化学品地表水中好氧矿化生物降解模拟试验

化学品地表水中好氧矿化生物降解模拟试验

国家标准 GB/T35523一2017 化学品地表水中好氧矿化 生物降解模拟试验 ChemicalsAerobicmineralisationinsurfacewater Simulationbiodegradationtest 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35523一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准和经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.309(2004年)《地表水中的好氧矿化 生物降解模拟试验(英文版)的技术内容相同 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口 本标准起草单位;环境保护部固体废物与化学品管理技术中心北京师范大学,浙江省农业科学院、 环境保护部南京环境科学研究所、上海市检测中心、沈阳化工研究院安评中心,浙江省化工研究院、广东 省微生物研究所 本标准主要起草人:刘纯新、丛建荣、于丽娜、蔡磊明、石利利、杨婿、韩雪、刘新洋,梅承芳汤保华、 陈杰
GB/T35523一2017 引 言 本试验目的是测量低浓度受试物在自然水体中的好氧生物降解过程,并用一种动力学速率表达形 式来量化其结果 这种模拟试验是在实验室中进行的批量化摇瓶试验,用于确定有机物在自然界地表 水体中(淡水.盐水、海水)的好氧生物降解率 这是基于Iso/Ds14592-1标准的试验,并包含了 GB/T278532011,GB/T27856一20112司 根据需要,也可用长时间半连续试验代替间歇分批试验 以防止试验系统中微生物退化 此模拟试验的首要目的是测定受试物在地表水中的矿化,矿化作用构 成生物降解动力学的基础 此试验的第二个目的是确定初级生物降解过程及形成的主要转化产物 鉴 别转化产物种类,如果可能,宜定量测定其浓度,这对矿化速率缓慢的物质(例如,残留''C半衰期超过 60d的物质)非常重要 由于分析方法的局限性,在主要转化产物鉴定和定量测定时可采用高浓度的 受试物(例如,大于100g/I). 试验中的低浓度是为确保试验得到的生物降解动力学关系能准确反映自然环境中的情况,而使受 试物含量足够低(如;低于1g/儿一100g/L) 与自然界水体中存在的可生物利用的有机物总量相 比,低含鼠的受试物只是作为次级基质被利用 这样,受试物可能以共代谢方式降解,生物降解动力学 表现为零级反应(“无增长”动力学》) -级生物降解动力学是指受试物的降解速率(mgL-d')与 基质浓度(随时间降低)呈线性关系 对于真正的一级降解反应,降解速率常数k不随时间和受试物浓 度的变化而变化 即k在试验进程中基本不变,也不随试验中添加的受试物浓度的变化而变化 准确 地说,降解速率常数用浓度相对时间的变化表示;k=(1/C)dC/d) 尽管在给定的条件下,通常希 望是一级动力学反应,但是在很多情况下更符合其他的反应动力学关系 比如,当生物转化速率主要受 基质传递如扩散速率)限制时,会偏离一级降解动力学 但是,降解速率常数往往与浓度有关,因而多 以准一级动力学来描述 试验之前,确认受试物在高浓度下已有的生物降解信息(例如,从标准筛选试验中获得)以及非生物 降解作用,转化产物和相关理化性质等信息,有助于进行试验设计和结果分析 使用'c标记的受试物 及试验结束时测定'C的相分配能得到最终生物降解信息 如果用非标记受试物,则只有在采用高浓 度试验且所有转化产物都已知的情况下,才能得到最终生物降解信息 IN
GB/35523一2017 化学品地表水中好氧矿化 生物降解模拟试验 范围 本标准规定了化学品地表水中的好氧矿化生物降解模拟试验的术语和定义,受试物信息、试验原 理、参比物质、试验方法概述,试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告 本标准适用于评价低浓度无挥发性或低挥发性的有机化学品(包括放射性同位素标记物或非标记 物)在自然界水体中的好氧生物降解过程 本标准可用于模拟测定化学品在不含粗颗粒的地表水或者浑浊的地表水中的生物降解性 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T21796化学品活性污泥呼吸抑制试验 GB/T21801化学品快速生物降解性呼吸计量法试验 GB/T21802化学品快速生物降解性改进的MITI试验(I GB/T21803化学品快速生物降解性D0C消减试验 GB/T21816化学品固有生物降解性赞恩-惠伦斯试验 21 1817化学品固有生物降解性改进的半连续活性污泥试验 GB 21818化学品固有生物降解性改进的MITI试验(I GB 化学品快速生物降解性密闭瓶法试验 GB 21831 21845化学品 GB 水溶解度试验 化学品批平衡法检测吸附/解吸附试验 GB 21851 21852化学品分配系数(正辛醇-水)高效液相色谱法试验 GB 化学品分配系数(正辛醇水摇瓶法试验 GB 21853 GB 21855化学品与pH有关的水解作用试验 GB 21856化学品快速生物降解性二氧化碳产生试验 GB/T21857 化学品快速生物降解性改进的OECD筛选试验 GB/T22052用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力和温度关系及初始分解温度的方法 GB 22228工业用化学品固体及液体的燕气压在10-Pa至10Pa范围内的测定静态法 GB/T22229工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平 衡法 GB/T27850化学品快速生物降解性通则 GB/T27853化学品水-沉积物系统中好氧厌氧转化试验 GB/T27856化学品土壤中好氧厌氧转化试验 OECD化学品测试导则No.104蒸气压(VapourPressure) sociationConstantsinwater) OECD化学品测试导则No.112水中解离常数(Dis
