国家标准 GB/T33249一2016 纳米技术活细胞内金纳米棒含量测定消光光谱法 Nanotechnology一Quantifieatonofgoldmanorodsinlivingeels Extinetionspectroscopy 2016-12-13发布 2017-07-01实施国家质量监督检监检疫总局发布国家标准花管理委员会国家标准
GB/T33249一2016 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由科学院提出本标准由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归口本标雅起草单位;医学科学院基础医学研究所,国家纳米科学中心. 本标淮主要起草人;许海燕,吴晓春,张卫奇、纪英露、温涛
GB/T33249一2016 引言金纳米棒是由金原子构成的棒状纳米结构由于具有独特的物理化学性质,金纳米棒应用于生物医学检测、生物医学成像、肿瘤光热治疗和药物递送等方面当金纳米棒应用于上述生物医学领域时细胞内金纳米棒的含量是一个十分关键的指标,可以定量地反映其进人细胞的效率,对于新型纳米载体和造影剂的设计具有参考价值本方法基于金纳米棒的消光特性,应用消光光谱法快速测定金纳米棒在活细胞内的含量,同时还可以获得金纳米棒在细胞内的聚集状态信息
GB/T33249一2016 纳米技术活细胞内金纳米棒含量测定消光光谱法范围本标准规定了采用紫外/可见/近红外消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的方法本标准适用于定量测量活细胞内金纳米棒结构的含量,定量测量活细胞内其他棒状贵金属纳米结构的含量亦可参照本标准执行规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T24369.1一2009金纳米棒表征第1部分;紫外/可见/近红外吸收光谱方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1 消光光谱 extinctionspectrum 待测物质浓度和消光池厚度不变时,消光度(或消光度的任意函数)对应波长(或波长的任意丽数的曲线注，修改GB/T9721一2006,定义3.2. 3.2 表面等离激元共振surfaceplasmonresonanee;SPR 当人射电磁波照射到金属表面上时,金属中的自由电子在电场的驱动下相对于正离子的晶格以一定的频率发生相干振荡 [GB/T24369.1一2009,定义3.2 3.3 金纳米棒goldnanorods(AunNRs) 由金元素构成的纳米尺度的棒状颗粒,其在一个维度上的尺度与其他两个维度之比均大于1 在尺度较小的两个维度上的尺寸应介于1 nm100nm之间基本原理金纳米棒表面等离激元共振具有两个特征消光带，,根据紫外/可见/近红外吸收光谱方法(见 GB/T24369.12009)得到金纳米棒的消光光谱图,见图la),其中横向等离激元共振峰(1)在480nm~ 600nm之间,其峰面积与金纳米棒的浓度正相关;纵向表面等离激元共振峰(2)位于近红外光谱区,其峰位由金纳米棒的轴比、形状和外部介电环境决定体外活细胞的磷酸盐缓冲液(PEBS)悬液对峰1无
GB/T33249一2016 影响[图1b)曲线a],计算时作为背景曲线扣除后,就获得了细胞内金纳米棒的消光光谱 PBS和聚集状态基本上都不影响峰1 通过计算扣除背景后的横向表面等离激元共振峰面积得到细胞中的金纳米棒含量 0.20 0.16 0.8 0.12 0.6 0.08 0.04 0.2 0.0 0.00 400 600 800 900 1000 500 700 400 500 600 700 800 9001000 波长/nm" 波长/mm b 金纳米棒水溶胶的消光光谱人乳腺癌细胞(MIDA-MB-231)摄取金纳米棒前(曲线a),后(曲线b)的消光光谱说明实线曲线a; 虚线曲线b, 横向等离激元共振峰， -纵向等离激元共振峰图1金纳米棒的消光光谱仪器设备 nm999nm 具有测量消光光谱测量功能的酶标仪,波长扫描范围:400 使用前对酶标仪进行校准 6 制备金纳米棒的制备 6.1 金纳米棒的制备实例参见附录A 6.2PBS缓冲液称取8gNaCl,0.2gKCI、1.44gNagHIPO和0,24gKHPO,加超纯水定容至1000ml 所用试剂均为分析纯 6.3细胞悬液与金纳米棒孵育后,贴壁细胞用常规质舶消化,非贴壁细胞直接室温离心,弃上请液收获的细脑加人适量PHBS缓冲液洗涤3遍,用于细胞计数和后续的测定
