动物源性食品中硝基咪唑残留量检验方法

动物源性食品中硝基咪唑残留量检验方法

国家标准 GB/T21318一2007 动物源食品中硝基咪陛残留量 检验方法 Deerminationofnitroimidazolesresidues infoodstuffsofanimmalorigin 2007-10-29发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21318一2007 前 言 本标准的附录A、附录B,附录C,附录D为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;吉林出人境检验检疫局、山东出人境检验检疫 局、检验检疫科学研究院 本标准主要起草人:荣会、牟峻、张代辉、林黎明、张鸿伟、马书民、赵庆松、李晓娟、彭涛
GB/T21318一2007 引 言 硝基咪幽类药物主要包括4-硝基咪陛、异丙硝哗、2-甲硝咪陛、洛硝哒陛、甲硝幽、氯甲硝咪陛、地美 硝陛,苯硝咪陛,是一类抗菌素和抗原虫药 硝基咪陛类药物在体内吸收快,所以标示残留物除了原形 药物外,还包括代谢产物胫基甲硝陛MNZOH(甲硝哗代谢物、胫甲基甲硝咪陛HMMNI(2-甲硝咪陛 洛硝哒陛代谢物),它们具有损害细菌DNA和抗厌氧菌感染的功效 该类药物主要用于治疗和预防厌 氧菌引起的局部或系统感染,抑制厌氧菌的DNA合成,也用于抗滴虫和阿米巴原虫等 由于硝基咪陛 类药物含有的硝基杂环类化合物具有细胞诱变性,从而导致此类药物有致癌作用和潜在的致畸作用 因此,硝基咪陛类药物在大多数国家为禁止使用或允许使用但必须严格监控的药物 本标准提供了动物源食品中硝基咪陛类及代谢物的高效液相色谱/串联质谐多残留确证方法
GB/T21318一2007 动物源食品中硝基咪幽残留量 检验方法 范围 本标准规定了动物源性食品中硝基咪哗原药8种、代谢产物2种残留量的高效液相色谱/串联质谱 测定方法 本标准适用于猪肉、鸡肉、牛肉、猪肝、鸡肝、牛肝、猪肾、牛肾、鱼肉、奶粉、蜂蜜中:4-硝基眯陛、异丙 硝陛,2-甲硝咪陛、洛硝哒陛、甲硝陛、氯甲硝咪陛、,地美硝陛、苯硝咪陛残留量及其代谢物羚基甲硝陛 MNZOH甲硝幽代谢物、羚甲基甲硝咪幽HMMNI(2-甲硝咪陛、洛硝哒幽代谢物)的测定 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqIS03696;1987) 原理 样品中残留的8种硝基眯陛、2种代谢物用甲醇-丙酮均质或超声波提取,经乙酸乙酯液液分配.以 凝胶色谱(GPC)净化,再经固相萃取(SPE)净化,采用液相色谱/串联质谱确证,外标法定量测定 试剂和材料 除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇HPLC级 4.2丙酬HPLC级 4.3乙酸乙醋;HPLC级 4.4环已炕;HPLC级 4.5氧化钠 4.6无水硫酸销经650C灼烧4h.贮于密封容器中备用 4.7甲酸;优级纯 4.8饱和氯化钠水浴液 4.9硅藻土:80目120目 4.10Ca固相萃取柱l.0g.6ml 4.11微孔滤膜;有机系.0.45Am. 4.12硝基咪陛原药8种、代谢产物2种标准物质;纯度均大于等于98%详见附录A). 4.13标准储备液:分别准确称取适量的每种标准物质,用甲醇配制成浓度为10004g/mL的标准储 备液 该溶液应配制于棕色容量瓶中,在0C一4C冰箱中可保存12个月 4.14混合中间标准溶液:分别准确移取一定体积的每种标准储备液,用甲醇稀释成适当浓度的混合中 间标准溶液 该溶液应配制于棕色容量瓶中,在0C4C冰箱中可保存6个月
GB/T21318一2007 4.15混合标准工作溶液:分别准确移取一定体积的混合中间标准溶液,可根据需要用甲醇稀释成适当 浓度的混合标准工作溶液 该溶液应配制于棕色容量瓶中,在0C一4C冰箱中可保存3个月 仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪;配电喷雾离子源串联四极杆检测器 5 2 凝胶色谱仪;配有憎份收集浓缩器 5.3组织捣碎机 5.4均质器 5 超声波发生器 5 5.6旋转蒸发器 57 高速离心机 5.8氨吹仪 5. ..9 具塞锥型瓶;250ml 55. .10分液漏斗;250nl 5.11浓缩瓶:50ml、250mL 试样制备与保存 6.1肌肉组织及器脏组织类、水产品类 从原始样品中取出有代表性样品(脏器应剔除筋膜)约500g,用组织捣碎机充分捣碎混匀,均分成 两份,分别装人洁净的容器作为试样,密封并标明标记,将试样置于-18C冷冻避光保存 6.2乳及乳制品类 从原始样品中取出有代表性样品约500g,用组织捣碎机充分捣碎混匀,均分成两份,分别装人洁净 的容器作为试样,密封并标明标记,将试样置于4C冷藏避光保存 6.3蜂蜜 