GB/T35523一2017 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 初级生物降解primarybhiodegradation 在微生物作用下,受试物化学结构发生变化(转化)致使某化学特性丧失的过程 3.2 功能性生物降解funetionalbiodegradatiom 在微生物作用下,受试物化学结构发生变化(转化)致使某特殊性能丧失 3.3 最终好氧生物降解utimateaerobicbiodegradation 在好氧条件下,微生物将有机物质彻底分解并转化为二氧化碳,水和其他元素的无机盐(矿化),产 生新的生物质和微生物合成的有机产物 3.4 矿化过程mineralisation 在好氧条件下,微生物将化学物质和有机物彻底分解并转化为二氧化碳、水和其他元素的无机盐 3.5 停滞期lagphase 从试验开始到降解微生物完成驯化所需的时间,化学品或有机物质的生物降解程度达到可分析测 定的水平(例如,最大理论生物降解量的10%,或更低,依分析技术的精度而定) 3.6 最大生物降解量nmaximumlevelofbiodegradatonm 化学品或有机物质在试验中生物降解可达到的最高程度,以百分率计,试验期间不再发生进一步的 生物降解 3.7 初级基质primarysubstrate 微生物生长和活动所需的各种天然碳源和能源物质的总和 3.8 次级基质secondarysubstrate 基质中浓度极低的组分 与供给碳源和能源的主要基质(初级基质)相比,它们的降解只给微生物 提供极少量的碳元素和能量 3.9 降解速率常数degradationratecomstant 用来描述降解过程速率的一级或准一级动力学速率常数,用k(d)表示 在间歇试验中,是由 停滞期结束后降解曲线的初始部分估算测得 3.10 半衰期half-life ,s 描述一级反应速率的术语,是受试物浓度降低一半所用时间 半衰期和降解速率常数的关系式为 =ln2/k t0.5=
GB/35523一2017 3.11 50"%衰减时间degradatonhalftime DT 对生物降解试验结果进行量化的参数 受试物质降解50%所用的时间,包括停滞期 3.12 检出限limitofdeteetion;LoD 受试物的某个特定浓度值,低于此浓度时,不能从被分析物中识别出该物质 3.13 定量检出限imitofquamtifeatom.Loo 定量限 受试物的某个特定浓度值,低于此浓度时,不能以可接受的精度测定该物质的浓度 3.14 溶解性有机碳disolelorganieearbon;Doc 在水样中无法通过确定的相分离法(如以加速度40000ms子离心15min或以孔径为0.2m~ 0.45丛nm n的膜过滤)而去除的有机碳 3.15 总有机'C放射性tataltamie"CatitoA 与有机碳相关的总的''C放射性 3.16 溶解性有机"C放射性disoedorgamie'cCactivity;DoA 与溶解性有机碳相关的总的'C放射性 3.17 颗粒有机'C放射性partiewlateorganieCaetivity;PoA 与颗粒有机碳相关的总的C放射性 受试物信息 4.1受试物基本信息包括 化学结构及同位索标记位置[适用于已用放射性同位素标记的受试物 推荐使用'C标记的 a 方法,应标记在分子结构中最稳定的部位,见第5章 对于多苯环结构的物质,宜在每一个苯 环中标记一个或多个碳 在易降解的侧链两端,宜标记一个或多个碳 受试物的化学纯度和 或放射化学纯度应大于95% 对于放射性同位素标记物来说,其比活性至少保持在1.85× 10°Bq/mg(50Ci/mg)或者更多,这样有助于在低初始浓度条件下测定l'C] 水中溶解度(GB/T21845)n; b 有机溶剂中的溶解性; c 离解常数(pk,)g d 燕气压(GB/T22052,GB/T22228,GB/T22229和OECDNo.104)和亨利常数; e 水中和黑暗中的化学稳定性(水解性,GB/T21855)g 盐析常数K'(Set 常数,lg(s/s')=K'.C,s和s'分别为受试物在淡水和海水中的 etschenow g 溶解度,C为盐摩尔浓度 4.2“悬沙试验”还需要以下信息 正辛醇-水分配系数(G;B/T21852和GB/T21853) a b吸附系数(K.,K，或K.,GB/T21851)
GB/T35523一2017 4.3其他信息包括 a 环境中的浓度(已知或估测值); b 对微生物的毒性数据(GB/T21796); c 快速生物降解性数据(GB/T21801,GB/T21802,GB/T21803,GB/T21831,GB/T21856、 GB/T21857和GB/T27850和/或固有生物降解性数据GB/T21816、GB/T21817和 GB/T21818); d 水-沉积物系统中好氧厌氧转化数据(cB/T27853),土壤中好氧厌氧转化数(GBT278s5n) 及转化特点 试验原理 5 试验以间歇方式进行,只用地表水培养受试物溶液(浮水试验),或者用含0.01g/几L一1g/L(以干重 计)悬浮固体的地表水模拟含有悬浮固体和再悬浮沉积物的水体(悬沙试验) 该范围内悬浮固体/沉积 物的浓度值是大多地表水体中的典型值 试验瓶应在黑暗的环境温度下,好氧培养并搅拌 测定受试 物降解动力学的试验中,应按环境中预期的浓度范围,至少设计相差5倍10倍的两个浓度 受试物 的最高浓度应不超过100"g/L,但是为确保生物降解符合一级动力学,最高浓度宜低于104g/L或更 L,宜使用1 一24g/几或低于1g/L 通常,采用商品化'C标 低 最低试验浓度不应高于104g/1 4g/1 记物质可对此低浓度进行准确的分析 