GB/T37115-2018
鲍疱疹病毒病诊断规程
Protocolofdiagnosisforinfectionwithabaloneherpersvirus
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）65.020.30
- 实施日期2019-07-01
- 文件格式PDF
- 文本页数11页
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鲍疱疹病毒病诊断规程
国家标准 GB/T37115一2018 鲍疤疹病毒病诊断规程 Prot0colofdiagn0sisforinfectionwithabaloneherpersvirus 2018-12-28发布 2019-07-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/T37115一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
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本标准由农业农村部提出
本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TcC156)归口
本标准起草单位;深圳市检验检疫科学研究院、全国水产技术推广总站、深圳海关
本标准主要起草人:王津津、李清、余卫忠,刘、刘莹,史秀杰,郑晓聪、何俊强、于力、贾鹏、兰文升
GB/T37115一2018 鲍疤疹病毒病诊断规程 范围 本标准给出了鲍瘤疹病毒病的临床症状,规定了鲍疹病毒病组织病理学检测方法、实时荧光聚合 酶链式反应检测方法、聚合酶链式反应检测方法
本标准适用于鲍庖疹病毒病的流行病学调查、监测、诊断和检疫
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范 缩略语 下列缩略语适用于本文件
AbHV;鲍炮疹病毒(AbaloneHerpesvirus) CTAB;十六婉基三甲基澳化铵(CetyltrimethylAmmoniumBromide) C值;循环值(Cyclethreshold) EB:溴化乙锭(EthidiumBromidel EDTA:乙二胶四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid ymeraseChainReaction PCR:聚合酶链式反应(Poly quantitativereal-timePolymeraseChainReaction qPCR;实时荧光聚合酶链式反应(G 试剂和材料 4.1若非注明,本标准所用生化试剂均为分析纯的试剂
4.2若非注明,试验用水应符合GB/T6682一级水的规格
4.3Taq酶及10倍Taq酶浓缩缓冲液;Taq酶浓度为5U/L，一20C保存,避免反复冻融
4.4dNTPs;含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各10mmoL/I 4.5qPCR引物和探针: AbHVORF66Fl:5'-CCCGGACAcCAGTAAGAAC3 AbHVORF66R1:5'-AGGCTGCTATGCGTATGA-3 探针(AbHV66Prbl)5'-6FAM-TGGCCGTcGAGATGTcCATGTAMRA-3 扩增ORF66基因长度146p片段,用于荧光PCR
参见附录A AbHVORF77Fl:5'-AAcCACTTGTTcGGG;TTCT-3 AbHVORF77RI:5'-AGGGTGATTAATGCGG.AGT-3
GB/T37115一2018 探针(AbHV77Prb1):5'-6FAM-TcCGTACGcCGGGATCTTcGT-TAMRA-3 扩增ORF77基因长度190bp片段,用于荧光PCR
参见附录A 4.6内对照引物: 18sF1;5'-CGGCTACCACATcCAAGGAA-3" 18sRl5'-GCTGGAATTACCGCGGCT-3 探针(18srRNA);5'-6VICTGCTGGCACCAG.ACTTGCCCTCTAMRA-3" 扩增鲍18srRNA基因长度187bp片段,用于荧光PCR
参见附录A) 4.7PCR引物 AbHIV-16:5'-GGCTCGTTCGGTCGTAGAATG-3 AbHV-17;5'-TCAGcGTGTACAGATcCcATGT-C3 扩增片段大小为522bp558bp
参见附录A) 4.8电泳缓冲液
4.9琼脂糖
4.10组织切片制备和染色试剂见附录B) 器材和设备 5 5.1切片机
5.2显微镜 5.3荧光PCR检测仪和PCR扩增仪
5.4组织研磨器
5.5高速台式冷冻离心机
5.0 超低温冰箱、普通冰箱
5.7高压灭菌锅
5.8干燥箱
5.9生物安全柜
5.10凝胶成像仪 5.11电泳仪
5.12移液器 临床症状 参见附录C
采样 7.1采样对象 所有年龄段的易感鲍品种,包括有初期临床症状的鲍、濒死的鲍以及发病区域内的其他健康鲍 7.2采样数量 采样数量应符合sC/T7103的要求
GB/37115一2018 7.3样品采集 按GB/T18088的规定执行,取鲍含神经组织丰富的组织器官,包括脑神经节、侧足神经节等
8 组织病理学检测 8.1取样 取鲍的神经组织
8.2固定 迅速将组织用Davidson氏固定液(见B1)固定2h以上
根据组织块大小,固定时间可适当调整 或放置过夜,期间按需要更换一次固定液
临床样品也可用10%甲醛固定,长期保存
8.3切片 固定好的组织块用水充分洗涤,按下列程序处理;70%乙醉(60min)-85%乙醉(60nmin)-95%乙 醇(60min)--无水乙醇(2次.30min/次)-二甲苯十无水乙醇(体积比1:1)(30min)-二甲苯浸泡 2次,30min/次)-二甲苯十石蜡(体积比1:1)(15nmin)-石蜡(15min)两次-石蜡包埋-切片(根 据组织块大小和种类,各步时间作适当调整)
切片厚度不超过6m.
