GB/T31270.14-2014
化学农药环境安全评价试验准则第14部分：藻类生长抑制试验
Testguidelinesonenvironmentalsafetyassessmentforchemicalpesticides―Part14:Algagrowthinhibitiontest
- 中国标准分类号（CCS）B13
- 国际标准分类号（ICS）65.100
- 实施日期2015-03-11
- 文件格式PDF
- 文本页数11页
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化学农药环境安全评价试验准则第14部分：藻类生长抑制试验
国家标准 GB/T31270.14一2014 化学农药环境安全评价试验准则 第14部分藻类生长抑制试验 Iesgudelinsonenvirommentalsafety assessmentforchemicalpestieides Part14:Algugrowthinhibittiontest 2014-10-10发布 2015-03-11实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/I31270.14一2014 前 言 GB/T31270(化学农药环境安全评价试验准则》分为21个部分 -第1部分:土壤降解试验; 第2部分;水解试验; 第3部分:光解试验; 第4部分;土壤吸附/解吸试验 第5部分 :土壤淋溶试验; 第6部分:挥发性试验; 第7部分;生物富集试验; 部分;水-沉积物系统降解试验; 第 鸟类急性毒性试验; 第 10部分:蜜蜂急性毒性试验 部分:家蚕急性毒性试验; 部分:鱼类急性毒性试验; 第 部分;蚤类急性活动抑制试验 部分:藻类生长抑制试验; 15部分;蚯蚓急性毒性试验; 第 16部分;土壤微生物毒性试验; 第 部分天敌赤眼蜂急性毒性试验， 第 17 第 18部分;天敌两栖类急性毒性试验; 第19部分:非靶标植物影响试验， 第20部分;家畜短期饲喂毒性试验 第21部分;大型甲壳类生物毒性试验 本部分是GB/T31270的第14部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
本部分由农业部提出并归口 本部分负责起草单位;农业部农药检定所、环保部南京环境科学研究所 本部分主要起草人;曲赘费、杨亚哲、瞿唯钢、周军英,李学锋,查金苗,严海娟
GB/I31270.14一2014 化学农药环境安全评价试验准则 第14部分:藻类生长抑制试验 范围 GB/T31270的本部分规定了藻类生长抑制试验的材料、,条件,操作,质量控制、数据处理,试验报 告等的基本要求
本部分适用于为化学农药登记而进行的藻类生长抑制试验,其他类型的农药可参照使用
本部分不适用于易挥发和难溶解的化学农药
术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
2.1 半效应浓度medianerreetiveconeentration" 在生长抑制试验中,使供试生物生物量增长或者生长率比对照下降50%时的供试物浓度,用BC 表示
在本部分中,通过藻类生物量增长的抑制百分率计算而得到的半效应浓度用E,Ca表示,通过藻 类生长率的抑制百分率计算而得的半效应浓度用E,C表示
注:单位为mga.i./L 2.2 平均生长率averagegrowthrate -定暴露时间内藻类单位生物量增长的对数值,在本部分中用从表示
2.3 生物量增长yield -段暴露时间内藻类单位生物量的增加量,即暴露结束时的单位生物量减去暴露开始时的单位生 物量,在本部分中用Y表示
2.4 供试物 testSubstance 试验中需要测试的物质
2.5 化学农药 dhemiealpestieide 利用化学物质人工合成的农药
其中有些以天然产品中的活性物质为母体,进行仿制、结构改造
创新而成,为仿生合成农药
同义间;有机合成农药synthetieorganiepestiede. [NY/T1667.1一2008,定义2.3.1] 2.6 原药technicealmaterial 在制造过程中得到的有效成分及杂质组成的最终产品,不能含有可见的外来物质和任何添加物,必 要时可加人少量的稳定别 -2008.,定义2.5.1 NY/T1667.2
GB/I31270.14一2014 制剂 formulatioproduct 由农药原药或母药)和助剂制成使用状态稳定的产品
[NY/T1667.2一2008,定义3.1] 2.8 有效成分active ingredlient;a.i. 农药产品中具有生物活性的特定化学结构成分
