GB/T19495.5-2018
转基因产品检测实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测方法
Detectionofgeneticallymodifiedorganismsandderivedproducts—Quantitativereal-timepolymerasechainreaction（PCR）methods
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2019-04-01
- 文件格式PDF
- 文本页数19页
- 文件大小1.05M
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转基因产品检测实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测方法
国家标准 GB/T19495.5一2018 代替GB/T19495.5一2004 转基因产品检测 实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR 检测方法 Deteetionofgeneticalymodiifiedorganismsandderivedproduets- Quantitativereal-tiepolymerasechainreaction(PCRmethods 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB;/T19495.5一2018 前 言 GB/T19495《转基因产品检测》分为如下几部分 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求; GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法; GB 19495.4转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR)检测方法 19495.5转基因产品检测实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法; GB/T19495.6转基因产品检测基因芯片检测方法; GB/T19495.7 转基因产品检测抽样和制样方法; GB/T19495.8转基因产品检测蛋白质检测方法 GB/T19495.9转基因产品检测植物产品液相芯片检测方法
本部分为GB/T19495的第5部分
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草
本部分代替GBT19495.5一2004(转基因产品检测核酸定量CR检测方法》
与GByT19495.5 2004相比,除编辑性修改外主要技术变化如下 修改了标准的适用范围 增加了分别基于基体标准物质以及质粒标准分子对样品中转基因植物品系进行定量检测的操 作规程; 增加了大豆、玉米、油菜、棉花、水稻,马铃,甜菜和木瓜等转基因植物品系拷贝数百分含量的 定量检测方法
本部分由全国植物检疫标准化技术委员会(SAc'/Tc271)提出并归口
本部分起草单位;检验检疫科学研究院、上海出人境检验检疫局、中华人民共 和国山东出人境检验检疫局、深圳出人境检验检疫局
本部分主要起草人;黄新、李想、,高宏伟、凌杏园、朱水芳、陈洪俊、潘良文、曹际娟、章桂明
本部分所代替标准的历次版本发布情况为: GB/T19495.52004
GB;/T19495.5一2018 转基因产品检测 实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR) 检测方法 范围 GB/T19495的本部分规定了大豆、玉米、油菜、水稻(大米)、棉花、马铃薯、甜菜、木瓜等植物及其 产品中转基因品系含量的实时荧光PCR定量检测方法
本部分适用于上述植物及其产品中转基因品系拷贝数百分含量的定量检测方法
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 JF1059.1测量不确定度评定与表示 SN/T4562转基因检测实验室测量不确定度评估指南 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1.1 转基因transgene 将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列,通过生物工程技术,使其在该物种中进 行表达,以便使该物种获得新的品种特征的技术 3.1.2 -peine 品系特异性 eVent-S 外源DNA插人受体作物基因组后经重组产生的邻接区序列
3.1.3 实时荧光PCRreal-timepolymerasechainreactionm 在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,并通过标准 曲线对未知模板进行定量分析的方法 3.1.4 内标准基因endogenousrefereneegene 在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因
该基因可用于判定物种特异性
GB/T19495.5一2018 3.1.5 c值eyclethreshoad 每个反应管内的荧光信号达到设定的值时所经历的循环数
3.1.6 定量下限limitofG ntifieation;L.0Q quan 在准确度和精确度处于可接受范围内时,样品中可稳定定量的分析物最低量或浓度
3.1.7 标准物质refereneematerial 具有一种或多种足够稳定、均一和确定的特性值,用以对设备进行校准、对测量方法进行评价或为 材料定值的物质或材料
