动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法

动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定高效液相色谱-质谱/质谱法

国家标准 GB/T21323一2007 动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定 高效液相色谱-质谱/质谱法 Determinationofaminoglycsidesresiduesinanimaltisses- HLC-MS/MSmethod 2007-10-29发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21323一2007 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;湖南出人境检验检疫局、山东出人境检验检疫 局、湖南师范大学、检验检疫科学研究院 本标准主要起草人:黄志强、林黎明、张鸿伟、张莹、陈波、彭涛、李晓娟、王美玲、颜鸿飞
GB/T21323一2007 动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定 高效液相色谱-质谱/质谱法 范围 本标准规定了动物组织中壮观霉素、潮霉素B,双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素,安普 霉素,妥布霉素、庆大霉素和新霉素10种氨基糖苷类药物残留量的高效液相色谱-串联质谱测定和确证 方法 本标准适用于动物内脏、肌肉和水产品中10种氨基糖苷类药物残留量的测定 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 t8/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一19g.neq1so.3896,187) 原理 试样中氨基糖苷类药物残留,采用磷酸盐缓冲液提取,经过C固相萃取柱净化,浓缩后,使用七氟 丁酸作为离子对试剂,高效液相色谱-质谱/质谱测定,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 4.1甲醇液相色谱级 4.2冰乙酸;液相色谱级 4.3甲酸液相色谱级 4.4七氟丁酸;纯度>99% 4.5浓盐酸 4.6氢氧化钠 4.7三氧乙酸;纯度>99% 4.8 二胺四乙酸二钠(NaEDTA);纯度>99% 乙 4.9磷酸二氢钾 4.10七叙丁酸存液(HFBA.l0mmalL..准确登取6后nl七叙丁酸(t.),用水稀释至50ml. 4C避光可保存日个月) 4.11七氟丁酸溶液:20mmol/L,准确量取100nmmol/1七氟丁酸溶液50ml(4.10),用水稀释至 250 mL.(4C避光可保存6个月. 412顾酸盐缓冲液(含0.4mmalLEDTA和2%三领乙酸辫液)难明称取睛服二氢押(4.91.e 用980ml水溶解,用1.0mol/L的盐酸调pH到4.0,分别加人NaEDTA(4.8)0.15g和三氯乙酸 4.7)20g,溶解混匀并定容至1000ml(4C避光可保存1个月 4.13甲酸:0.1%体积分数),准确吸取1.0ml 甲酸(4.3)于1000mL容量瓶中,用水稀释至刻度， 混匀
GB/T21323一2007 4.14壮观霉素、潮霉素B,双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素,安普霉素、妥布霉素、庆大霉 素,新霉素标准品;纯度范围92.0%~99% 4.1510种氨基糖苷类药物标准贮备液;分别准确称取适量的每种氨基糖苷类药物标准品(4.14),用 水溶解,配制成浓度为100 4g/ml的标准贮备溶液(4C避光可保存6个月 4.16l0种氨基糖苷类药物混合标准中间溶液;分别准确量取壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡 那霉素、卡那霉素,妥布霉素、庆大霉素标准贮备溶液(4.15)各1.0mL,新霉素、潮霉素B安普霉素标 准贮备溶液(4.15)各5.0ml,于25 容量瓶中,用水定容至刻度,配制成壮观霉素、双氢链霉素、链 ml 霉素、丁胶卡那霉素、卡那霉素妥布霉素和庆大霉素浓度为4.0g/'ml,新醇素,阁霉素目和安普霉素 浓度为20.0 g/ml的混合标准中间溶液(4C避光可保存1个月 4.1710种氨基糖苷类药物标准工作溶液:精密量取标准中间溶液(4.16)适量,用空白样品基质配制 成不同浓度系列的混合标准工作溶液(现用现配. 4.18固相萃取C柱:500mg,3ml 仪器 5.1高效液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源 5.2高迷组织捣碎机 均质器 3 5 5反." 旋转蒸发器 5.5氮吹仪. 5 pH计 57 分析天平;感量0.1mg和0.0【各一台 5.8真空泵 5 5. 离心机 试样制备与保存 6.1试样制备 样品经高速组织捣碎机均匀捣碎,用四分法缩分出适量试样,均分成两份,装人清洁容器内,加封后 作出标记,一份作为试样,一份作为留样 6. 试样的保存 2 将试样于一18C下保存 测定步骤 提取 称取约5g(精确至0.01g)试样于50m聚丙烯离心管中,加人10.0ml磷酸盐缓冲液(4.12)均 质2min,于平板振荡器上振荡提取10min,离心10min(4500r/min),将上清液转移到另一个50ml 聚丙烯离心管中 在残渣中再加人10.0mL磷酸盐缓冲液(4.12),重复上述操作,合并上清液,用 1.0mol/L的盐酸调pH值为3.5士0.2,加人2.0mL七氟丁酸溶液(4.10),涡旋混匀 7.2净化 C固相萃取柱用3.0ml甲醉(4.1),3mL七氟丁酸溶液(4.11)淋洗后,将提取液加载在固相萃取 柱上,控制流速约1滴/s,先用3ml七氟丁酸溶液(4.11)淋洗,再用每次3ml水淋洗两次,弃去淋洗 液,抽干5min 用5mlL乙睛-七氟丁酸溶液(4.11)(8020,体积比)洗脱,收集洗脱液于精密刻度试 管中,40C氮气流挥去部分溶剂,用七氟丁酸溶液(4.11)定容至1.0mL.,涡旋混匀后,过0.2pm微孔滤 膜,液相色谱-质谱/质谱测定