8.4切片处理染色 二甲苯(5min)--二甲苯十无水乙醉醇(体积比1:1)(3min)-无水乙醇(3min)->95%乙醇(3min) -一85%乙醇(3min)-70%乙醇(3min)-蒸僧水(5nmin)-苏木精60min)-伊红(5nmin)-燕憎水 (5min)-85%乙醇(5min)-95%乙醇(5min)-无水乙醇浸泡(2次,5min/次)-二甲苯十无水乙醇 (体积比1:1)(5nmin)-二甲苯浸泡(2次,5nmin/次)-中性树脂封片
8.5结果判定 用普通显微镜观察,观察到器官中结缔组织以及神经组织的坏死性病变可初步判定AbHV阳性
核酸鉴定 9.1样品处理 样品采取好运送到实验室后,在1.5mL 离心管中首先加人25mg一10mg组织,加人150小l CTAB溶液(见B.2),用组织研磨器将样品匀浆成糊状,再加CTAB溶液到900AL
混匀后置于25C 作用2h待用
9.2核酸抽提 取前处理好的匀浆组织约20mg放人1.5ml微量离心管中,加800AL抽提液I酚/三氧甲烧 异戊醉)(见B.3),充分混合30s;12000r/min离心5min,取上层水相;加700AL抽提液l(三氯甲烧 异戊醇)(见B.4),用力混合30s;12000r/min离心5min,取上层水相;加1.5倍体积-20C预冷的无 水乙醉醇,混匀后一20C过夜以沉淀核酸
15000r/min离心30 ,小心弃上清,立即用滤纸吸干应 min 尽量充分吸干),37C干燥20min或抽真空干燥;最后加10L水溶解后,作为模板待用
组织核酸提取也可采用等效的商品化核酸提取试剂盒,按照说明书进行操作
GB/T37115一2018 g.3设立对照 设立阳性对照、阴性对照和空白对照,以AbHV阳性组织核酸为模板作为阳性对照,以未感染Ab HV的组织提取核酸为模板来作为阴性对照,以等体积的灭菌水为模板作为空白对照
g.4qPCR检测 9.4.1qCR反应体系 在0.2mL.PCR薄壁管或八联管中,按每个样品10倍Taq酶浓缩缓冲液(见B.5)2.5L,dNTP 0.5L、Taq酶0.5AL模板2AL、上游引物(20mol/L)和下游引物(20Mmol/L)各0.5ML、TaqMan 探针(20mol/L)0.5AL,灭菌水18L配制qPCR检测体系
反应过程中应设立阳性对照、阴性对照 和空白对照
ORF66引物组和ORF77引物组均可用于AbHV的检测,l8s探针和引物是用来检测核 酸提取效率和定量PCR过程中有无抑制剂成分
9.4.2qPCR反应条件 95C2nmin后95C15s,60C1min反应45个循环
g.4.3内对照 将内对照引物18sF1、18sR1和探针18srRNA加人9.4.1反应体系中作为内对照
9.4.4结果判定 在18s内参扩增正常的情况下,当阳性对照Ct值<35,阴性对照和空白对照无Ct值时,实验成立
在实验成立的情况下,检测样品的Ct值>40时,判定为阴性;检测样品的Ct值<35时,判定为阳性;检 测样品的35
GB/37115一2018 g.5.4测序 取PCR产物进行基因序列测定,将测序结果与GenBank中参考序列(参见附录A)进行同源性 比对
9.5.5结果判定 在PCR扩增后阳性对照出现522bp558bp的DNA片段,阴性对照和空白对照均没有该核酸带 的情况下,待测样品PCR扩增后能在相应522bp558bpDNA位置上有带,且基因测序测定结果与 参考序列分析符合,可判定待测样品PCR检测结果为阳性;无带或带的大小不是522bp558bp的均 判为PCR阴性
10 综合判定 10.1疑似病例判定 符合下列条件之一者判定为疑似病例