3.1.8 基体标准物质matrixreferencematerial 来源于植物原材料(如植物种子,叶子根茎等),通过对转基因品系及与其对应的非转基因品种材 料通过一定质量比进行混合而制成的具有一定转基因成分百分比含量的标准物质
3.1.9 质粒标准分子plasmidrefereneemoleue -种稳定存在的重组质粒分子,其包含了转基因检测的目标序列片段(如筛选基因片段、功能基因 片段或品系特异性片段等),以及物种特异的内标准基因片段,可用于转基因产品定性定量检测
3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件
ACP1;酰基载体蛋白基因(aceylcarrierprotein1) ADH1;乙醇脱氢酶1基因(alcoholdehydrogenase1) BHQ1;黑洞猝灭基团1(blackholequencher1 bp;碱基对(basepair C:采用质粒标准分子作为标准物质进行转基因成分定量检测的转换系数(conversionfactor) CHY;木瓜凝乳蛋白酶基因(chynmopapaingeney CruA油菜种子储藏蛋白基因(eruciferinAgene DNA;脱氧核糖核酸(G deoxyribonucleicacid dATP脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate) dCTP,脱氧胞苷三磷酸(deoxyeytidinetriphosphate) dGTP;脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate dNTP;脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate) dUTP;脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate EDTA:乙二胺四乙酸(G dianminetetraaceticacid) ethene FAM:梭基荧光素(6 6-carboXvfluorescein GS:谷氨酸合酶基因(glutaminesynthasegene) L.eetin;植物凝集素基因 MGBNFQ:小沟结合物无荧光猝灭基团(minorgroovebindernonf nfluoresceentqueneher) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaeion) PLD,磷脂酶D家族基因(phospholipaseDfamilygene) ROX;一种荧光染料(earboxy-X-rhodmine) SAH7:类拟兰芥属同源序列7的棉花内源基因(sinapisare rabidopsis homolog7gene
GB;/T19495.5一2018 SPs;蔗糖磷酸盐合成酶基因(sucrosephosphatesynthasegene) Taq;DNA聚合酶(TaqDNApolymerase) Tris:三(胫甲基)氨基甲婉[tris(hydroxymethyl)aminomethane UDG:尿喀哧DNA-糖基(uracilDNAglycosylase UG;Pase;马铃薯UDP葡萄糖焦磷酸化酶基因UDPglue rosepyrophosphor 心 asegenefrom Solanumtuberosumn UNG酶;尿嗜啖-N-糖基化酶(uraeil-N-glycosylase) 方法原理 实时荧光PCR定量检测是在PCR反应体系中,除采用特异的引物外,还加人了与模板DNA匹配 的具有荧光标记的探针,随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增 加
每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而 得到一条荧光扩增曲线
当荧光信号超过所设定的阂值(Threshold)时,荧光信号可被检测出来
每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小
利用已 知起始拷贝数的基体标准物质或质粒标准分子可制备标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵 坐标代表C值
因此,只要获得未知样品的C值,即可通过制备的标准曲线计算出该样品的内标准 基因和某品系的起始拷贝数,计算出的两个目标核酸拷贝数的比值百分数)即为测定品系的相对百分 含量
仪器设备和试剂 S 5.1仪器设备 5.1.1样品粉碎仪或研磨机
5.1.2恒温孵育器或水浴锅 5.1.3实时荧光PCR仪
5.1.4离心机
5.1.5高压灭菌锅
5.1.6涡旋振荡器
5.1.7生物安全柜 5.1.8核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计
5.1.9微量移液器(2AL,10AL,100ML、,200AL10004L). 5.2主要试剂 除特别说明外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格 5.2.1实时荧光PCR预混液:为TaqDNA聚合酶(5U/pL)、PCR反应缓冲液、MgCl3mmol/L 7mmol/L),dNTPs(含dATP,dUTP,dCTP,dGTP)、UNG酶等混合配制的溶液
5.2.2ROX;荧光校正试剂(50×,使用时稀释至1×) 5.2.3引物和探针;根据附录A表A.1的序列合成引物和探针,加双蒸水配制成1004mol/几储备液. 用于实时荧光PCR扩增的引物和探针浓度为104mol/儿