[NY/T1667.2一2008,定义3.1 参比物质 referencesubstances 在测试中为证实或否定供试物的某种特性或判断测试系统有效性而使用的化学物质或混合物
试验概述 本试验用供试物配制一系列不同浓度的试验药液,然后将试验药液与藻液混合后,连续72h观察 试验用藻的生长抑制情况,并求出半效应浓度ECa(72h)值以及95%置信限
试验方法 4.1材料和条件 4.1.1供试生物 esodesmussuspicalus)或羊 试验用藻推荐采用普通小球藻(Chorellavulsuris),斜生栅列藻(Des 角月芽藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)等
4.1.2供试物 农药制剂、原药或纯品
对难溶于水的农药,可用少量对藻毒性小的有机溶剂、乳化剂或分散剂助 溶,用量不得超过0.1mL(g)/L 4.1.3主要仪器设备 主要仪器设备如下 -酸度计; 血球计数板 分光光度计; 显微镜; 人工气候箱; 高压蒸汽灭菌锅; 玻璃器皿等 4.1.4培养基 推荐选择水生4号培养基培养斜生栅列藻,迭择BGlI培养基培养羊角月芽藻,选择BG11培养基 或sE培养基培养普通小球桌,上述培养基配方参见附录A
若使用其他培养基应同时提供培养基名 称和配方等信息;若使用其他藻种,应选择适宜的培养基,并同时提供培养基名称和配方等信息
GB/I31270.14一2014 4.1.5试验条件 试验环境温度21C24C(单次试验温度控制在士2C);连续均匀光照,光照强度差异应保持在 士15%范围内,光强4440lx一8880lx
4.2试验操作 4.2.1试验用藻的预培养 按无菌操作法将试验用藻接种到装有培养基的锥形瓶内,在4.1.5的条件下培养
每隔96h接种 -次,反复接种2次一3次,使藻基本达到同步生长阶段,以此作为试验用藻
每次接种时在显微镜下 观察,检查藻种的生长情况
4.2.2预试验 按正式试验的条件,以较大的间距设置若干组浓度,求出供试物使试验用藻生长受抑制的最低浓度 和不受抑制的最高浓度,在此范围内设置正式试验的浓度
4.2.3正式试验 在预试验确定的浓度范围内以一定比例间距(几何级差应控制在3.2倍以内)设置5个7个浓度 组,并设一个空白对照组,使用助溶剂的还应增设溶剂对照组,每个浓度组设3个重复
试验观察期为 2h,每隔24h取样,在显微镜下用血球计数板准确计数藻细胞数,或用分光光度计直接测定藻的吸光 率
用血球计数板计数时,同一样品至少计数两次,如计数结果相差大于15%,应予重复计数
依据试 验物质性质选择合适的技术方法
4.2.4限度试验 设置上限浓度为100mga.i./L,即在供试物达100mga.i./L时,未对藻产生影响
若供试物溶解 度小于100mga.i./L,则采用其溶解度上限作为试验浓度
对照组和处理组至少设置6个重复,并且 对浓度组和对照组进行差异显著性分析比如/检验
参比物质试验 4.2.5 为检验实验室的设备、条件、方法及供试生物的质量是否合乎要求,设置参比物质作方法学上的可 靠性检验
使用参比物质(每年至少两次)对绿藻进行检测,推荐使用3,5-二氯苯酚和重铬酸钾
4.3数据处理 4.3.1生物量增长的抑制百分率 处理组藻类生物量增长的抑制百分率按式(1)计算 ×100 式中 处理组生物量增长的抑制百分率,%; 空白对照组测定的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL); 处理组测定的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL)
4.3.2生长率的抑制百分率 处理组藻类生长率的抑制百分率按式(2)计算
GB/I31270.14一2014 _丛二丛 ×100 e 式中: 处理组藻类生长率的抑制百分率,%; 空白对照组生长率的平均值; 从e 处理组生长率平均值
丛 其中按式(3)计算 lnX，一lnX 3 一 式中: 在时间点i到时间点j之间的平均生长率; A X 在时间点i时的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL); X 在时间点时的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL
4.3.3半效应浓度 4.3.3.1统计分析方法的选择 按藻类生物量增长的抑制百分率和藻类生长率的抑制百分率分别计算半效应浓度E,C和E,Cn
采用合适的统计学软件分析藻类数据,计算得到每一观察时间(24h,48h、72h)的半效应浓度和95% 置信限