从原始样品中取出有代表性样品约200g,对无结晶的蜂蜜样品用组织捣碎机充分捣碎混匀,均分 成两份,分别装人洁净的容器作为试样,密封并标明标记,将试样置于4C冷藏避光保存;对有结晶析出 的蜂蜜样品,在密闭情况下,将样品瓶置于不超过60C的水浴中温热,振荡,待样品全部融化后用组织 捣碎机充分捣碎混匀,均分成两份,分别装人洁净的容器作为试样,密封并标明标记,将试样置于4C冷 藏避光保存 在融化时应注意防止水分挥发 在制样的操作过程中,应防止样品污染或残留物含量发生变化 样品处理 7.1提取 7.1.1肌肉组织、脏器组织样品及水产品 准确称取约20g样品(精确至0.1g)于250mL具塞锥形瓶中,加人10g硅藻土(4.9)与样品充分 混匀,再依次加人5nml饱和氯化钠水溶液和70mL甲醇-丙剩(3十1),高速均质提取3min 将提取液 移人离心管中,于10000r/min条件下离心2min,将上层提取液移人250ml浓缩瓶中,残渣每次再用 50mL甲醇-丙酮(3十1)重复提取两次,合并提取液 7.1.2蜂蜜、乳及乳制品样品 分别准确称取约20g样品(精确至0.1g)于250mL具塞能形瓶中,加人10m饱和氧化钠水溶 液和70mlL甲醇-丙酮(3+1),超声波提取30min 移人离心管中,于10000r/min条件下离心2 min，
GB/T21318一2007 将上层提取液移人250mL浓缩瓶中 残渣每次再用50m甲醇-丙酮(3+1)重复提取两次,合并提 取液 7.2液液分配 将7.1.1和7.1.2所得提取液于40C水浴中旋转浓缩至只剩水相,并转移至250mL分液漏斗中 加人50ml饱和氯化钠水溶液和25ml乙酸乙酯,振摇3min,静置分层,收集乙酸乙酯相 水相再用 20ml乙酸乙酯重复提取两次,合并乙酸乙酯相 经无水硫酸钠柱脱水,收集于250ml浓缩瓶中,于 40C水浴中旋转浓缩至近干,加人5ml乙酸乙酯-环已炕1+1)溶解残渣,并用0.454m滤膜过滤,待 净化 7.3净化 7.3.1凝胶色谱(GPC)净化 7.3.1.1凝胶色谱净化条件 mm×25 a)净化柱:700 ,,BioBeadss-X3,或相当者; mm, b) 流动相:乙酸乙酯-环己烧(1+1) 流速:生.7mL/min; 样品定量环;5.0mL; dD 预淋洗体积;50ml; 洗脱总体积:210mL 开始弃去体积:90mL h) 收集体积:90ml 最后弃去体积:30mL i 7.3.1.2凝胶色谱净化步骤 将5ml待净化液按7.3.1.1规定的条件进行净化合并僧份收集器中的收集液于250ml浓缩瓶 中,于40C水浴中旋转浓缩至近干,加人5m甲醇以溶解残渣,待净化 7.3.2固相萃取(SPE)净化 使用前用5mL甲醇预淋洗C,固相萃取柱,将5mL溶解液倾人C固相萃取柱中,以1nmL/min 速度收集流出液,再用10mL甲醇进行洗脱 收集全部洗脱液于50mL浓缩瓶中,于40C水浴中旋转 浓缩至干 用甲醉溶解并定容至1.0mL,经0.45m滤膜过滤后,供液相色谱/串联质谱测定和确证 混合基质标准溶液的制备 7.4.1肌肉组织及脏器组织样品,水产品样品 称取6份约20阴性试样(精确至0.1g)于250mL具塞锥形瓶中,加人5mL饱和氯化钠水溶液 和70ml甲醇-丙酮(3十1),高速均质提取3min,于10000r/min条件下离心2nmin,弃去上层提取液 按照最终定容浓度0,l0,20,50,100,500ng/mL分别加人混合中间标准溶液(4.14)或混合标准工作溶 液(4.15),余下操作同7.1.1、7.2、7.3 7.4.2蜂蜜、乳及乳制品样品 称取6份约20g阴性试样(精确至0.1g)于250mL具塞锥形瓶中,按照最终定容浓度0、10,20 50,100,500ng/mL分别加人混合中间标准溶液(4.l4)或混合标准工作溶液(4.15),余下操作同 7.1.2、7.2、7.3 测定 8 液相色谱条件 流动相见表1; a b 进样量:10L
GB/T21318一2007 表1流动相条件 甲醇/% 时间/min 流速/l/min 0.1%甲酸水溶液/% 250 13.0 0,00 87.0 8,00 250 13,0 87.0 8.10 250 40.0 60,0 13,5 250 100 0.00 19.0 250 100 0.00 19.1 250 13.0 87.0 25,0 250 3.0 87.0 8 串联质谱条件 参见附录B. 