GB/T33249一2016 测量方法 7.1 细胞计数利用细胞计数板计数不少于3次,取平均值 7.2测量步骤 7.2.1在酶标仪上设定波长范围,吸光度范围、扫描速度等测量参数向酶标板中加人与金纳米棒共同孵育后的细胞悬液200AL.未经金纳米棒处理的细胞悬液作为 7.2.2 扫描后扣除对照光谱,得到细胞中金纳米棒的光谱对照 7.2.3平行样品数不少于3个细胞内金纳米棒的计算峰面积计算方法 8.1 计算图2中阴影部分(峰l)的面积参照附录B 蜂面积 400 500 600 700 800 900 1000 波长/nm 说明横向等离激元共振峰; -纵向等离激元共振峰图2峰面积的计算 8.2细胞中金纳米棒含量模拟标准曲线的建立 8.2.1将未经金纳米棒处理的活细胞悬液计数,室温离心,弃上清液,加人超纯水,按常规方法制备细胞裂解液 8.2.2将显梯度浓度的金纳米棒游股分散于8.2.1的细胞裂解液中,测试体积为200AL,得到消光儿谱;扣除细胞裂解液的背景光谱参见8.1的方法计算峰面积,做标准曲线,见图3
GB/T33249一2016 y=0.119xX一0.037 胆=0,9999 30 40 20 50 60 细胞裂解液中金纳米棒浓度/(ug/mL 图3峰1面积与裂解液中金纳米棒浓度的标准曲线 8.3细胞内金纳米棒含量的计算根据标准曲线,计算出金纳米棒的含量,除以细胞总数,获得单细胞中金纳米棒的含量不确定度来源样品测试结果的标准不确定度来源包括但不仅限于;由测量平均值时重复性引起的不确定度、浓度校准、仪器校准、标准曲线的不确定度分量组成不确定度评定参见附录C 测量结果 10 10.1活细胞内金纳米棒定量测定实例参见附录B 10.2用电感耦合等离子体质谱(ICPMs)对消光光谱法进行验证参见附录D. 10.3消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的测试报告格式参见附录E
GB/T33249一2016 附录A 资料性附录金纳米棒制备实例 A.1金纳米棒水溶液的制备 A.1.1概述金纳米棒水溶液的制备采用种子调制的生长方法,分两步完成所用试剂纯度均为分析纯,所用水为超纯水,电阻率为18MQcm. A.1.2金纳米晶晶种的制备在30C下恒温水浴中向浓度为0.1mol/L 的十六烧基三甲基潦化铵水溶液中加人浓度为 10mmol/L的四氯金酸水溶液在搅拌的条件下再向上述混合溶液中加人浓度为0.01mol/L的放置于冰水浴中的棚氢化钠水溶液其中十六婉基三甲基澳化铵水溶液、四氧金酸水溶液和砌氢化钠水溶液混配的摩尔比为0.75:0.0025:0.006 搅拌该混合溶液2min后静置2h,得到含有金纳米晶的金晶种溶胶,所述金晶种溶液中金元素的浓度为0.25mmol/L A.13金纳米棒的制备浓度为0.1mol/L的十六烧基三甲基溴化铵水溶液中分别加人浓度为10mmol/L的四氯金酸水溶液和浓度为10mmol/L的硝酸银水溶液,混合均匀后加人浓度为0.1mol/L的抗坏血酸水溶液,称之为生长溶液向其中加人(A.l.l)中制备的浓度为0,25mmol/L的金晶种溶胶,置人30C下恒温水浴中水浴12h,得到含金纳米棒的金纳米棒溶胶其中,十六婉烧基三甲基嗅化铵水溶液、四氧金酸水溶液,硝酸银水溶液、抗坏血酸水溶液与金晶种溶胶混配的摩尔比为5;0.025;0.005;0.0275 0.000015 A.2聚二烯丙基二甲基氛化铵(PDDAc)包覆金纳米棒的制备按A1制备1L金纳米棒游胶.并在8800x后转速下离心了mn.去掉上清液加人1又聚装乙始碱酸钠(Pss)和0.176尽氧化钠定容到1L混合均匀将样品置于室温(20C一30C)下放置1天 2天,即可获得ss包覆的金纳米棒将上述所得ss包覆的金纳米棒,在860x 下离心10mint 去掉上清液,加人5mL质量分数为20%PDDAC溶液和o.170g化销,定容到1L,混合均匀将样品置于室温(20C一30C)下放置1天一2天,即可获得PDDAC包覆的金纳米棒
GB/T33249一2016 B 附录资料性附录活细胞内金纳米棒定量测定实例 B.1实验样品金纳米棒(AuNRs,长径比为4.2),以质量浓度为单位表示人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 B.2实验内容消光光谱法测定活细胞内金纳米棒的含量 B.3实验分析方法用软件将光谱曲线进行平滑处理,然后用软件确定峰1的起点和终点,连接两点形成一条线段,对横向峰与此线段围成的区域进行积分,即获得对应的峰面积见图2 取1.6×10'MDA-MB-231细胞接种于6孔板中,过夜培养细胞与84g/m浓度的ANRs孵育 12h,然后将细胞收集并重悬于PES中,经细胞计数仪计数并调整浓度至7.5×10/mL 取200AL细胞悬液(含细胞数1.5×10)加人到酶标板中,进行Uv-Vis-NIR光谱扫描未经AuNR、暴露的细胞作为对照样品扣除对照样品的消光光谱后,即获得了细胞内AuNR、的消光光谱 B.4测试条件 Bio-radTC10全自动细胞计数仪 BioTekSynergy4多功能酶标仪:波长扫描范围:400 nm~999nm;扫描速度:慢;波长间隔1 nm