由于分析方法的局限性,受试物浓度<1004g/L时,可能达不 到需要的分析精度(见9.2) 假如需要定性或定量测定主要转化产物,或低浓度下没有合适的定量分析 方法,应提高受试物浓度(大于100"g/L,有时甚至可大于l /IL)进行试验 高浓度生物降解反应可 Img 能不符合一级反应动力学,该测定结果不能用来估算生物降解的一级动力学常数和半衰期 当采用具体成分定量分析方法时,可在一定时间间隔,跟踪测定残留'C或剩余受试物浓度来测定 生物降解作用 采用'C标记分子中不太稳定的部分只能确保测得初级生物降解,uC标记分子中最稳 定的部分可确保测得总矿化反应 但是,最稳定部位并不一定包含相关的分子官能团(可能与具体特性 有关,如毒性、生物蓄积等特性) 如果是这种情况,可用'C标记受试物的官能团部分,跟踪观察其特 性的变化 6 参比物质 应采用好氧条件下易降解的物质例如,苯胺和苯甲酸钠)作参比物,检验试验用水中微生物的活 性 苯胺和苯甲酸钠的预期降解时间通常少于两周 试验方法概述 7.1仪器设备及试剂 试验中可能需要下列仪器设备及试剂 试验容器采用容积为0.51或1.0L的锥形瓶或圆柱型瓶,用硅胶或橡胶塞密封;或者用隔绝 a CO盖子(例如异丁烯胶塞)密封的血清瓶 振荡器或磁力搅拌器、离心机、pH计、浊度计、,烘箱或微波烘箱,膜过滤器， b 高压灭菌锅或玻璃器皿的加热灭菌炉 c d 处理'C标记物的设备,定量测定收集cO的溶液中和沉积物如需要)中'C放射性的仪器; 对受试物和参比物进行定性、定量化学分析所需的分析仪器,如气相色谱仪(GC)、高效液相色 谱仪(HPLC)等;
GB/35523一2017 fD 去离子水(用于配制受试物和参比物贮备液,试剂,应不含对微生物有毒的物质,而且D0C应 低于1me1网)7 浓度为100mg/L的HgCl溶液或浓度为100mg/1的福尔马林溶液; g h)其他实验室常用的设备和玻璃器皿. 7.2地表水的采集与运输 7.2.1采集位点 应依据试验目的选择地表水的采集位点 选择采集位点时,应考虑小流域及上游水域可能的农业 工业或生活污水的排放史 如果在此前四年内,该水体受到过受试物或与其结构类似物质污染,则不能 采集此处的水用于试验 只有当试验目的是要考察受试物在先前暴露过的水体中生物降解速率的变化 时,才能取此水用于试验 7.2.2采集 用彻底清洗干净的容器采集水样 采集时应现场测定水样的pH值和温度 应记录取水深度、水样外观(例如颜色、浊度)见10.4) 采集时还应测量水体和表层沉积物的含氧量和氧化还原电位,确认水体的好氧状态 7.2.3运输 用清洗干净的容器装水运输 运输期间,水样的温度不能显著超过试验温度 如果运输时间超过 2h一3h,宜保持在4下运输 水样不应结冰 7.3地表水的贮存和准备 宜在取水后一天内开始试验 应尽可能缩短贮存时间,最长不应超过4周 在4C下曝气直到使 用 用之前应采用100m孔径的膜或粗滤纸过滤,或者通过沉淀去除粗大颗粒 7.4含沉积物水样的准备可选 对于悬沙试验,在天然水样试验瓶中加人表层沉积物(按7.3去除粗大颗粒)并得到一种悬浮液,悬 浮固体含量应在0.01g/儿~1g/儿范围内 表层沉积物应与水样同时取自同一采样点 根据具体的水 体环境特点,既可用高有机碳含量(2.5%~7.5%)和细密质地的,也可用较低有机碳含量(0.5% 2.5%和粗质地的表层沉积物] 表层沉积物的制备如下:用透明塑料管拔出多个沉积物芯,取样后 立即切开上部好氧层(距表面最大深度了mm)再把它们混在一起 得到的沉积物样品应放在一个具有 较大顶部空间的容器中运输,确保处于好氧状态(如果时间超过2h一3h,宜控制保持在4C运输) 沉 积物应以1:10配比悬浮在水中,在4C下曝气,维持好氧条件直至使用 尽可能减少贮存时间,在任 何情况下都不应超过4周 7.5半连续试验[可选 如果预试验确认受试物在发生明显生物降解反应之前出现较长的停滞期,需要延长培养时间(可长 至几个月) 可考虑采用半连续试验,定期更新部分试验水样或悬浮液(见附录A) 或者,如果常规间 歇试验大约60d内受试物没有生物降解,也可从常规间歇试验改为半连续试验(见7.7.3) 7.6受试物(或参比物)的添加 7.6.1易溶受试物(或参比物)的添加 如果受试物有较高的水溶性水中最大溶解浓度超过1mg/L)和较低的挥发性(亨利常数
GB/T35523一2017 <1Pam'/nol)，可用去离子水配制受试物贮备溶液(见7.1),然后将一定体积的贮备溶液加人到试验 容器,得到最终浓度 贮备溶液添加量应尽可能低(如果可能,小于最终总体积的10%) 另一种做法 是用大量试验水样溶解受试物,这一操作可看作是代替使用有机溶剂 7.6.2难溶受试物的添加 万不得已时,水溶性很差的非挥发性物质也可采用挥发性有机溶剂配制贮备液,但是加人试验系统 的溶剂体积不应超过总体积的1%,且不应影响微生物的代谢活性,也不应影响受试物在水中的稳定 性 加人的有机溶剂应量少、容易与水分离,且不明显增加试验水样或悬浮液的D0C浓度,这就需用 具体物质的定量分析方法,或采用oC分析(如果可能)进行确认 应限制加人的有机浴剂量,确你 受试物能有效溶解在最终体积的试验水样中 将受试物溶人水样的其他方法已经在[时和[叮中进行介 绍 当用有机溶剂溶解受试物时,应以同样方式制备含试验水样(无任何外加物)和有机溶剂的对照组 样品含试验水样和参比物的程序对照组,用于校正使用助溶剂受试物试验瓶的活性,检查有机溶剂对 微生物种群是否有负面影响 7.7试验条件 7.7.1试验温度 可选用野外实际温度或20C一25C之间的温度 野外温度既可选择取样时的实际温度,也可选 择取样点的平均温度 宜在黑暗(也可在散射光)条件下,培养温度控制在选定温度的士2C内 7.7.2搅拌 为使颗粒物和微生物保持悬浮状态,应持续振荡或搅拌;同时,振荡还有利于顶空的氧气转移到弃 液中,保持充分的好氧环境 可将试验瓶放在振荡器的台板上面(振荡迷率约10r/mm)成呆用磁力 搅拌 振荡或搅拌应保证混合液处于均质状态,又应尽可能温和 7.7.3试验持续时间 试验持续时间一般不超过60d,除非采用半连续试验对悬浮液进行周期性更新见7.5和附录A). 