-在养殖温度为19C左右,易感鲍类出现典型临床症状; 组织病理学观察到鲍神经组织病变
10.2确诊病例判定 符合10.1的情况,荧光PCR和PCR检测结果均为阳性,判定为确诊病例
GB/T37115一2018 附 录 A 资料性附录) 目的基因参考序列 CR方法检测目的基因参考序列 A.1 GGCTcGTTcGGTcGTAGAATGAAAATCTATCTGGA TTATACTCTcG TGAGTTACAAGTcCTTGTTCAATcGAGT GTTACAAGACCT AATcGAGTT TGTTCAATcGAGGTACAAG.A AAGACcTTGTTCcTm ACA AGCcTCCACGAACATGGTAGAATTGACACAAGC GAAGGCTTGCATGAGTCCGTCCTTGTCACTGGCCAGCATCACGATCTTGTTTGACATGGAT CTGTACAcGcTGA(558bp 参考序列病毒株:Abalone Vietoria/AUS/2009,GenBank:JX453331.l herpesvirus A.2qPCR方法检测目的基因参考序列 A.2.1AbHIvoRF66F1和R1引物扩增目的基因参考序列 TCCCGGACACCAGTAAGAACTTGTCCCTGCTCGCGCTGTAAATCACCTTGGAATCTTCC ATGGCCGTCGAGATGTCCATGGGTGAGTAGCACGTGCTGTTCTCGCTGTGTTTGATAACTT CCAGTCTCATACGCATAGCAGCCTTG146bp A.2.2AbHvORF77F1和R1引物扩增目的基因参考序列 CAACCACTTGTTCGGGTTCTCGACGACGAGTGTACATCCGTACGCGGGATCTTCGTAA AGTTCAAACTCGTGAGTCGTAACGGCCCTTCCTACT'TCGATCAAGACAGACCTGTCCTTCA GAGTGGCGTAAGGATCCCAAATCGAGATCACCAACCTGTCTTCGTCGTCAAACTCCGCATT AATCACCCTG(190bp A.2.3AbHIV18srRNAF1和R1引物扩增目的基因参考序列 CGGcTACcACATcCAAGGAAGGCAGCcAGGcGcGCAAATTAccCAATcTcGATAcCGAGG AGGTAGTG,AcGAAAAATAACAATAcGGGAcTcTTTcGAGGccCcGTAATTGGAATGAGTG TACTcTAAAcGTGTGCAcGAGGATCTATTGGAGGGCAAGTcTGGTGcCAGCAGccGcGGTA ATTcCAGc(187bp)
GB/T37115?2018 ? B 淶?? ? B.1Davidson's?? 95%? 330mL 200mL 115mL ? 335mL B.2CIAB? 2%CTAB,1.4mol/LNaCl,20.0mmol/LEDTA,20.0mol/LTris-HCl,pH7.5? ????0.25% B.3?I ?//?,1.0molLpH(7.9?0.2)Tis???''? 25;24:1?,????档 B.4?I ?/?,??24:1?,????档 B.5Taq?10?? Tris-HCI 500.0mmol/LpH8.8 KCI 500.0mmol/I TritonX-100 1% B.650?? Tris 242g Na,EDTA2H.o 37.2g ?800mL?,??; 57.1nml ? 1000ml 档
GB/T37115一2018 B.7 1×电泳缓冲液 20mL 50×电泳缓冲液 1000ml 加水定容至 室温贮存