GB/T21323一2007 7.3测定 7.3.1标准工作曲线制备 制备混合标准浓度系列,壮观霉素,双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大 霉素分别为50ng/ml,100ng/m、,250ng/mL、,500ng/ml、1000ng/ml,新霉素,潮霉素B,安普霉素 分别为300ng/ml,500ng/ml、1000ng/mL、1500ng/ml,2000ng/mL,按7.3.2条件测定并制作 标准曲线,10种氨基糖苷类药物的CAs号和在7.3.2色谱条件下测得的色谱保留时间参见表B.1 7.3.2液相色谱条件 a 色谱柱:Ca柱(可用tersiloDs3,粒径5m，柱长150mm,内径4.6mm或相当者); b)流动相甲醇十水十100mmol/LHFBA(梯度洗脱),流动相组成和洗脱梯度见表1 表1流动相组成和洗脱梯度 时间/min 甲醉醇/% 水/% 100mmol/LHFBA/% 20 75 0.5 75 20 20 60 20 12.0 70 1o 20 12.1 80 20 15.o 80 20 15.1 75 20 75 20 35.0 流速:0.3mL/min; d) 柱温;30C; e)进样量:30nL 7.3.3质谱条件 参见附录A 7.3.4液相色谱-串联质谱测定 7.3.4.1定性测定 按照上述条件测定样品和建立标准工作曲线如果样品中化合物质量色谱峰的保留时间与标准溶 液相比在士2.5%的允许偏差之内;待测化合物的定性离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于3 s/N>3),定量离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于10(S/N>l0);定性离子对的相对丰度 与浓度相当的标准溶液相比,相对丰度偏差不超过表2的规定,则可判断样品中存在相应的目标化合 物 10种氨基糖苷类药物标准工作溶液的定量离子对的重构离子色谱图参见图B.1图B.10. 表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%50% >l0%20% 10% 允许的相对偏差 士20% 士25% 士30% 士50% 7.3.4.2定量测定 按外标法使用标准工作曲线进行定量测定 空白实验 除不加试样外,均按上述测定步骤进行 7.5结果计算 试样中每种氨基糖苷类药物残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算
GB/T21323一2007 1o0 x一xx 1000 式中 试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(4g/kg); 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 试样溶液定容体积,单位为毫升(mL); 一试样溶液所代表的质量,单位为克(g) 7m7 注;计算结果应扣除空白值 检测低限L0Q 壮观霉素、双氢链霉素,链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素,妥布霉素,庆大霉素为20E/kg,新霉 素、潮霉素B、安普霉素为100g/kg 回收率和精密度 9.1鱼肉 9.1.1壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素 添加水平为20g/k区时,回收率范围为72.1%一9A.7% 漆加水平为30g/k区时,回收率范围为71.4%一95.4% 添加水平为404g/kg时,回收率范围为71.1%一98.0%. 9.1.2新霉素,潮霉素B安普霉素 莽加水平为100g/k区时,回收率范围为70.1%一3.6%. 添加水平为150ug/kg时,回收率范围为70.4%一93.0% 添加水平为2004g/kg时.,回收率范围为69.1%94.5% 9.2鸡肉 9.2.1壮观霉素、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素 添加水平为204E/kg时,回收率范围为73.1%一94.5%. 添加水平为304g/kg时,回收率范围为74.0%一97.9% 添加水平为40ug/kg时,回收率范围为72.7%一98.3% 9.2.2新霉素、潮霉素B安普霉素 添加水平为1004g/kg时,回收率范围为70.3%102.6% 添加水平为150g/kg时,回收率范围为71.4%一95.2% 添加水平为2004g/kg时,回收率范围为72.3%一96.0% 9 猪肾 3 9. 3.1壮观霉素,双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、,卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素 添加水平为204g/kg时,回收率范围为72.1%~95.5%. 添加水平为304g/kg时,回收率范围为73,0%96.2% 添加水平为404g/kg时,回收率范围为70.7%~99.3% 9.3.2新霉素、潮霉素B安普霉素 添加水平为1004g/kg时,回收率范围为73.9%~99.3% 添加水平为150g/kg时,回收率范围为71.4%98.2% 添加水平为200g/kg时,回收率范围为73.0%~105.0%