如果受试物在60d之内开始生物降解,则分批间歇试验时间可最长延续到90d 可在适当的时间间 隔,通过测定同位素''C残留的放射性或者产生的'co.(见8.3)和/或其他化学分析方法(见8.4)来监 测降解过程 微生物的培养时间应足够长,以更好地评估降解过程 降解程度宜超过50% 对于降解 缓慢的受试物,应让其充分降解(通常降解程度应超过20%)以确保降解速率常数的准确估算 应定期测试验系统的pH值和溶解氧浓度 试验期间,在某些条件下,水样和沉积物中高浓度的初 级基质代谢可能会产生大量cO并消耗氧气,从而使试验条件发生重大改变 8 试验程序 8.1浮水试验程序 8.1.1浮水试验瓶的准备 将适量试验水样转移到试验瓶中,不超过容积的13,但不可少于10ml 如果采用多个试验瓶 在每次取样时,可整瓶取样),每个瓶中只装大约100ml水样,如果体积过小会影响停滞期长度 受 试物按照7.1、7.6.1、7.6.2描述的方法,采用贮备溶液方式加人 受试物应至少设计2个不同的浓度,浓 度相差5倍~10倍 2个浓度都应小于1004g/儿L,最佳范围为1"g/L104g/儿L
GB/35523一2017 用不透空气和cO的塞子或盖子密封试验瓶 对于未用'C标记的非挥发性受试物,如果确定主 要降解产物是非挥发性的,并且采用间接cO，测定法(见附录B),只要能防止空气中杂质的污染,则用 疏松的棉塞塞住瓶口即可(见7.l) 在选定的温度下培养试验瓶(见7.7.1) 在试验开始时(即生物降解刚开始之前,见B.1)相试验过 程中适当的取样时刻,取样测定浓度或c放射性 取样可以采用从每个平行中取一小部分(例如 5mL的倍数)，或每次取整瓶样的方式 受试物的矿化分解可采用直接法或间接法测定(见附录B) 除了对具有快速生物降解性的受试物.三个取样点能满足需要以外,通常降解阶段即停滞期结束后的 时段)至少应有五个取样点才能保证获得可靠的降解速率常数 对不能快速生物降解的受试物,降解过 程中需要更多次取样、分析,才能获得更多测算降解速率常数更的数据 鉴于不同受试物的降解速率 不同,没有固定的取样时间表 但是,如果降解速率较慢的话,宜一周至少取1次样 如果受试物降解 速率很快,则前3d应每天取一次样,之后每隔2d或3d取一次样 在某种情况下,比如水解非常迅速 的受试物有必要每小时取样 建议在试验之前先进行预试验以确定合适的取样时间 如果样品需做进 -步成分分析,宜多取一些样,在试验结束时按照相反的时间顺序进行分析测定,即最后取的样品最先 进行分析(见8.4,贮存样品稳定性指导) 8.1.2容器和取样数量 8.1.2.1 容器 按以下要求准备足够数量的试验瓶 受试物处理组试验瓶(以F表示) 每个受试物浓度应至少设置两个平行的试验瓶(宜至 aa >设3个).如果在每次取样时取整瓶水样,每个浓度应设多个平行的试验瓶; 少 质量平衡计算组试验瓶(用FM表示 每个试验浓度至少设两个平行的试验瓶 b 空白对照组试验瓶(用F表示 至少一个试验瓶,不加受试物,只装试验水样 d 程序对照组试验瓶用F表示 加参比物质(例如,苯胺或者苯甲酸钠,浓度104g/L)的 两个平行试验瓶 参比物程序对照组是用来确认微生物活性的 如果方便,可采用放射性同 位素标记参比物质,也可通过化学分析法测定; 个~2个试验瓶,装人灭菌的试验水样,以检测受试物可 无菌对照组试验瓶(用Fs表示 能的非生物降解或者其他非生物去除作用 试验水样的生物代谢活性可通过高温高压灭菌 在121C灭菌20min),添加杀菌剂例如100mg/L的HgC! 或100mg/L的福尔马林)或 采用丫-射线照射等方法消除 如果使用HgCl,应作为危险废物处置 如果是含有沉积物的 大量试验水样,则不易得到理想的灭菌效果,宜采用多次高压蒸汽灭菌例如3次) 需要注意 高压蒸汽灭菌可能改变沉积物的吸附性能 -装人试验水样或含参比物的试验水样 用与受试物处理组相同体 f 有机溶剂对照组试验瓶 积的有机游剂和相同的操作过程处理两个平行的试验瓶 通过测定参比物的降解检验有机溶 剂对生物降解是否有负面影响 8.1.2.2取样数量 试验设计阶段,应考虑增加试验瓶平行个数重要还是增加取样点重要 确切的试验瓶数由测定生 物降解的试验方法决定(见8.1.1,8.3和附录B) 每次取样时,应从每个试验瓶中取出两份样品比如,5mL的倍数) 如果采用多个试验瓶整瓶取 样,则每次取样时应至少取2瓶(见8.1.1) 8.2悬沙试验的容器准备[可选] 若需要做悬沙试验,将一定体积的试验水样和沉积物加人到试验容器中(见7.4) 按与浮水试验相
GB/T35523一2017 同的程序准备悬沙试验的试验瓶(见8.1.l) 宜选用血清瓶或者类似形状的瓶 密闭试验瓶,水平放在 振荡器上 非'C标记的非挥发性受试物的试验瓶敞口,垂直放置,宜使用外覆玻璃的磁搅拌子进行磁 力搅拌 如果需要,向瓶中曝气以保持好氧状态 8.3放射化学的测定 可直接或间接测定产生的'CO.(见附录B) 通过测定试验水样或悬浮液的初始'C放射性与取样 时残留总放射性的差,可间接测出'CO. 残留放射性是将不同时刻取的样品酸化,使pH值降到2 3之间，吹脱cO后测定的 这样,样品的无机碳已经被去除,得到的残留放射性都来自有机物 如果 受试物转化产生的主要转化产物有挥发性,就不能用'cO间接测定法(见附录B) 这时只能在每 次取样时,至少直接测定一个试验瓶释放的'cO.,这种方法既可做质量平衡,也可确定生物降解过程 但是,只限于用密封试验瓶进行的试验 如果直接测定产生的''cO.,事先应准备更多试验瓶 如受试物降解形成的主要转化产物易挥发， 宜采用直接法测定'cO. 每次测量时都要对试验瓶进行酸化处理,使pH值降到2~3之间,并使用内 置或外置的吸收器收集cO.(见附录B). 根据需要,C标记受试物和其主要转化产物的浓度也可采用放射性色谱仪进行测定例如,薄层 色谱仪,RADTLC),或者带放射性检测器的高效液相色谱仪(HIPILC). 