4.3.3.2寇氏法 用寇氏法可求出藻类在24h,48h和72h的EC值及95%置信限
EC的计算见式(4). ogECa=X丽一i(习P一0.5) 式中: x -最高浓度的对数; -相邻浓度比值的对数; 习P 各组抑制率的总和(以小数表示)， 95%置信限的计算见式(5) 95%置信限=logEC士1.96slogEC 5) 标准误的计算见式(6): pg 习 SlogEC0=1 o 式中: 1个组的抑制率; -l一p; 各浓度组的生长率或生物量增长
4.3.3.3直线内插法 采用线性刻度坐标,绘制抑制百分率对试验物质浓度的曲线,求出50%活动抑制时的EC值
4.3.3.4概率单位图解法 用半对数纸,以浓度对数为横坐标,抑制百分率对应的概率单位为纵坐标绘图
将各实测值在图上
GB/I31270.14一2014 用目测法画一条相关直线,从直线中读出活动抑制50%的浓度对数,估算出C值
4.4质量控制 质量控制条件包括 供试生物应是处于对数生长期的纯种藻; 对照组和各浓度组的试验温度、光照等环境条件应按要求完全 一致; -试验起始斜生栅列藻浓度应控制在2.0×10个/ml一5.0×10个/ml左右,羊角月芽藻应控制在 5.0X10个/ml一5.0×10个/ml左右,普通小球藻应控制在1.0X10个n ml2.0×10'个/mL 左右; 试验开始后72h内,对照组藻细胞浓度应至少增加16倍
试验报告 试验报告应包括下列内容 供试物的信息,包括供试农药的通用名、化学名称、结构式.CAs号、纯度、基本理化性质、来 源等; 供试生物名称、来源、培养基及培养方法 试验条件,包括试验持续时间,温度,光照(光强和光周期),试验容器(容量,型号、密闭方法)、 静置、振荡或通气方式、测试液体积、pH、溶剂及其浓度、藻类生长的测定方法等; 供试物的浓度与抑制曲线图,得出的E.,C,E,C值,并注明计算方法 观察到的效应;细胞颜色、形态和大小变化;粘连或聚结情况;死亡,抑藻或杀藻效应情况等; 试验质量控制条件描述; 对藻的毒性等级划分见附录B
GB/I31270.14一2014 附 录A 资料性附录 培养基配方 水生4号,IBG11,sE培养基的配方分别参见表A.1一表A.3 表A.1水生4号培养基配方 序号 组分 用量 硫酸铵(NH.so 2.00 g 过磷酸钙饱和液Ca(H,P(O)H.OCaSOH.O) 10.0nml 硫酸镁MgsO7H.o 0.80 g 碳酸氢钠NaHco. 1.00g 叙化钾Kcl 0.25g 化铁1%溶液FC 1.50nml 土壤提取液" 5.,00nml 以上成分用燕憎水溶解并定容至1000mL,经高压灭菌(121,15min),密封并贴好标签，4C冰箱保存,有效 期2个月
该培养基用经高压灭菌(121C,15min)的蒸水稀释10倍后即可使用
取未随过肥的花园土200g置于烧杯或锥形瓶中,加人蒸僧水1000mlL.,瓶口用透气塞封口,在水浴中沸水加 热3h,冷却,沉淀24h,此过程连续进行3次,然后过滤,取上清液,于高压灭菌锅中灭菌后于4冰箱中保存 备用
表A.2G11培养基配方 序号 组分 母液浓度 母液用量 硝酸钠NaNO. 15g/100mL蒸水 10ml 磷酸氢二钾K.HPO 2g/500nmL燕憎水 10mL 七水硫酸镁MgS(O7H,g 3.75g/500mL蒸水 10ml 二水氧化钙CaC
2H.O 1.8g/500ml蒸水 10mL 柠檬酸c,H,O 0.3g/500ml燕水 10m 柠檬酸酸铁铵FeCH.ONH,OH 0.3g/500ml蒸水 10ml EDTA纳盐EDTANa 0.05g/500ml燕水 10ml 碳酸钠Na.cO. 1.0g/500mL蒸水 10ml 棚酸H,BO. 2.86g/L蒸水 四水氯化缸MnCl4H.O 1.86g/L蒸水 七水硫酸锌ZnSO7H.O 0.22g/L蒸水 A5(Tracmentalsolution 1ml 1mL/L 二水钼酸钠NaMoO2H.o 0.39g/L蒸水 五水硫酸铜CuSO5H.0 0.08g/L蒸水 六水硝酸Co(NO.6H.0 0.05g/L蒸水 将以上各成分配制成相应母液浓度,并按照标明顺序依次将相应母液用量转移至1000ml容量瓶中,定容,经高 压灭菌(121C,15min),密封并贴好标签,4笔冰箱保存,有效期2个月
该培养基用经高压灭菌(121,15nmin)的 蒸水稀释10倍后即可使用
GB/I31270.14一2014 表A.3SE培养基配方 序号 母液浓度 母液用量 组分 硝酸钠NaNo 25g/100mL燕憎水 1mL 磷酸氧二K,HPO 7.5g/100m