GB/T21323一2007 附录A 资料性附录 质谱/质谱测定参考质谱条件" 质谱/质谱测定参考质谱条件 a)离子源;电喷雾离子源; 扫描方式:正离子扫描; b) 检测方式:多反应监测: c) d)电喷雾电压;5000V 雾化气压力:0.276MPa; e 气帘气压力:0.207MPa; 辅助气压力0.448MPa g 离子源温度;500C; 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压,见表A.1 表A.1氨基糖苷类药物的定性离子对、定量离子对,碰撞气能量和去簇电压 定性离子对 定量离子对 称 碰撞气能量/eV 去簇电压/v 名 m/2) m/2) 母离子/子离子 母离子/子离子 壮观霉素 333.3/140.2 36 110 333.3/140.2 speetinomyein) 333.3/189.2 32 l15 潮霉素B 528.3/177.3 44 145 528.3/177.3 hygromycinB) 528.3/352.2 35 145 双氢链霉素 584.3/263.3 45 140 584.3/263.3 43 dihydrostreptomyein 584.3/409.3 145 582.4/263.3 47 160 链霉素 582.4/263.3 streptomyein 582.4/407.4 44 160 586.4/425.3 30 00 丁胺卡那霉素 586.4/425.3 amikacin 586.4/324.2 34 100 40 85 485.3/163.2 卡那霉素 485.3/163.2 kanamyein 485.3/324.2 26 85 安普霉素 540.5/378.2 27 145 540.5/378.2 apramyecin) 540.5/217.2 42 140 468,4/163." 37 90 妥布霉素 468.4/163.2 tobramyein) 468.4/205.2 35 90 478.4/160.2 35 75 庆大霉素 478.4/157.3 gentamyein 478.4/157.3 70 36 615.4/293.3 36 150 新霉素 615.4/293.3 neomyein) 615,4/323.3 34 150 1 所列参数是在ABl4000质谱仪完成的,此处列出的试验用仪器型号仅是为了提供参考,并不涉及商业目的,鼓 励标准使用者尝试不同型号的仪器
GB/T21323一2007 附 录 B 资料性附录 标准样品定量离子对重构离子色谱图 14.31 3.5be4 3,.0e4 2.5e4 2.4 1.5e4 刹 1.04 5000.0 0.0 06得加2A站亚 /min 图B.1壮观霉素重构离子质量色谱图 14.64 1 3500# -3000 25003 20005 1500 1000 500 M2百加奶站7 /min 图B.2潮霉素B重构离子质量色谱图 14.82 2.5e51 2.e5！ 1.5e5 1.0e5 5.0e4 1012141618202224262830323 /min 图B.3双氢链霉素重构离子质量色谱图 14.85 3.545 3.0e4 2.54 2.0e4 1.54 1.0e4 5000.0" o “，-平早翠早早 0.0 0 不 6互浦M /min 图B.4链霉素重构离子质量色谱图
GB/T21323一2007 16.63 1.8e4 1.e4 1.e4" 1.2ef 1.0ef 剔H 4000.0 Sn" 而五a篇靠而豆丽 101214 /min 图B.5丁胺卡那霉素重构离子质量色谱图 17.93 4 AD" 6.0e4 e 出 2 .0e4 医页 66 "A" 0.0 046加22味22 /min 图B.6卡那霉素重构离子质量色谱图 21.06 350 300 250 2005 150 i0o 0 81012416182022242628303234 /min 图B.7安普霉素重构离子质量色谱图 21.40 6.0e4 5.0e4 4.0e4 3.0e4 2.0e4 1.0e4 ,444盟丝2R4但遇查 1o12141618202224262830324 /min 图B.8妥布霉素重构离子质量色谱图 22.00 1.8e4 1.6e4 4e4 1.2et iet 4000.0 2000.0 0.0 ;024I61D2站D24 /in 图B.9庆大霉素重构离子质量色谱图
GB/T21323?2007 22.10 1360 1200 1000- 800- 600- 400 200 10121416182022242628303234 lmin ?B.10ù??? B.110??ο?估CAS ? ? CAs CAS main min ?ù ù 21736-83-4 17.93 14.31 25389-94-0 spectinomycin kanammycin ùB ù 14.64 1445-69-8 31282-04-9 21.06 hygromyeinB) apramyein) ?ù ?ù 14.82 5490-27-7 21.40 32986-56-4 dihydrostreptomyein tobramyein) ù ù 3810-74-0 22.00 14.85 1405-41-0 (streptomycin gentamycin ù ù 16.63 37517-28-5 22.10 1405-10-3 amikacin neomycin