根据需婴,也可测定残留放射性和残留受试物及转化产物的相分配(见附录c. 试验结束时,应用单独的、试验期间未取任何样品的试验瓶直接测cO.,进行质量平衡核算(见附 录B). 8.4定量化学分析 如果有足够灵敏的定量分析方法,就可不用放射性同位素标记法,通过测总的受试物残留浓度来测 定初级生物降解反应 如果采用放射性标记的受试物(测定总矿化程度),也可利用定量化学分析方法 进行平行测试以提供额外的有用信息并检查操作过程 定量化学分析法也可测定受试物降解期间转化 产物的形成,适用于矿化半衰期超过60d的物质 每次取样时都应测定受试物及转化产物的浓度并 记 录各自的浓度和占添加量的百分率) 在任何取样时刻转化产物浓度大于初始添加浓度10%的组分 都应进行鉴定 试验期间浓度持续增加的转化产物可显示其持续积累的特性,尽管其浓度不一定会超 出前面给出的限度(10%),也应考虑进行鉴定 如果认为受试物可能发生快速非生物转化反应(如水解 反应),则应考虑分析无菌对照组试验瓶中的转化产物 根据具体案例的实际情况,决定是否需要做转 化产物的定量测定和组分鉴定,并且应在试验报告中提供判断理由 根据不同的分析操作说明,应采用 不同的有机溶剂萃取方法 宜在取样后24h内进行分析,所有样品应隔绝空气在2C一4C保存 如果需要长期保存,样品 应在一18C以下冷冻保存或者化学保存 鉴于酸化可能使样品稳定性下降,不宜对样品进行酸化处理 保存 如果样品不能在取样24h之内分析测定而需要长期保存,应研究它在一18C以下存储或化学 法保存时的化学稳定性,以确定储存时各化学组分的稳定性 如果需要进行溶剂萃取或者固相萃取 SPE),应在取样后立即进行测定,或冷冻暂存24h之内进行 根据分析方法的灵敏性,可能需要大量测试样品而不是7.1所描述那样的少量样品 可以用容积 2L~3L的试验瓶装人1L试验水样做试验,这样每次能取大约100ml样品 9 质量保证与质量控制 9.1回收率 在添加受试物后,至少取2个平行样品,应立即通过'C放射性测定或其他化学分析方法(对非放
GB/35523一2017 射性同位素标记物质)测定其每一个试验瓶中初始浓度 这样可提供分析方法的适用性和重复性等信 息,也可提供受试物是否均质分布的信息 通常,将初始的'C放射性测定值或受试物浓度测定值用于 后续数据分析,而不用名义浓度值 因吸附产生损耗,从而要补偿剂量误差 对c标记的受试物 试验结束时通过质量平衡给出回收率(见8.3) 理想状态,放射性同位素标记的质量平衡回收率范围应 为90%110%,而非放射性标记物采用化学分析法的初始回收率范围应为70%110% 这些回收率 范围可作为试验的目标,而不作为接受试验结果的判别标准 根据需要,分析精度以受试物和主要转化 产物的最低浓度值来确定,而不用初始浓度 9.2分析方法的重复性与灵敏度 应以每个地表水样的5次重复分析来验证受试物及转化产物定量分析方法的重复性(包括初始萃 取的有效性 受试物及转化产物分析方达的最低检测眼(LoD),应低于测试系统中初始漆加总量的1% 定量 检出限(L0Q)应至少等于或小于所用浓度的10% 许多有机物及其转化产物的化学分析通常需要相 对较高的受试物浓度,例如,大于100g/L 10数据与报告 10.1结果处理 10.1.1数据绘图 全面合理安排取样时间,精确到各小时而不是天(如果受试物的降解速度很快,可精确到分钟) 以 受试物的残留放射性(C标记物质)或残留浓度(非标记物质)对时间作图分析,可用线性关系或者用 半对数关系作图(见图1、图2) 如果发生降解反应,对比分析受试物处理组试验瓶F，和无菌对照组试 验瓶F、的测定结果 如果F的结果平均值与F、的结果平均值偏差小于10%,就可推断降解反应主 要由非生物作用引起 如果无菌对照组试验瓶的降解率很低,可用这些数据校正受试物处理组试验瓶 的降解数据(相减)以准确估算生物降解程度 如果对主要转化产物进行分析,它的形成和衰减变化曲 线图也应与受试物的分解变化曲线图一起提供 100 90 80 60 50 40 30 20 10 停滞期 一级反应动力学 “拖尾" 时间 数据的线性关系作图示例残留放射性随时间的变化
GB/T35523一2017 停滞期 时间 图2数据的半对数坐标图示例残留放射性的对数随时间的变化 通过降解曲线(半对数作图)可估算停滞期的大致时间tL,可采用线性部分外推到零降解,或者以 大约10%降解率所需的时间来确定(见图1和图2) 通过半对数作图可估算一级降解反应速率常数 k,以ln浓度(残留'C放射性或受试物浓度)对时间进行线性回归求得其标准误差 特别是利用放射性 同位素'C的测量,只采用停滞期结束后刚开始的线性部分数据,宜选择少数有代表性的数据而不选大 量不确定的数据 这里,不确定数据包括直接测量残留"'C放射性带来的误差 如果有时降解反应分 两阶段进行,计算相应的两个不同的速率常数 鉴此,降解曲线的两个阶段应描述清楚 对于同一试验 瓶的分批取样,应针对每一个平行的试验瓶都分别计算降解速率常数人 =ln2/k,如果每次 取样时取整瓶水样(见8.1.2.2),则用平均值计算降解速率人和半衰期tas 前面提到的第一种情况时 个浓度的各平行试验瓶降解速率常数和半衰期都应记录,计算其平均值及标准误差 如果采用高 每 浓度受试物,降解曲线可能与直线有较大偏离(半对数作图,一级反应动力学可能不成立 这样的半衰 期没有意义 尽管如此,对于一定范围内的有限数据,仍然能估算出准一级反应速率并算出50%衰减 时间DT降解到初始浓度50%所用的时间 注意,DT不能用来预测超出所选数据范围的降解过 程,DT只是现有数据的汇总描述 数据统计计算和曲线拟合的分析工具很多、易得,宜采用该类相关 软件计算 如果采用具体成分定量化学分析方法,也可如前所述计算初级降解乃至整个矿化反应的速率常数 和半衰期 如果初级降解反应是限速步骤,整个降解过程的所有数据也可在一定条件下应用,因为这些 数据是通过浓度测定直接得到的,这与C放射性的测定不同 如果采用'C标记物质,至少在试验结束时,应以初始添加浓度的百分比来表示质量平衡 0.1.2残留放射性 当有机化合物'C标记的部分发生生物降解时,大部分'C转化成'cO.,而其他部分被用于生物量 的生长和/或胞外代谢物的合成 因此,受试物最终生物降解并不能把c完全转化成'cO.,C通过 生物合成参与构成各种产物,随后因"次级矿化作用"缓慢以"co的形式释放 由于这些愿因,"c残 留放射性(吹脱CO 后测定)或新产生的'cO放射性相对于时间的结果曲线,在降解结束后的阶段出 现“拖尾”现象 这会使动力学数据的解释变得复杂 因此,通常只采用降解曲线初始阶段(从停滞期结 束之后,到降解率大约50%的这段范围)的数据计算降解速率常数 受试物降解后,总的有机'C残留 10
