多肽抗菌性测定抑菌圈法

多肽抗菌性测定抑菌圈法

国家标准 GB/T39101一2020 多肽抗菌性测定抑菌圈法 Determinationofantimierobialaetivityforpolypeptides一Inhibitionzonemethod 2020-09-29发布 2021-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/39101一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口 本标准起草单位;北京工商大学、河北科技大学、深圳市计量质量检测研究院、河北农业大学、北京 萨姆伯科技有限公司、武汉明了生物科技有限公司、浙江东杰生物科技有限责任公司、市场监督管理总 局食品审评中心,测试技术研究院生物研究所 本标准主要起草人:贾英民、马爱进、王志新、田益玲、郝帅、彭海、周李华、杨志坚、郑燕燕、郑刚 陈晶,姜雨、杨国武
GB/39101一2020 多肽抗菌性测定抑菌圈法 范围 本标准规定了多肽抗菌性的抑菌圈测定方法 本标准适用于多肽抗细菌性能和抗丝状真菌性能的测定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 多肽polypeptides 介于氨基酸和蛋白质之间,由2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物 3.2 抑菌圈inhibhitionzone 固体培养基表面与试样接触边界处无菌繁殖的环带区域 3.3 抗菌性antimierobialaetivity 抑制微生物繁殖的能力,以抑菌效价U值(AU)来表示 原理 利用多肽在固体平板中与测试指示菌接触后,使其周围的菌株生长受到抑制,形成无菌繁殖区域 根据测试菌在固体平板表面表现出的抑菌圈直径,计算抑菌效价U值来判定活性 5 试剂或材料 除非另有说明,本方法所用的试剂均为分析纯,实验用水为GB/T6682规定的一级水 生理盐水 5.1 0.85%生理盐水;称取8.5总氯化钠于容量瓶中,用一级水溶解并定容至1000mL 121C士1C 高压蒸汽灭菌20min
GB/T39101一2020 5.2培养基 营养肉汤培养基(NB)、营养琼脂培养基(NA、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA),配制参见附 录A 5.3指示菌标准菌株 革兰氏阳性细菌:金黄色葡萄球菌(Sahylococcusaureus)CICc10473(cGMCcC1.8721、 ATcc29213),藤黄微球菌(Mercccusluteus)cIcc10269(cGMcc1.3749,ATcc10240),蜡样芽袍 杆菌(Bacilluscereus)CICC10277(CICC10468、ATCC11778) 革兰氏阴性细菌;大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)cIcc10305(cIcCc23657、cGMcc1.2385、 ATCC25922)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella4yphimwrium)CICC22956(ATCC14028),铜绿假单胞菌 Pseudomonasaeruginosa)CICC10351(CICC23694.CGMCC1.2421、ATCC9027) 丝状真菌:黑曲霉(Aspergillusniger)CICC2463(CGMCC3.5487、CICC40372、ATCC16404),产 黄青霉(Penieiiumchrygewm)cIcc40654(cGMcc3.7894,ATcc10106),桔青霉(Penicilliun" citrinum)CICC2478(ATCC9849 仪器设备 6 6.1恒温培养箱;温度精度1C 6.2电子天平;感量为0.0001廷和0.01g 6.3分光光度计;波长范围为190nm~900nm 6.4游标卡尺或抑菌圈测量仪;精度0.02mm~0.1mm 6.5血球计数板;16格×25格或25格×16格 6.6玻璃平皿;直径为90mm,底部平整 6.7不锈钢牛津杯;内径6.0mm士0.1mm,外径7.8mm士0.1nmm,高10.0mm士0.l mm 试验步骤 7.1抗细菌性能测定 7.1.1样品制备 称取多肽样品10.0mg,水溶性好的样品采用无菌缓冲液溶解与定容,水溶性差的样品先溶于无水 乙醇再用无菌缓冲液定容至1.0ml,使其浓度为10.0mg/ml,作为储备液,4C一6C冰箱中保存,应 在一周内使用 使用时,采用无菌缓冲液将多肽储备液进行稀释,制备成至少5个不同浓度的待测溶 液,浓度的选择应使抑菌圈直径8.00mm一25.00mm,且线性方程R'>0.9900 7.1.2指示菌悬液制备 7.1.2.1菌种活化 将指示菌接种于5.0mLNB培养基的试管,36C士1C,200r/min士1r/nmin培养18h一24h进 行第一次传代培养;取第一代培养液接种于5.0mlNB培养基的试管,36C士1C,200r/nin士1r/min培 养18h24h进行第二次传代培养;取第二代培养液接种于5.0mLNB培养基的试管或50.0mLNB 培养基的锥形瓶,36C士1,200r/min士1r/min培养至指示菌的稳定期,作为第三代培养液