GB/T33249一2016 B.5分析结果和表达方式 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 400 500 600 700 800 900 1000 波长/mm 注，图中阴影区域为峰面积图B.18g/ml金纳米棒与细胞孵育12h后,细胞内金纳米棒的消光光谱图由图B1计算出峰1面积为0.565,由图3的标准曲线得到对应的单个细胞内金纳米棒含量为 6.75" pg
GB/T33249一2016 c 附录资料性附录不确定度评定示例 C.1说明测量重复性引人的不确定度和标准曲线引人的不确定度评定示例 C.2测量重复性引入的标准不确定度u的评估测量重复性引人的标准不确定度u采用A类方法进行评定,关系式见式(c.,1) C.1 u T习一 m(n m 式中: -单次测量试验标准差; s(.r 给出测量结果时所作的测量次数; 给出单次测量试验标准差时的测量次数表示第i次测量值; U 为测量的平均值 c3标准曲线引入的不确定度标准曲线可表示为y=kc十b(e为金纳米棒的浓度,y为峰面积,k为标准曲线的斜率,为标准曲线的截距),则根据JF1059.1一2012中A.3.2,采用最小二乘法进行计算 (b)和=(b)为试验方差， r(h,)=s(b,k)/s(b)s(k)是估计的相关系数,其中s(6,)是估计的协方差 (习y)(习e2 习yc)(习ce n习y, 习y,)(习 1习c s(b s(k =n 习e r(b,k V/习C 习y一b一kc" 一n习(e D 式中: j=1,2,,n; =(习e,/" 则,当测试结果为云时,标准曲线引人的不确定度 =、(干、千2((r,5 4？
GB/T33249一2016 附录 D 资料性附录用电感稠合等离子体质谱(ICP\Is)对消光光谱法进行验证 D.1实验样品金纳米棒(AuNRs,轴比为4.2),以质量浓度表示人乳腺癌细胞系MDA-MB-231 D.2实验内容用电感耦合等离子体质谱(ICPMs)对消光光谱法测定活细胞内金纳米棒的含量进行验证 D.3实验分析方法取1.6X10MDAMB23绷胞接种于6孔板中,过夜培养绷胞与lp(/ml..2pe(/ml..生/ml. 84g/ml和164g/mlLAuNRs孵育6h.然后将细胞收集并重悬于PBS中,经细胞计数仪计数并调整浓度至7.5×10/ml 取200AlL细胞悬液(含细胞数1.5X10)加人到酶标板中,进行UV-Vis-NIR光谱扫描未经AuNR、暴露的细胞作为对照样品扣除对照样品的消光后,即获得了细胞内AuNR、的消光光谱用8.1的方法计算出峰面积用8.3的标准曲线转换为细胞中的金纳米棒含量另取200儿细胞悬液含细胞数15x10)转人聚四氟乙婚消解管中,加人3mL浓硝散(质量分数63%),6mL浓盐酸(质量分数37%)和1mL 双氧水原液(质量分数30%),于微波消解仪上消解将所得的液体定容至40mL,然后用电感糯合等离子体质谱仪测定金元素含量比较两种方法测定的细胞中金纳米棒含量 D.4实验结果消光光谱法测定的细胞内金纳米棒含量与ICP-MS方法的测定结果趋势一致,见图D.1 12 电感糊合等离子体质谱峰面积计算 10 6 12 培养基中金纳米棒浓度/(g/mL 图D.1消光光谱法测定细胞内金纳米棒含量与ICP-MIS方法比较
GB/T33249一2016 附录 E 资料性附录消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的测试报告格式消光光谱法测定活细胞内金纳米棒含量的测试报告报告编号委托者名称: 地址: 联系方式: 测试样品名称编号: 测试依据紫外/可见/近红外吸收光谱仪制造单位型号编号仪器检定/校准证书编号检定/校准结果样品的测试条件比色皿.: 温/湿度扫描波长范围扫描间隔" 扫描速度: 光谱带宽 6 测试结果原始谱图标准曲线图及其方程峰面积待测样品中金纳米棒的浓度测试机构测试人员:; 校验人员: 测试日期: 结构名称地址授权结构授权证书编号 10
GB/T33249?2016 [1] NikoobakhtB,EE-SayedMA.Chem.Mater.2003,15,1957 [1 MohamedMB,lsmailKZ,Links,EE-SayedMA.J.Phys.Chem.B1998,102,9370. C3]BroudeA,JliangXc.PleniMP.J.Phys.Chem.B2005.,109.,13138. [4]orendorfc.MurphyCJ.J.Plhys.Chem.B20o6,l0,3990. [[]Linlks,MohamedMB.E!SayedMA.J.Phys.Chem.B1999,1l03,3073. [6]YanBH,YangY,wangYc.J.Plhys.Chem.B2003,107,9159. [7 LinkS,El-SayedMA.J.Phys.Chem.B2005,l05,10531