GB/35523一2017 放射性总是大于没发生变化的受试物的放射性 如果受试物以一级反应降解,矿化转化成cO的分速 率常数为a,那么'C消失曲线总有机'C随时间变化的量)的初始斜率就是a乘以受试物(或者,准确 地说,应是受试物'C标记的部分)浓度曲线的斜率 采用未经校正的总有机'C测定值所计算得到的 降解速率常数偏于保守 基于各种简化假设,从测得的放射性值来计算受试物浓度的许多方法在有关 ],[8],[],[1m 文献 "中多有描述 这些方法也适用于具有快速生物降解性的受试物 0.2结果说明 如果得出值与受试物浓度无关即在不同受试物浓度下计算得到的人值几乎相同),就可假定用 -级反应速率常数代表该试验条件,例如,受试物、水样和试验温度 应由专家评判得到的结果能在多 大程度上适用或外推到其他系统 如果采用高浓度受试物,降解就不遵循一级动力学反应,得到的数据 不能直接计算一级反应速率常数和相应的半衰期 但是,受试物高浓度试验所得到的数据可用于总的 矿化程度的估算,而且对转化产物的检出和定量也有用处 如果知道受试物其他非生物降解途径例如,水解作用或挥发作用)的损耗率,可以通过试验过程的 净损耗率相减来大致估算出生物降解速率 例如,水解反应的数据,可从无菌对照组或高浓度受试物的 平行试验中得到 只能用直接和间接测定'co.(8.3及附录B)的方法测受试物转化成co的矿化程度 放射性色 谱法(RAD-TIC)或高效液相色谱法可用来分析'C标记受试物浓度和主要转化产物的形成(见8.3) 如要直接测定半衰期,应没有主要转化产物大于受试物添加量10%的产物)生成 如产生主要转化产 物,应更细评估这些数据,包括重复试验和/或对转化产物的鉴定见8.4) 由于受试物中的碳转化为 CO的比例不同(主要取决于受试物浓度,是否存在其他可利用基质、试验条件和微生物群落),这一试 验不能如D0C消减试验(GB/T21803)那样直接用于评定最终生物降解反应;但其结果与呼吸计量法 试验(GB/T21801)相似 因此其矿化程度将小于或等于最终生物降解反应的最小值 为了获得更完 整的最终生物降解资料矿化反应及合成生物量),试验结束时应测定'c同位素的相分配(见附录C) 颗粒层中的'C同位素包括合成细菌生物质的'cC和有机颗粒吸附的'c 0.3试验有效性 如果参比物在预期时间内(苯胺和苯甲酸钠,通常少于14d)没有降解,试验的有效性是可疑的,应 进行后续验证,或者用新鲜水样重做试验 国际标准化组织在欧洲7个实验室进行的环比试验中 20C时苯胺的降解速率常数为0.3d-I~1.7d',平均值为0.8d!,标准误差士0.4d(=0.9d) 典型的停滞期时间为1d~7d 测得的水样细菌生物量相当于每毫升10'10'(CFU) 如富营养型中 欧水样的降解速率大于北欧贫营养水样,这可能与不同的营养状况或受试物的前期暴露情况有关 对于放射性标记的受试物,试验结束后的总回收率(质量平衡)应为90%~110%,而非放射性标记 受试物在试验开始时的初始回收率应为70%110% 不过,此范围只可作为一个目标而不应作为是 否接受试验结果的判别标准 0.4试验报告 试验报告应明确说明试验类型,即浮水试验或悬沙试验,还应至少包括以下内容: 受试物和参比物: a 通用名、化学名,CAs号、结构式(如果使用放射性同位素标记物质,应指出'C标记的位 置)及相关的物理化学特性; 用来鉴别和定量测定转化产物的标准物的化学名、,CAs号、结构式(如果使用放射性同位 素C标记的化学物质,应指出'C标记的位置)及相关的物理化学特性; 纯度(杂质); 1
GB/T35523一2017 标记化学物质的放射化学纯度和比放射性强度(如必要) b 地表水,至少应报告以下信息 采样点的位置及描述,尽可能包括污染历史等详细信息; 采样日期和时间 营养组分(总氮,氨,亚硝酸盐,硝酸盐、总磷、溶解性正磷酸盐等); 采样深度; 样品外观(如颜色和浊度); 溶解有机碳D0C和总有机碳TOC; 生化需氧量BOD: 取样地点和取样时刻的温度与pH值; 氧或氧化还原电位(好氧状态不明显时应提供); 盐度或电导率(对于海水和微咸水); 悬浮物对于混浊样品); 取样时取样地点的其他相关信息(如;河流或海流流速的当前或历史数据,附近的主要排 污口及污染物类型,取样时刻的天气状况等》 其他可选信息 微生物生物量(如丫吭橙染色直接计数法或菌落计数法); 无机碳; 叶绿素a含量(藻类生物量的具体评价指标) 进行悬沙试验时应提供沉积物的以下信息 沉积物的取样深度 沉积物外观(如;颜色、泥质、粉质或砂质). 质地(如;粗砂、细砂、粉砂和黏土等成分的百分比) 悬浮固体干重(g/L)、总有机碳ToC,或测有机物含量的燃烧失重 pH 氧或氧化还原电位(好氧状态不明显时应提供) 试验条件 从样品采集到试验开始之间的延迟时间,样品贮存和样品预处理情况,试验进行的日期; 受试物和参比物的试验用量,试验浓度; 受试物的添加方法(包括使用溶剂的情况); 地表水及沉积物(如用)用量,每次分析测定时的取样量 试验系统描述;如果不保持黑暗条件,应描述有关“散射光”条件的情况 无菌对照试验所用的方法(如;高压蒸汽灭菌的温度、时间和次数); 培养温度; 放射性测定的分析技术和方法,质量平衡核算和相分配(如果检测)的分析技术和方法 平行的个数 试验结果 回收百分率(见9.1); 分析方法,包括检出限(LOD)和定量检出限(LO0Q)的重复性和灵敏度(见9.2); 所有测定数据(包括取样时间点)与计算值以表格方式和降解曲线表示;对每个测试浓度 和每个平行试验瓶,报告对数坐标图斜率的线性相关系数,估计的停滞期时间,一级或准 -级反应速率常数(如果可能),相应的降解半衰期(或半衰期,/wa) 以结果平均值报告各个试验平行中测定的相关数据,例如,停滞期时长,降解速率常数和 12