GB/T19495.5一2018 6 检测步骤 6.1取样和制样 按照GB/T19495.7中规定的方法执行
6.2样品DNA的提取与纯化 按照GB/T19495.3的方法或采用具有相同效果的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取
每个样品应制备3个测试样品提取DNA(提取平行重复)
6.3DNA浓度测定和定量 按照GB/T19495.3中规定的方法执行
6.4实时荧光PCR扩增 6.4.1实时荧光PCR反应体系 实时荧光PCR反应体系配制见表1
每个提取平行重复分别进行至少3次内标准基因和品系特 异性序列的扩增反应(扩增平行重复)
表1实时荧光PCR反应体系 名称 储液浓度 终浓度 10 10×PCR缓冲液含量" MgCl 25mol/ 2.5mmol/1 dNTP(含dUTP)" 2.5mmol/1 0.2mmol/1 5U/L 0.075U/4L UNG酶" 上游引物 10mol/1 参考附录A 下游引物 10Amol/L. 参考附录A 探针 104mol/L 参考附录A Taq酶" 5U/Al 0,05U/Al ROX 50 NA模板" 参考附录B进行计算 双蒸水 补足至25Al 反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整
可选用含有CR缓冲液.MgCldNTP和1 1酶等成分的基于Taqman探针的实时荧光CR预混液进行实 Taq 时荧光PCR扩增
RoX荧光试剂仅在具有ROX校正通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加,否则用双蒸水补足
DNA模板加人量参考附录B的说明
6.4.2实时荧光CR反应程序 实时荧光PCR反应参数为:50C/2min;95C/101 min;95/15s,60/60s,40个循环
GB;/T19495.5一2018 注:以上参数可根据不同型号实时荧光PCR仪和所选P(CR扩增体系不同作适当调整
6.4.3仪器检测通道的选择 设置PCR反应荧光信号收集条件,应与探针标记的报告基团一致
具体设置方法可参照仪器使用 说明书
6.4.4实验对照的设立 实验设立以下对照 阳性对照,为目标转基因植物品系基因组DNA,或含有上述片段的质粒标准分子DNA 阴性对照,相应的非转基因植物样品DNA; 空白对照,设两个，一是提取DNA时设置的提取空白对照(以双蒸水代替样品),二是PCR反 应的空白对照(以双蒸水代替DNA模板)
6.5标准曲线制备 6.5.1通用要求 制备标准曲线时需设置至少5个浓度点,且设置的最低浓度点应该尽量接近该扩增目标的定量下 限
标准曲线上的每个浓度应至少做3个平行重复
6.5.2基于基体标准物质的标准曲线制备 将基体标准物质基因组DNA(或基因组DNA标准物质)稀释至合适浓度,后做梯度稀释
如可采 用5倍梯度对DNA模板进行稀释至4×10'拷贝,8000拷贝、1600拷贝、320拷贝和25拷贝,其中 25拷贝为定量下限模板浓度,必须设置
采用稀释后的DNA溶液进行实时荧光PCR扩增制备标准曲 线
每个浓度模板DNA设置至少3个平行重复扩增
扩增后,根据扩增Ct值与样品浓度(拷贝数)对 数值间的线性关系制备标准曲线
标准曲线即以DNA拷贝数的对数作为横坐标,Ct值作为纵坐标作 图,并获得标准曲线方程
6.5.3基于质粒标准分子的标准曲线制备 6.5.3.1标准曲线制备 将含有目标转基因品系和植物内标准基因的质粒标准分子DNA溶液进行梯度稀释
如可采用10倍 梯度稀释至10"拷贝,10'拷贝,10'拷贝、10拷贝、10拷贝和25拷贝,其中25拷贝为定量下限模板浓 度,必须设置
采用稀释后的DNA溶液进行实时荧光PCR扩增制备标准曲线
每个浓度模板DNA 设置至少3个平行重复扩增
扩增后,根据扩增Ct值与样品浓度(拷贝数)对数值间的线性关系制备标 准曲线
标准曲线即以DNA拷贝数的对数作为横坐标,Ct值作为纵坐标作图,并获得标准曲线方程
6.5.3.2cr值测定 在对实际样品中转基因品系进行定量时,需要测定C值,以弥补质粒DNA与植物基因组DNA的 背景差异
采用一定百分比含量的转基因植物材料(包括基体标准物质)基因组DNA(浓度在10拷贝 至10拷贝之间)进行c值的测定
即采用基因组DNA分别扩增内标准基因和品系特异性序列,扩增 反应均设置3个平行重复
然后根据上述基于质粒标准分子获得的标准曲线方程计算出基因组DNA 的内标准基因和品系特异性序列拷贝数,再根据式(1)计算C值 cp.n Cf一 又L cpre
GB/T19495.5一2018 式中 品系特异性序列拷贝数; cpemt 内标准基因拷贝数 Cpe 转基因植物材料目标品系含量,如采用纯合转基因植物材料进行CI值测定,则目标品系 pctgmo 含量为100%
结果分析与计算 7.1质量控制 下述指标有一项不符合者,需重新进行实时荧光PCR扩增 空白对照;内标准基因扩增Ct值>40品系特异性序列扩增Ct值>40; 阴性对照;内标准基因扩增Ct值二30,品系特异性序列扩增Ct值一40 阳性对照;内标准基因扩增Ct值<30,品系特异性序列扩增Ct值<35
被检测的样品核酸浓度应在标准曲线测定范围内,如不在标准曲线测定范围内,则需对样品核酸浓 度进行适当调整后重新进行检测
扩增平行重复测试结果(转基因品系百分含量)的相对标准偏差>25%,或提取平行重复的测试结 果(转基因品系百分含量)的相对标准偏差>35%,则应重新进行实验,重新进行的实验应从制备测试样 品开始