纳米技术活细胞内金纳米棒含量测定消光光谱法GB/T33249-2016

随着纳米技术的不断发展，研究人员发现利用纳米材料可以达到更高的检测灵敏度和选择性。而金纳米棒作为一种重要的纳米材料，在生物荧光成像、癌症治疗等领域也有广泛应用。但如何精确地测定金纳米棒在细胞内的含量却是一个挑战。本文将介绍一种可行的测定方法：消光光谱法。

什么是消光光谱法？

消光光谱法是光学分析技术之一。它利用样品对入射光的吸收、散射和透射作用，测定样品中的物质含量。该方法在分析生物分子、纳米材料等方面得到了广泛的应用。

活细胞内金纳米棒含量测定方法

消光光谱法可以用来测定活细胞中金纳米棒的含量。首先需要将金纳米棒标记上一种荧光染料，使其能够被细胞摄取。然后将标记后的金纳米棒注入活细胞中，通过培养或转染等方法使其进入细胞。之后用消光光谱法测定样品对入射光的散射强度，从而计算出金纳米棒的含量。

国家标准GB/T33249-2016

为了推广消光光谱法在生物医学领域的应用，中国制定了国家标准GB/T33249-2016。该标准规定了样品处理方法、试验装置、测量程序、数据处理等内容，保证了测量结果的可靠性和准确性。

总结

纳米技术和消光光谱法的结合为活细胞内金纳米棒的含量测定提供了一种有效的方法。而国家标准GB/T33249-2016的制定则为该方法的推广和应用提供了保障。