GB/35523一2017 降解半衰期(或ns; 通过观察降解曲线和对受试物浓度的影响,判断微生物是否驯化 最终质量平衡核算结果和/或相分配测定结果 矿化'C组分比例,采用的具体分析方法,测定的初级生物降解水平 主要转化产物鉴定,摩尔浓度和百分比(见8.4),适情提供 提出的降解转化过程代谢途径(适用时); 结果讨论 13
GB/T35523一2017 附 录 A 规范性附录) 半连续操作 为实现难降解物质的有效生物降解,试验时间可能需延长至几个月 通常,试验时间不超过60d. 除非不断地更新试验悬浮液以保持原试验水样的特性 如果受试物在前60d已经开始生物降解,即使 不更新试验悬浮液,其试验时间也可最长延至90d 在漫长的试验培养过程中,由于多种降解途径及必需营养元素和初级含碳基质的消耗,微生物群落 的多样性会减少 因此,宜采用半连续试验以准确测定降解缓慢物质的生物降解作用 根据经验,如果 估计受试物的降解率达到20%所需培养时间超过3个月,应以半连续操作进行试验 或者,采用间歇 试验在60d内未发生生物降解,可将常规间歇试验转成半连续试验 当已经记录得到实质性降解作用 如降解率大于20%)后,半连续操作可停止,以间歇方式继续试验 在半连续试验中,每隔两周用含 有受式物白 的新采集的水样更新三分之一的试验悬浮液,水样中受试 物加量与初始浓度相同 对于悬 沙试验,应以同样方式将沉积物加人到更新水样中,沉积物加量控制在 初始浓度(0. 悬沙试验中,应特别注意维持系统处于充分悬浮状态,即使换水时也应 g/L1g/I 如此,这样没有固定相损失,固体与水停留时间相同,否则会影响均质水体系统的相似性 因此,在半连 续试验中,悬浮物应采用较低的初始浓度 在部分更新悬浮液的过程中,受试物浓度不能超过初始浓度,避免高浓度受试物对微生物驯化 半 连续操作中,再次接种了微生物,消耗的营养物与初级基质得到补充,初始的微生物多样性得到恢复,理 论上试验时间可无限延长 当进行半连续操作时,应特别关注每次更新时对照受试物加人量和去除量 校正残留的受试物浓度 对于吸附量很少的物质,受试物总的配制浓度和实测的溶解浓度可替换使用 一定条件下(O.1只固体/儿~l只固体/L),分配系数gKm<3的中性,亲脂性受试物的吸附作用(小于 5%)可忽略不计 如下式所示 0.lg/L悬浮固体(SS)大致相当于每升10mg碳素(碳组分分数,f 0.01) 假设 lgK(受试物)=3 K =0.42×K 分配系数,K=fc×K 水中溶解碳浓度:C;试验体系(水十悬浮固体)中总碳浓度:C; 则水中溶解碳占体系中总碳的比例C./C)为: ./C,=1/(1+KaXSS)=1/1十K×fe×SS)=1/(1+0.42×10X0.01×0.1×10-s)=0.999 C 14
GB/35523一2017 附录 B 规范性附录 'co的测定 'co间接测定 B.1 日常分析中,如受试物本身为非挥发性物质且不产生挥发性转化产物,间接测定方法通常是最省时 且最精确的方法 例如,仅将5nmL未过滤的样品置于液闪瓶即可 样品的初始放射性宜为5000dpm~ 0000dpm(80Bq170Bq),最低初始放射性约1000dpm cO应用1滴2滴浓H,PO或HCI酸 化至pH值为23后去除 可利用气泡法吹脱0.5h~1h去除cO. 或者,也可将小瓶剧烈振荡 lh~2h如置于微板振荡器)或长时间轻轻振荡过夜 应检查cO的去除效果(通过延长曝气或振荡 时间) 之后加人与水样匹配的闪烁液,将样品置于匀浆器中匀浆,再用液体闪烁计数仪测定放射性,减 去空白对照组(F;)的背景放射性 除了颜色很深或含高浓度颗粒的水样外,样品通常都表现出一致的 评灭特性用外标法足以进行悴灭校正 如果待测水样颜色很深,应用内标法进行诧灭校正 若水样固 体颗粒浓度很高,就不能得到均质的溶液或凝胶体,样品间的淬灭特性差异很大 此时可采用下面的方 法对试验泥浆进行计数测定 如果是悬沙试验,可采用间接方法测定'cO.,均匀取1o mL待测水/悬 浮液样品,在适当转速(如以 40000m/的加速度离心15min)下离心分离 液相处理如前所述 颗 粒相'C放射性(POA)应先以少量蒸水将离心沉积物重新配成悬浮液,放人液闪小瓶,加人闪烁液制 成凝胶(为此专用的液体闪烁液)再测定 根据颗粒的特性(如有机组分含量),也可用组织消解器对样 品进行消解过夜,然后置于匀浆器中匀浆,最后加人闪烁液 或者用氧化器通过富氧条件下的燃烧来测 定POA 计数测定时,应包括内标物在内,对每个单独样品采用内标法进行淖灭校正 B.2'cO直接测定 如直接测定产生的cO,试验开始前应准备更多试验瓶,在每个测量点收取试验瓶,将其酸化至 pH值为2~3,用内置(试验开始时放在每个试验瓶内)或外置吸收器收集'cO 吸收介质可为强碱 如:1mol/L的NaOH溶液,或NaOH颗粒)、氨基乙醇或氨基醇类似物,及其他常用的碱性吸收剂 直接测定'cO时,试验瓶应用异丁烯橡胶塞等密封 15