标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)的计算如式(2)和式(3)所示: X，-X SD SD ×100% RSD 式中: 重复次数; X 各测定值; -测定值的平均值
结果计算 7.2 7.2.1样品DNA浓度与拷贝数间的换算 将样品DNA浓度换算为DNA拷贝数可参照式(4)进行计算 6.022×10×cont CPDNA= enN×10又66o 式中 DNA拷贝数 cpDNA DNA量,单位为纳克(ng); contpNA 基因组DNA长度(p)
lenpNN 样品中目标转基因品系百分含量计算 7.2.2 当采用基体标准物质(包括基因组DNA标准物质)制备标准曲线时,样品中目标转基因品系百分 含量按照式(5)进行计算:
GB;/T19495.5一2018 cPent ×100% 5 pctt cped 式中: 目标转基因晶系含量; pctt 品系特异性序列拷贝数; cpen 内标准基因拷贝数
cpd 当采用质粒标准分子制备标准曲线时,样品中目标转基因品系百分含量按照式6)进行计算 cPoan pct ×100% cpe×” 式中: 目标转基因品系含量; pctt 品系特异性序列拷贝数; cpevn 内标准基因拷贝数
cpd 7.2.3样品转基因成分含量计算 每个提取平行重复的转基因品系含量为3次扩增平行重复计算出的转基因成分含量的平均值
样 品的转基因品系含量(%)为3个提取平行重复转基因品系含量(%)的平均值
平均值的计算方法如式 7)所示
(7 pctnl=pctnm十pctrp2十pctms7/3 式中 转基因品系含量; pctnl 重复1转基因含量; pctpl 重复2转基因含量; pctpe 重复3转基因含量
pctp3 注市场上的水稻,玉米和油菜等种子往往是杂交种,单一转基因品系有纯合体和杂合体之分
对于纯合体,其以品系特异性序列拷贝数为依据测得的含量与以重量为依据测得的含量相同
对于杂合体,其以品系特异性序列拷贝数为依据测得的含量仅为以重量为依据测得含量的一半 8 结果表述 8.1定量检测结果表述 定量检测结果有3种可能,分别表述如表2所示
表2定量检测结果表述 检测结果 结果表述 检出物种内标准基因,但未检出目标品系特异性序列 未检出转基因××植物名称)××品系品系名称 检出物种内标准基因和品系特异性序列
检出转基因××(植物名称)××品系(品系名称) 但含量小于定量下限 检出物种内标准基因和目标品系特异性序列 检出转基因×x(植物名称)××品系(品系名称). 含量在标准曲线测定范围内 含量为×% 8.2不确定度计算 按照JF1059.1,SN/T4562的要求计算方法不确定度
GB/T19495.5一2018 9 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2中的规定执行 10定量检测限 各品系特异性序列的实时荧光PCR扩增定量检测限(LOQ)为0.1%(拷贝数百分比)
GB;/T19495.5一2018 录 附 A 资料性附录 实时荧光定量PCR检测引物/探针 实时荧光定量PCR检测引物/探针序列和加人浓度见表A.1
表A.1实时荧光定量PCR检测引物/探针序列和加入浓度 内标准基因 引物 终浓度产物大 物种 序列(5'-3' 备浊 或品系 探针 nM 小/bp 正向 tgcgcctgaacggatat 400 SPs 反向 400 81 cggttgatetttegggatg FAM -BHQ1 探针 200 -tccgagccgtccgtgcgtc 内标准基因 200 正向 tggtgagcgttttgcagtct 反向 64 PLD 200 ctgatccactagcaggaggtcc 探针 FAM-tgttgtgetgccaatgtggectg-BHQ1 200 正向 agagaetggtgatttcagcgg8 400 TT51-1 反向 gcgtccagaaggaaaaggaata 400 119 Bt63) FAM- 探针 200 1agcgeategtesgBHQl 正向 400 agetggcgtaataggaagagg LL.Rice62 反向 400 88 tgctaacgggtgcatcgtcta 探针 FAM-egcaccgattatttatacttttagtccacct-BHQ1 200 水稻 正向 400 tctaggatcCgaagcagatcgt LLRiee601 反向 400 68 ggagggcgCggagtgt 探针 FAM-ccacctcccaacaataaaagcgcctg-BHQ1 200 正向 gettggatcagattgtegttt 400 科丰6 154 反向 400 gtcagataaactgattggtctgat FAM g-BHQ1 200 探针 -cgacaaaagatcaggatttggg！ 正向 300 tccgcaatgtgttattaagttgtctaa 克蜒稻1号 反向 900 78 ccgatatgcctgcccatct 探针 FAM-cgtcaatttgtttacaccacaatatatcceg-BHQ1 100 正向 tggccgtatccgcaatgtg 300 GoldlenRice2 300 121 反向 gctgcgcctctaaccaggtat -BHQ1 150 FAM-t 探针 -tegatatgattccttcatcgagcgagc 正向 15o attgtgatgggacttgaggaaga 棉花ACP1 反向 15o 76 内标准基因 cttgaacagttgtgatggattgtg 探针 FAM-attgtcetettccacegtgattcegaa-BHQ1 50