蒸溜水 ml 七水硫酸镁MgSO7H.O 7.5g/100ml蒸水 ml 二水氯化钙CaC2H.O 2.5g/100ml燕水 ml 磷酸二氢钾KH,PO 17.5g/100ml蒸僧水 ml 氯化钠NaCIl 2.5g/100ml蒸水 lml 六水叙化铁FeCl6H.o 0.5g/100mL燕俪水 1ml EDTA铁盐EDTA-Fe 1ml 棚酸HBO. 2.86g/儿.燕溜水 四水氯化MnCl4H.0 1.86g/1蒸馏水 七水硫酸锌ZnsO7H.O 0.22g/L蒸憎水 A5(Tracementalsolution 1ml 二水钼酸钠Na2MoO2HO 0.39g/1蒸水 五水硫酸铜CuSO
5H.O 0.08g/蒸溜水 0.05E/几燕憎水 六水硝酸钻Co(NO)
6H.0 土壤提取液" 10 40ml 将以上各成分配制成相应母液浓度,并按照标明顺序依次将相应母液用量转移至1000ml容量瓶中,定容,经高 压灭菌(121C,15minm),密封并贴好标签，4C冰箱保存,有效期2个月
该培养基用经高压灭菌(121C,15min)的 蒸僧水稀释10倍后即可使用 1mol/1HCl:取4.1ml浓盐酸用蒸水稀释至50ml
称取0.lmol/IEDTA-Na
0.9306g溶解至50ml 蒸憎水中
称取FeCl,6H.,O0.901段溶于10ml以上步骤已经配制完成的1mol/LHCl中,然后与10ml. 已经配制完成的0.1mol/几EDTA-Na
混合,加人蒸僧水稀释至1000mL 取未随过肥的花园土200g置于烧杯或锥形瓶中,加人蒸僧水1000mlL,瓶口用透气塞封口,在水浴中沸水加 热3h,冷却,沉淀24h,此过程连续进行3次,然后过滤,取上清液,于高压灭菌锅中灭菌后于4冰箱中保存 备用
GB/I31270.14一2014 B 附 录 规范性附录 农药对藻类毒性等级划分 按藻类生长抑制半效应浓度ECa(72h)值,将农药对藻类毒性等级划分为三级,见表B.1
表B.1农药对藻类的毒性等级划分 毒性等级 ECn72h)/mga.i./L) 高毒 ECo0.3 中毒 0,3
GB/I31270.14一2014 参 考 文 献 [1]NY/T1667.1一2008农药登记管理术语第1部分:基本术语 2] NY/T1667.2一2008农药登记管理术语第2部分;产品化学 [3]FAo(1989).Gcuidelineson.environmentalceriteriafortheregistration of sticides,Foodand pest AgrieultureOrganizationoftheUnitedNations [4]OECD(2011).Guideine201:FreshwaterAlgaandCyanobacteria,GrowthInhibitionTest. O)ECDGuidelinesfortheTestingofChemicals
a[5]USEPA.(1985).Partll,ToxicsubstancescontrolacttestGuidelines,FinalRules,Federal regIster
蔡道基.农药环境毒理学研究.北京;环境科学出版社.,1999. [[67
化学农药环境安全评价试验准则第14部分：藻类生长抑制试验GB/T31270.14-2014
藻类生长抑制试验是指将化学农药加入培养基中，然后观察和测定不同浓度下藻类的生长情况，从而评估化学农药对藻类的危害程度。由于藻类在生态系统中扮演着重要的角色，其受到化学农药的影响会进一步影响整个水生生态系统的稳定性。
GB/T31270.14-2014是我国编制的针对水生动植物的化学农药环境安全评价试验准则之一，其第14部分详细规定了藻类生长抑制试验的实验步骤、数据处理方法和结果表达方式。
首先，进行藻类生长抑制试验前需要选择合适的藻类种类，并根据其生长特性确定最佳的培养条件。试验过程中需要控制好温度、光照强度、培养基成分等因素，以保证试验结果的可靠性。
在试验中，将化学农药加入培养基中，按照一定比例制备不同浓度的溶液，然后将藻类悬液加入其中，观察不同浓度下藻类的生长情况，通常以藻类生长速率或生长量作为评价指标。
对于试验结果的处理，GB/T31270.14-2014规定了多种参数计算方法，如半数抑制浓度（EC50）、无效浓度（NOEC）和最低有效浓度（LOEC）等，用于评估化学农药对藻类的毒性影响。同时，还需要对试验结果进行统计分析，确保其科学性和可靠性。
总之，藻类生长抑制试验是一种重要的化学农药环境安全评价方法。GB/T31270.14-2014提供了规范的实验步骤和数据处理方式，有利于保障环境安全评价工作的科学性和准确性。