GB/T35523一2017 附 录 规范性附录) 'c的相分配 通过直接测定吸附剂收集产生的'cO的质量平衡核算,补充进行残留总有机'C放射性(TOA 的日常测定,可以检验操作程序(见附录B) 与非生物降解或其他损耗途径(例如,挥发和吸附)相反 形成'cO是生物降解的直接证据 另外,还可用TOA在液相(溶解性有机'C放射性,DOA)和固相 颗粒有机'C放射性,PoA)中的分配情况来获取更多表征生物降解行为特性的有用信息,采用膜过滤 或离心的方法来分离颗粒 POA包括微生物和其他颗粒吸附的受试物,除此之外,POA还包括合成微 生物新细胞并整合到颗粒生物质中的受试物 生物降解完成后形成的溶解性有机'C组分可看作是 DOA(相对时间降解曲线的稳定期) 在测定样品中,可用孔径0.224m或0.45m的膜过滤样品来测定残留受试物'C的相分配 膜过 滤器不应明显吸附受试物(聚碳酸酯膜滤器比较合适) 若过滤器对受试物的吸附太大而不能忽略(试 验前先行检查),应以高速离心法(以2000的加速度离心10nmin)代替过滤法 按附录B中的描述将未过滤样品进行过滤或离心 将膜过滤器用一种合适的闪烁液溶解并计数 -般只用外标法或样品氧化剂来校正淬灭 如果采用离心,将离心形成的固体用1mL一2mL蒸馏水 重新悬浮并移人液闪瓶中 随后用1mL蒸馏水清洗两遍并将清洗液一同转移到液闪瓶中 如有必 要,可将悬浮液包埋在凝胶中进行液体闪烁计数 16
GB/35523一2017 考文 参 献 robicbhiodegradabilityofor [1]IsO/DIs14592-11999)waterquality一Evaluationoftheaero ganiecompoundsatlowconcentrations一Part1:Shakelaskbatchtestwithsurfacewaterorsurface water/sediment suspensions OECDdraft1999).Guidelinesfor ofchemicals，Aerobicandanaerobictransforma testing sediment.OECD，Paris ioninaquatic OECDdraft(1999).Guidelinesforthetestingofchemieals，Aerobicandanaerobietransfor mationinsoil.OECD，Paris [4]OECD(1993).GuidelinesfortheTestingofChemieals.OECD，Paris [5ISO82451999)Waterquality Guidelinesonthedeterminationoftotalorganiccarbon TOC)anddissolvedorganiccarbon(DOC) [6ISO106341995 WaterqualityGuidanceforthepreparationandtreatmentofpoorly watersolubleorganiccompoundsforthesubsequentevaluationoftheirbiodegradabilityinan aqueousmedium OEC2000).GuidanceDocumentonaquatictoxicitytestingofdifficultsubstancesand mixtures，EnvironmentalHealthandSafetyPublications，SeriesonTestingandAssessment.No23 [8 Simkins，S.andAlexander，M.(1984)Modelsformineralisationkineticswiththe variablesofsubstrateconcentrationandpopulationdensity.Appl.Environ.Mierobiol.47，394-401 [9Ingerslev，F andN.Nyholm.2000).Shake-flasktestfordeterminationofbiodegradation ratesofC-labeledchemicalsatlowconcentrationsinsurfacewatersystems.Ecotoxicol.Environ.Saf. 45，274-283 [10]Iso/CD14592-1(1999 Ringtestreport:WaterQualityEvaluationoftheaerobicbo degradabilityoforganiccompoundsatlowconcentrationspart1一reportof1998/1999ringtest.shake laskbatchtestwithsurfacewaterorsurfacewater/sedimentsuspensions

化学品地表水中好氧矿化生物降解模拟试验GB/T35523-2017分析

随着人类社会不断发展和工业化程度的提高，化学品的使用量也在逐年增加。其中，一些化学品由于其毒性较大，难以被自然环境分解和降解，进入地表水后会对生态系统造成一定的危害。因此，在新化学物质的设计、开发和使用前，需要对其进行一系列的生态风险评估和环境监测。 GB/T35523-2017是我国地表水好氧矿化生物降解模拟试验的标准，也是一种重要的水体生物毒性测试方法。该标准规定了地表水好氧矿化生物降解模拟试验的测试方法、用途、原理、试验材料与设备、试验操作、数据处理和质量控制等方面的内容。其中，实验操作中化学品处理是试验的关键步骤之一。 在化学品处理试验中，研究人员需要选择合适的化学品浓度和处理时间，并通过一系列的指标评价处理后水体溶解氧、微生物数量、有机物总量和氮磷含量等方面。如果处理后地表水溶解氧、微生物数量、有机物总量和氮磷含量等方面受到严重影响，表明该化学品对水体生态系统的危害程度较高，应当加强限制或禁止使用。 总结来说，GB/T35523-2017标准下的化学品地表水好氧矿化生物降解模拟试验是一种十分重要的生物毒性测试方法。通过对化学品对地表水溶解氧、微生物数量、有机物总量和氮磷含量等方面进行评估，可以更好地评估化学品对环境的潜在危害，从而实现对环境的保护和控制污染的目的。

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