GB/T19495.5一2018 表A.1(续) 内标准基因 引物 终浓度产物大 物种 序列(5'-3' 备注 或品系 探针 nM) 小/bp 350 正向 agtttgtaggttttgatgttacattgag SAH7 反向 115 250 内标准基因 gcatctttgaaccgcctactg 探针 FAMaaacataaaataatgggaacaaccatgacatgt-BHQ1 175 正向 150 tcccattcgagtttctcacgt MON531 反向 150 72 aaccaatgccaccccactga 探针 FAM-ttgtecetccaettettetc-BHQ1 50 150 正向 ggagtaagacgattcagatcaaacac Mol445 150 反向 87 atcgacctgcagcccaagct FAM-atcagattgtcgtttcccgccttcagttt-BHQ1 5o 探针 正向 150 gttactagatcggggatatce 882 MON15985 反向 150 aaggttgctaaatggatggga 探针 FAMccgctctagaactagtggatctgcactgaa-BHQ 50 正向 ggetggectaccttaagagagte 500 500 94 MON88913 反向 caaattacecattaagtagccaaattae FAM MGBNFQ 探针 100 l-aaetatcagtgtttgactacat-" 正向 400 cagatttttgtgggattggaattc 棉花LLCotton25 反向 400 79 caaggaactattcaactgag 探针 FAM-ettaae taacagtacteggcegtegaccgc-BHQ1 200 正向 400 caaatacacttggaacgacttcgt GHB614 反向 400 l19 gcaggcatgcaagcttttaaa 200 探针 FAM-etccatggcgatcgectacgttctagaatt-BHQ1 350 正向 ctcattgctgatccatgtagatttc 281-24-236 45o 111 反向 ggacaatgctgggetttgtg 探针 FAM-ttgggttaataaagtcagattagagggaacaa-BHQ1 175 正向 400 aaatattaacaatgcattgagtatgatg 3006-210-23 反向 400 90 actctttctttttctccatattgacC 探针 FAM-tactcattgctgatccatgtagatttcccg-BHQ1 150 agcgcgcaaactaggataaat 正向 400 T304-40 反向 400 78 ccetagatettgggataacttgaaaaga FAM-tcgcgegcggtgtcatctatctc-BHQ 探针 200 正向 400 ccagtactaaaatccagatcatgca GBH119 反向 400 90 gaaattgcgtgact gactcaaattcC 探针 FAM-cetgeaggtcgacggcegagtac-BHQ1 200 10
GB;/T19495.5一2018 表A.1(续 内标准基因 引物 终浓度产物大 物种 序列(5'-3' 备注 或品系 探针 nM 小/bp 正向 300 catactcattgctgatccatgtaga 棉花MON88701 反向 300 88 agtgttaaacaagttatgttctagagc 探针 FAM-ttccceggacatgaagccttaattcaat-BHQ1 25o 正向 150 ccagcctcatggccaaag ADHl 反向 150 70 内标准基因 ccttcttggcggcttatctg 探针 FAMcttaggggcagaetcecgtgtteect-BHQ1 50 250 正向 gggataagcaagtaaaagcgcte 59122 250 反向 86 ccttaattctccgctcatgatcag FAM-tttaaactgaaggcgggaaacgacaa-BHQ1 200 探针 正向 750 gcggaacccctatttgttta 770 Btll 反向 750 tccaagaatccctccatgag 探针 FAMaaatacattcaaatatgtatcegctca-BHQ1 250 正向 ggccgtgaacgagctgtt 100 600 82 Bt176 反向 gggaagaagcetacatgtctaa" FAM- -BHQ1 探针 200 AM-agcaaccagatcggccgacacc 450 正向 ctctgtaacagaaaacaccatetagag MON87411 450 109 反向 acaaaagtgaactagttctagggtagat 探针 FAM-ccgegttaaactatca tatcagtgtttagagaat-BHQ 200 玉米 正向 350 cacgaaccattgagttacaatc DAS40278 反向 ggttcattgtattctggctttg 350 98 探针 150 FAM-cgtagctaacettcattgtattccg-BHQ1 正向 500 gtgtgtatgtctctttgcttggtectt 98140 500 反向 gattgtcgtttcccgccttc 80 探针 FAM-etctategatccccctctttgatagttaaact-BHQ1 20o 正向 150 cttatcgttatgctatttgcaactttagal GA21 反向 150 112 tggctcgcgatcctcct 探针 FAMcatatactaactcatatctctttctcaacagcaggtgggtBHHQ1 50 tgggttcagtetgcgaatgtt 正向 150 LY038 11 反向 150 aggaattcgatatcaagettatega FAM -BHQl 50 探针 -egagcggagtttatgggtegacgg-l 正向 300 gcgeggtgtcatctatgttactag MIR162 反向 92 300 tgccttatctgttgccttcaga 探针 FAMtetagaceaattcagtacattaaaaacgtcegcca-BHQ 150 1