B.8EB 用水配制成10mg/ml的浓缩液
用时每10ml电泳液或琼脂中加lL B.96×上样缓冲液 蔗糖 40g 加水溶解,定容至 100ml 溴酚蓝 0.25" 溶解后,C保存
GB/T37115一2018 录 附 C 资料性附录 鲍瘪疹病毒病 疾病描述 C.1 鲍瘤疹病毒病是由鲍庖疹病毒(AbHV)感染鲍的一种传染性流行病
2003年1月,台湾东北部的 养殖场和海域鲍均出现高死亡率,从病鲍体内检出瘪疹病毒,该事件或为鲍受抱疹病毒(鲍疤疹病毒)感 染的首个案例
2005年12月,维多利亚南海岸的鲍养殖场鲍大量死亡,受感染鲍伴有神经组织损伤 未分离得到病原
2006年1月,澳大利亚养鲍场鲍大量死亡,从病鲍神经组织检测到类疤疹病毒,首次 确定为鲍瘤修病毒疫情,其他国家的鲍种类亦可能受到影响
206年5月7日,首次在发精养鲍场附 近海域检出野生鲍因受鲍瘤疹病毒感染死亡;5月末,感染波及扩展到始发地的东部和西部海域
C.2 易感宿主 该病毒易感鲍种类包括杂色鲍
鲍疱疹病毒病诊断规程GB/T37115-2018解读
鲍疱疹病毒病是由鲍疱疹病毒引起的一种急性呼吸道感染病，临床上表现为高热、咳嗽、乏力、皮疹等症状。近年来，随着全球旅游业和国际贸易的发展，鲍疱疹病毒病也成为了国际公共卫生问题。
诊断指南
根据《鲍疱疹病毒病诊断规程GB/T37115-2018》，鲍疱疹病毒病的诊断主要包括流行病学史、临床表现和实验室检测三个方面。
流行病学史
鲍疱疹病毒病主要流行于夏季和秋季，易在集体生活场所传播。有关部门应加强对集体生活场所的管理，减少病毒的传播。
临床表现
鲍疱疹病毒病的早期症状与普通感冒相似，包括发热、头痛、喉咙痛等。随着病情的加重，还会出现咳嗽、胸闷、乏力、皮疹等症状。
实验室检测
鲍疱疹病毒病的实验室诊断主要通过核酸检测、血清学检测和病毒分离等方法进行。其中，核酸检测是目前最常用的检测方法，其敏感性和特异性都比较高。
实验室检测
鲍疱疹病毒病的实验室检测主要包括核酸检测、血清学检测和病毒分离等方法。
核酸检测
核酸检测是目前最常用的鲍疱疹病毒病实验室检测方法，其敏感性和特异性都比较高。核酸检测可以通过PCR扩增病毒的基因片段进行检测，也可以通过荧光定量PCR等方法进行检测。
血清学检测
血清学检测是检测患者体内抗体水平的方法，包括ELISA、蛋白微阵列等技术。血清学检测可以对病的早期感染进行诊断，但是在病毒感染初期，血清学检测的敏感性较低。
病毒分离
病毒分离是通过将样本接种到细胞培养物中，观察是否出现细胞变形和病毒复制等现象，来判断是否存在鲍疱疹病毒。病毒分离虽然具有较高的特异性，但其操作过程比较复杂、耗时、耗费资源，一般只用于疑难病例或研究目的。
临床表现
鲍疱疹病毒病的临床表现多样化，早期症状与普通感冒相似，包括发热、喉咙痛、鼻塞等。随着病情的加重，还会出现咳嗽、胸闷、乏力、皮疹等症状。
需要注意的是，部分患者可能没有明显的症状，或症状较轻微，这增加了鲍疱疹病毒病的传播风险。因此，及早发现并隔离病例，对于控制疫情具有十分重要的意义。
诊断标准
根据《鲍疱疹病毒病诊断规程GB/T37115-2018》，临床医生应该综合流行病学史、临床表现和实验室检测结果等多个方面，进行诊断判断。同时，在疫情高发期间，对疑似患者要及时进行隔离和诊断，并上报相关部门。
结论
鲍疱疹病毒病是一种急性呼吸道感染病，其症状多样化，严重时可导致死亡。在当前全球疫情的背景下，加强鲍疱疹病毒病的防控非常重要。为此，我们应该从流行病学调查、临床诊断和实验室检测等方面，全面加强疫情监测和防控工作，确保公共卫生安全。
