通常需要进行脑穿刺将脑脊液取出，然后通过核酸检测或病毒分离等方法进行检测。

影像学检查

影像学检查可以帮助确定流行性乙型脑炎的病变部位和程度。目前常用的检测方法包括计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）等。

GB/T18638-2021标准

为了提高流行性乙型脑炎的诊断准确性和标准化水平，新发布了GB/T18638-2021标准。该标准规定了流行性乙型脑炎诊断中的实验室检测方法和标准化要求。同时，该标准还对检测结果的判读和报告进行了详细说明，有助于提高流行

未来，随着医学科技的不断进步和发展，流行性乙型脑炎的诊断技术也将不断完善和更新。我们相信，在全社会共同努力下，一定能够有效控制流行性乙型脑炎的发生和传播，为人民群众的健康保驾护航。