GB/T19495.5一2018 表A.1(续) 内标准基因 引物 终浓度产物大 物种 序列(5'-3' 备注 或品系 探针 nM) 小/bp 正向 600 gcgcacgcaattcaacag MIR604 反向 300 76 ggtcataacgtgactcccttaattect 探针 FAM-aggcgggaaacgacaatctgatcatg-BHQ1 200 正向 300 tcgaaggacgaaggactctacgt 92 MON810 反向 300 gccaccttccttttccactatctt 探针 FAMaaeatectttgccattgeecagcBHHQ1 180 150 正向 gtaggatcggaaagettggtac MoN863 150 反向 84 gttacggcctaaatgctgaaet FAM- a-BHQ 5o 探针 -tgaacacccatccgaacaagtagggtca-！ 正向 600 cacgttgaaggaaaatggattg 882 MON87460 反向 600 tcgcgatcctcctcaaagac 探针 FAMagggagtatgtagataaatttcaaaggttagacggcBHQl 250 正向 150 gagcaggacctgcagaagct 95 MON88017 反向 ccggagttgaccatcea 150 FAM t-BHQ 探针 50 -tcccgccttcagtttaaacagagtcgggtl 正向 450 ttctccatattgaccatcatactcatt 玉米MON89034 反向 450 77 Cggtatctataataccgtggtttttaaa 探针 FAM-ate -atccceggaaattatgtt-MGBNFQ 100 正向 150 atgaatgacctcgagtaagcttgttaa NK603 反向 150 108 aagagataacaggatccactcaaacact 探针 FAM-tggtaccacgcgacacacttccactc-BHQ1 50 400 正向 acaagcgtgtcgtgctccac T25 反向 102 gacatgatactccttccaccg 400 探针 FAM-tee -tcattgagtegttcegccattgtcg-BHQ1 200 正向 300 tagtcttcggccagaatgg TC1507 反向 300 58 ctttgccaagatcaagcg 探针 FAM-taactcaaggccetcactccg-BHQ1 150 tcatcagaccagattctettttatgg 正向 250 3272 反向 250 95 egtttcccgcettcagttta FAM -BHQ1 探针 200 I-actgctgacgcggccaaacactg- 正向 300 ccactgaacgtcaccaagaaga 反向 85 VCO-01981-5 300 gccgctactcgagggattta 探针 FAMcagtacteaaacaetgatag-MGBNFQ 200 12
GB;/T19495.5一2018 表A.1(续 内标准基因 引物 终浓度产物大 物种 序列(5'-3' 备注 或品系 探针 nM 小/bp 正向 350 catggccgtatccgcaatgtg 5307 反向 35o 107 tgcaccctttgccagtgg 探针 FAM-accacaatataccetcttccctgggccag-BHQ1 125 玉米 正向 450 acggaaacggtcgggtcaaatg 95 MON87427 反向 450 ccatgtagatttcccggttttctc 探针 FAM-tcgggacaatatggagaaaaagaaagag-BHQ1 200 200 正向 ggccagggtttccgtgat 反向 内标准基因 CruA 200 10l ccgtcgttgtagaaccattgg FAM-agtccttatgtgctccactttctggtgca-BHQ1 200 探针 正向 150 ccatattgaccatcatactcattgct GT73(RT73) 反向 150 108 gcttatacgaaggcaagaaaagga 探针 FAM-tccatgtagatttcccggacatgaagatca-BHQ1 50 正向 400 ccttgaggacgctttgatcatatt MS8 130 反向 cetttettatcgaccatgtacte 400 FAM -BHQ1 探针 200 M-ecgagttcgaeggccgagtactg-l 400 正向 agcatttagcatgtaceatcagaca RF3 40o 反向 139 cataaaggaagatggagacttgag 探针 FAM-egcacgcttategaccataagccea cca-BHQ1 200 正向 400 acgctgcggacatctacatt 油菜MS 反向 ctagateggaagctgaagatgg 400 187 探针 FAMetcattgctgatccacctagcegactt-BHQ1 200 正向 400 