液相色谱/串联质谱测定 8.3.1定性测定 对混合标准工作液及样液按上述规定的条件进行测定时,若检测样品的色谱峰保留时间与标准品 -致,且与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致,相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围,则可判 断样品中存在对应的被测物 每种硝基咪陛的选择离子对的种类、相对丰度比见附录C 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 >50% >20%50% >10%20% <10% 相对离子丰度 士20% 士25% 士30% 士50% 允许的最大偏差 8.3.2定量测定 根据样液中被测8种硝基咪幽,2种代谢物的含量,选定浓度相近的标准工作溶液 标准工作溶液 和待测样液中8种硝基咪陛、2种代谢物的响应值均应在仪器检测的线性范围内 对混合标准溶液与 样液等体积分组分时段参插进样测定 外标法定量测定 在上述液相色谱/串联质谱条件下,8种硝基 咪幽,2种代谢物标准物质的保留时间见附录cC,液相色谱/串联质谱总离子流色谐图见附录D 8.4平行试验 按照以上步骤对同一试样进行平行试验测定 8.5空白试验 除不称取试样外,均按照以上步骤进行 结果计算 按式(1)进行计算: x-4xYx A又mXIO00 式中: X -试样中硝基咪呸或代谢物i残留量,单位为微克每千克(4g/kg); A -样液中硝基咪瞠或代谢物i的峰面积(或峰高); 标准工作液中硝基咪瞠或代谢物i的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL). -样液最终定容体积,单位为毫升(mL) A -标准工作液中硝基咪陛或代谢物i的峰面积(或峰高); -最终样液代表的试样质量,单位为克(g) n 计算结果需扣除空白值
GB/T21318一2007 10 检出限(L0Q 本方法的测定低限见表3. 表3硝基咪瞠原药8种,代谢物2种测定方法的测定低限及添加回收率范围 测定低限和 回收率/% 药物名称 确证低限 猪肉 猪肝 猪肾 牛肉 牛肝 牛肾 鸡肉 鸡肝 鱼肉 奶粉 蜂蜜 mg/kg 72.2" 71.4|74.777.573.675.479.5- 72.7 182.377.470.7" 0.001 4-硝基眯睡 102. 99.589.197.887.992.8 98.286.4 95.1 89.1104. 75,4 76.580,487.378,480,7 73,678.188.583.2" 72.4" 0.0005 异丙硝幽 108.6102.8105.399.0114.798.2 99.7 03. 5 07.6108. 97.7 77.1~73.976.275.872.574.071.771.8" 79,674.869,5" 0.0005 2-甲硝咪隆 113.2108.799.9 1ll.6106.3100. 97.5103.996.4 108.0 [74.4~72.8~l75.3~72.5~71.3" 74.2 78.7 73,0" 76.8~74.473.3" 0.001 洛硝哒哗 106.294.8 99.2 98.1 1l1.595.9105.2112.61l1.5 99.6 77.8" 73,5~77.575,4~73.1 74.8 82. 75.2 [80,9~75,9" 72.9" 0.0005 甲硝陛 98.3105.996.2 96.5103.2100.399.1 107.7 97.0 114.8103. 76,6 74.0~78,979.7 76.7 76.9 80.3 73.6 82.373.070.2 0.001 氧甲硝咪陛 95,8 98.3 03.7117.3 95.4 102.696,6102.896.2" 116,4111.3 78.2" 72.577.679.175,8 77.3 79.0|76.3 84.7” 74.5一72.3" 0,001 地美硝哗 96,9107.497.5 97.4100,595.7 94.8105.1 98,5 111.2115 74.671.978.182.275.2" 77.681.975.581.477.773.8" 0.0005 苯硝咪幽 09.4 99.1 113.694.4 99.3 05.3106.8 102.597.9 98.3 96.3 羚基甲硝哗 74.772.7|73.8~|81.673.971.176.471.980.273,673.0" 0.001 MNZ0OH 105.698.2" 96.9 99. 112.6104.897.8108. 97.7 92.8 93.0 羚甲基甲硝 75.5" 74.075.183.977.680.5l77.872.4" 78.0~75.1 70.1 咪坐 0.001 112.5ll1.8105.4101.7 94.0 96,7 104.0l101.5109,6100,7 96.6 HMMN 回收率和精密度 本方法对硝基咪陛原药8种、代谢物2种的舔加回收率见表3 采用添加法,即对本底不含8种硝基眯陛原药及2种代谢物的猪肉、鸡肉、牛肉、猪肝、鸡肝、牛肝、 猪肾、牛肾,鱼肉,奶粉、蜂蜜样品,添加分别为(0.51.0,2.0、4.0ng/g水平的样品进行回收测定,每水 平单独测定10次,相对标准偏差在4.99%一22.41%范围内