ctaagggaggtcaagatgtagC RF1 400 113 反向 cgggcctaaettttggtgtg 探针 FAM-etcatcatcctcacccagtcagcatca-BHQ1 20o 正向 400 gggtgagacaa ccaatatatcgacg RF2" 反向 400 101 gggcatcgcaccggtgag 探针 FAM-caccggccaaattcgctcttagccgtBHQ1 200 caatggacacatgaattatge 正向 400 T45 反向 400 123 gaetetgtatgaactgttcge FAM-tagaggacctaacagaactegccgt-BHQ 探针 200 正向 600 gttcttctcttcatagctcattacagtttt 反向 84 73496 600 caaacctccatagagttcaacatcttaa 探针 FAMttagttagatcaggatattctt-MGB 250 13
GB/T19495.5一2018 表A.1(续) 内标准基因 引物 终浓度产物大 物种 序列(5'-3' 备注 或品系 探针 nM) 小/bp 正向 400 gttgcggttctgtcagttce 反向 400 Topas19/2 95 cgaccggcgctgatatatga 探针 FAM-tceegcgtcatcggeg-BHQ1 200 正向 450 tccttgaaccttattttatagtgcacal 油菜MON88302 反向 450 101 tcagattgtcgtttcccgccttca 探针 FAMtagteatcatgttgtaecaetteaaacaet-BHQ1 200 500 正向 ctaacttttggtgtgatgatgctga" oXY-235 124 反向 500 gatagatggtggtgtgagtcttg FAM-agctgatggcaagttaatctccccgaagtcg-BHQ 250 探针 正向 650 ccagcttcgccgcttccttG 774 leetin 反向 650 内标准基因 gaaggcaagccc gcccatctgcaagcc 探针 FAM-cttcaccttctatgcccctgacacBHQ1 180 正向 teatteaaaataagatcatacatacaggt 150 84 GTS40-3-2 反向 ggcatttgtaggagceacet 150 FAM -MGBNFQ 探针 50 ccttttccatttggg-" 正向 600 catactcattgctgatccatgtagatt MON87769 反向 87 600 gcaagttgctcgtgaagttttg 探针 FAM-cceggacatgaagccatttacaattgac-BHQ1 200 正向 400 gcaaaaaagcggttagctcct 64 A2704-12 反向 attcaggctgcgcaactgtt 400 200 探针 FAM-cggtcctccgatcgccecttcc-BHQl 大豆 400 正向 gctatttggtggcatttttcca A5547-127 反向 75 cactgcggccaacttacttct 400 探针 FAM-cggtcetccgategecettcc-BHQ1 200 正向 550 cgtgttctctttttggctagc DP305423 反向 550 93 gtgaccaatgaatacataacacaaacta 探针 FAMtgacacaaatgatttteatacaaaagtegaga-BHQ1 100 gtcegaataggctaggttacgaaaaa 正向 750 DP356043 反向 750 99 tttgatattettggagtagacgagagtgt FAM- -BHQ1 探针 200 -ctetagagatccgtcaacatggtggagcac- 正向 400 agatttgatcgggctgcagg 反向 400 70 FG72 gcacgtattgatgaccgcatta 探针 FAMaatgtggttcatcegtctt-MGBNFQ 200 14
GB;/T19495.5一2018 表A.1(续 内标准基因 引物 终浓度产物大 物种 序列(5'-3' 备注 或品系 探针 nM 小/bp 150 正向 tcccgctetagcgcttcaat MON89788 反向 15o 139 tcgagcaggacctgcagaa 探针 FAM-etgaaggcgggaaacgacaatctg-BHQ1 50 正向 450 ttcccggacatgaagccatttac MON87705 反向 450 86 acaacggtgccttggcccaaag 探针 FAM-aagagactcagggtgttgttatcactgcgg-BHQ1 250 600 正向 ggtgatatgaagatacatgcttagcat MO87701 反向 600 89 cgttcccgcettcagtttaaa FAM -BHQ1 250 探针 -tcagtgtttgacacacacactaagcgtgcc 正向 400 aacagaagtttcgttgagctttaagac 88 CV127 反向 400 cattcgtagctcggatcgtgtae 探针 FAM-tttggggagctgteccatgccc-BHQ1 100 正向 catacteattgctgatccatgtag 300 MON87708 300 91 反向 agaacaaattaacgaaaagacagaacg FAM -BHQ 探针 150 I-tcccggactttagctcaaaatgcatgta-l 大豆 550 正向 gtacattaaaaacgtccgcaatgtg" DAS68416-4 反向 550 130 gtttaagaattagttcttacagtttattgttag 探针 FAM-ttaagttgtetaagegtcaata-MGBNFQ 150 正向 400 tctagctatatttagcaG Icacttgatattcat DAS81419 反向 400 105 gcttcaagatcccaacttgcg 120 探针 FAM-atcaacaggcaccgatgcgcaccg-BHQl 正向 300 ttattgttcttgttgtttcctctttagg DAs44406-6 300 99 反向 cctcaattgcgagctttctaattt 探针 FAM-atteggacctceatgatgaccttacegtt-BHQ 180 正向 500 ctaaattgctctttggagtttattttgtag 887 MON87751 反向 500 ggcctaacttttggtgtgatgatg 探针 FAM-tgactggagatctecaaagtgaggggaaa-BHQ1 300 正向 gggaattgggtaccatgce 600 sYHToH2 600 88 反向 tgtgtgccattggtttagggt FAM-e a-BHQ1 探针 200 lccageatggccgtatccgcaa- 正向 400 ggacatgtgaagagacggagC 马铃薯 UGPase 反向 400 88 内标准基因 cctacctctacccctccg 探针 FAM-etaceaccattacetcgcacctcetca-BHQ 200 15
GB/T19495.5一2018 表A.1(续) 内标准基因 引物 终浓度产物大 物种 序列(5'-3' 备注 或品系 探针 nM) 小/bp 正向 300 ggtcaaaacacaatttacagca 马铃薯 反向 134 EH92-527-1 300 tcccttaattctccgctcatga 探针 FAM-agattgtcgtttccegcettcagtt-BHQ1 160 正向 150 gacctccatattactgaaaggaag GS 反向 150 118 内标准基因 gagtaattgctccatcctgttca 探针 FAM-ctacgaagtttaaagtatgtgccgcte-BHQ1 100 甜菜 400 正向 gggatctgggtggctctaact H7-1 反向 400 l08 aatgctgctaaatcctgag FAM-aaggcggaaacgacaatct-BHQ1 100 探针 正向 500 ccatgcggatcctccca 774 CHY 反向 500 内标准基因 catcgtagccattgtaacactagctaa 探针 FAMttccettcatccattcccactcttgaga-BHQ1 200 木瓜 正向 400 gacgagtacaaggagacgcC 400 HuanongNo,1 反向 gttgtcactgaagegggaag8 174 FAMt -BHQ1 探针 200 Ftggctgctattgggcgaatcaactac 16
GB;/T19495.5一2018 附录B 资料性附录 植物基因组DNA大小和扩增模板加入量 植物基因组DNA大小和实时荧光PCR模板加人量见表B.1
表B.1植物基因组DNA大小和实时荧光CR模板加入量 基因组DNA 定量下限为0.1%时DNA模板最低加人量/ng 物种名称 大小/MB 按照可准确定量的基因组DNA为25拷贝计算 大豆 1l15 30 玉米 2292 62.8 2118 58 棉花 油菜 1100 30.1 水稻灿稻 466 12.8 马铃薯 1597 43.8 甜菜 507 13.9 17
转基因产品检测实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测方法GB/T19495.5-2018
转基因技术已经广泛应用于生物制品、医药、农业等领域。随着转基因产品的增加，对于这些产品的检测变得越来越重要。实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）是目前最为常用的转基因产品检测方法之一。
PCR技术是一种在试管中扩增DNA序列的方法，其核心是一个特殊的酶——聚合酶。PCR可以将微小数量的DNA扩增成为足够多的DNA片段，从而实现DNA的检测和分析。PCR技术在转基因产品的检测中具有重要作用。
实时荧光定量PCR是一种集PCR扩增和荧光探针检测于一体的技术。该技术通过添加荧光探针，可以实时监测PCR反应过程中产生的DNA量，并将其与设定的阈值进行比较，从而判断目标基因是否存在。
GB/T19495.5-2018是我国针对转基因产品检测制定的标准之一，规定了转基因产品检测的基本要求、检测方法、检测原则等。该标准中包括实时荧光定量PCR等多种检测方法。
使用实时荧光定量PCR检测转基因产品的具体步骤如下：
- 提取DNA：从样品中提取出待检测的DNA。
- PCR扩增：将DNA在PCR反应体系中进行扩增。
- 荧光探针检测：在PCR扩增反应过程中，加入荧光探针进行实时信号检测。
- 数据分析：根据荧光信号强度和阈值进行数据分析，判断目标基因是否存在。
实时荧光定量PCR检测方法具有高灵敏度、高特异性、高效率等优点。该方法可应用于食品、农产品、医药制品等转基因产品的检测。但是，该方法的缺点是需要昂贵的PCR仪器和配套试剂。
总之，实时荧光定量PCR是一种非常重要的转基因产品检测方法。符合GB/T19495.5-2018标准的实验操作可以有效地保证检测结果的可靠性和准确性。