GB/T21318一2007 附 录A 资料性附录 8种硝基咪陛原药及2种代谢物的英文名、化学名、结构式 表A.18种硝基眯陛原药及2种代谢物的英文名、化学名、结构式 相对分子 序号药物名称 英文名称 CAs号 分子式 结构式 质量 -硝基咪陛 3034-38-6 CHN,.O. 13.08 4-nItroImldazole 14885-29-1 CHN,O 169.18 异丙硝睡 ipronidazole 88054-22-2 CHN.o. 127.10 2-甲硝咪陛 2-methyl-5-nitroimidazole CHNo. ronidazole 7681-76-7 20015 洛硝哒畔 NH 甲硝哗 metronidazole 443-48-1 CH,N,O 171.15 DH 5-chloro-l-methy4-nitroimid- 4897-25-0cHcIN.O. 氯甲硝咪咪 161.55 azole 地美硝幽 551-92-8 CH,N,O. 41.13 dimetridazole 苯硝咪畔 C?HN,(O 5-nitrobenzimidazole 94-52-0 163.14 OH 1-2-hydroxyethyl)-2-hydroxy 羚基甲硝哗nmethyl-5-nitroimidazole 4812-40-2 CH,N,.O. 187.15 HO MNZOH2-(2-hydroxymethy-5-nitroim- idazole-1-y)-ethanol 胫甲基甲硝1-methyl-5-nitro-lH-imidazole 2-hydroxymethyl-1-methyl-5 936-05-0 咪哗 CH,N,O. 157.13 10 HMMNID nitro-imidazole
GB/T21318一2007 B 附 录 资料性附录 液相色谱/串联质谱条件 色谱柱;ZORBAxSB-C,150mm×2.lmm,3.5um,或相当者; 柱温:30C; 电离方式;电喷雾(ESI); 扫描方式;正离子扫描,多反应监测(MRM); 电喷雾电压;5500V; 雾化气压力:0.21MPa; 气帘气压力;0.088MPa; 辅助气压力:0.062MPa; 离子源温度;550C
GB/T21318一2007 c 附 录 资料性附录 8种硝基咪陛原药及2种代谢物的保留时间选择监测离子设定参数表！" 表c.18种硝基咪陛原药及2种代谢物的保留时间、选择监测离子设定参数表 保留时间 碰撞气能量 相对强度 序号 药物名称 定量离子对定性离子对 去簇电压/ eV 基峰/% min 23 1l4.0/67.9 2 114.0/83.7 4硝基眯陛 2.4 64 1l4.0/83.7 19 187.7/123.3 18 羚基甲硝幽(MNZOH 187.7/123.3 55 95 187.7/126.2 5 42 128.0/41.9 79 2-甲硝咪陛 3.6 128.0/4l.9 35 224 128.0/81.6 17 157.8/140.2 157.81 羚甲基甲硝咪陛(HMMND) 4.3 50 25 140.2 27 157.8/55.1 172.0/127.8 20 172.0/81.7 甲硝陛 4.9 59 80 172.0/81.7 34 17 201.1/139.7 59 洛硝哒陛 5.5 201.1/54.8 19 2o1.1/54.8 34 142.0/95.9 24 69 6.9 地美硝陛 142.0/95.9 75 142.0/80.7 36 161.9/115.8 25 161.9/115.8 76 氯甲硝咪陛 9.2 66 161.9/144.8 22 163,9/117.8 30 163.9/117.8 774 苯硝咪 10.0 30 163.9/90.9 52 169.5/124.3 25 10 异丙硝哗 15.1 169.5/124.3 665 95 35 169,5/109.1 1所列参数是在API4000质谱仪完成的,此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考,并不涉及商业目的,鼓励 标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器
GB/T21318?2007 ? D ?? 8??2?л??/?? 1.10e6 10 l.0oe6 9.00e5 00e5 00e .00e6 5.00e5 .00e5 3.00e5 2.00e5 .0e5 0.00 24 20 22 4仩; -(MNZOH); 2- -?(HMMN); ; ?; ?仩; ; ? ?D.18??2?л??/??