GB/39101一2020 7.1.2.2菌悬液制备 预先按照GB4789.2进行指示菌的菌落计数,建立菌落数与吸光度值(ODo)的对应关系;将第三 代培养液调整至合适的吸光度值,使其菌悬液浓度为1×10'CFU/mL5×10'CFU/mL 7.1.3检测平板制备 将配制的NA培养基加热溶解,冷却至45C50C,将制备的指示菌菌悬液按照1%的添加量加 人NA培养基中,充分混合均匀,量取20mL倾倒人灭菌平皿,轻轻摇动平皿使之均匀铺平,待其凝固 后备用 7.1.4测定 在含有指示菌的检测平板中等距离安放5个6个牛津杯,轻轻按压,量取多肽样品100L,缓级 加人牛津杯中,每个处理重复3次 将平板移人46C冰箱中预扩散4h~10h,取出平板,放人 36士1笔恒温培养箱中,正置培养至抑菌圈清晰,采用游标卡尺或抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径,每 个抑菌圈沿不同方向测量3次,并记录平均值 以多肽稀释倍数倒数的对数值为横坐标,以抑菌圈直径为纵坐标,建立线性方程(R'>0.9900) 杆菌肽对S. ATCC25923的线性关系图参见附录B的图B.1 qreS 7.2抗丝状真菌性能测定 7.2.1样品制备 同7.1.1 7.2.2指示菌袍子悬液制备 7.2.2.1 菌种活化 将指示菌抱子或菌悬液接种于PDA培养基的固体平板上,29C士1C恒温培养48h一72h,作为 第一代袍子培养物;取第一代袍子培养物接种于PDA培养基的固体平板上,29C士1C恒温培养48h~ 72h,作为第二代袍子培养物;取第二代袍子培养物接种于PDA培养基的固体平板上,29C士1C恒温 培养48h一72h,作为第三代袍子培养物 7.2.2.2袍子悬液制备 将第三代袍子培养物用0.85%生理盐水洗脱抱子，血球计数板计数,将抱子浓度调整至1× 10'CFU/mL5×10CFU/mL 7.2.3检测平板制备 将配制的PDA培养基加热溶解,冷却至45C一50,将制备的指示菌抱子悬液按照1%的添加量 加人PDA培养基中,充分混合均匀,量取20mL倾倒人灭菌平皿l,轻轻摇动平板使之均匀铺平,待其凝 固后备用 7.2.4测定 在含有指示菌的检测平板中等距离安放5个6个牛津杯,轻轻按压,量取多肽样品100AL,缓缓 加人牛津杯中,每个处理重复3次 将平板移人4一6C冰箱中预扩散4h~10h,取出平板,放人 29C士1C恒温培养箱中,正置培养18h24h至抑菌圈清晰,此时指示菌为菌苔状,基本还未形成菌
GB/T39101一2020 丝;采用游标卡尺或抑菌圈测量仪测定抑菌圈直径,每个抑菌圈沿不同方向测量3次,并记录平均值 以多肽稀释倍数倒数的对数值为横坐标,以抑菌圈直径为纵坐标,建立线性方程(R'>0.9900). 硫酸多粘菌素B对A nigerATCC16404的线性关系图参见图B.2. 8 试验数据处理 抗菌性按式(1)计算 U= XIX 式中 U 抗菌效价,单位为AU每毫克(AU/mg); -样品的测定体积,单位为毫升(mL); X 线性方程的X轴截距; -样品的初始测定浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL. 计算结果以3次平行测定值的算术平均值表示,保留两位有效数字
GB/39101一2020 附 录 A 资料性附录 培 养 基 A.1营养肉汤培养基(NutrientBroth,NB) A.1.1将蛋白陈10g牛肉膏3g、氯化钠5g放人1000ml一级水中,煮沸溶解,调节pH值至7.2~ 7.4,分装后于高压蒸汽灭菌器中,121C土1C灭菌20min A.1.2可采用市售的商业培养基,使用时严格遵照制造商的使用说明 A.2营养琼脂培养基(NutrientAgar,NA ml一级水中,煮沸溶解,调节pH A.2.1将蛋白陈10g、牛肉膏3g、氧化钠5g、琼脂15g放人10001 值至7.2~7.4,分装后于高压蒸汽灭菌器中,121C士1C灭菌20min A.2.2可采用市售的商业培养基,使用时严格遵照制造商的使用说明 A.3马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PotatoDextrose Aeae,PDA 120 A.3.1将去皮切块马铃薯200区放人100ml一级水中,煮沸10minr min,用纱布过滤,补加一 级水至1o0ml 加人葡萄糖2g.琼脂15g,加热溶化，调节pH值至5.4一5.8.115C土1C灭菌 20min A.3.2可采用市售的商业培养基,使用时严格遵照制造商的使用说明
GB/T39101一2020 附 录 B 资料性附录) 抗菌性测定线性关系图 B.1抗细菌性能测定 杆菌肽二倍梯度稀释5个浓度,浓度范围为0.0625mg/mL2.0mg/mL 杆菌肽对s.awreus ATcC25923的线性关系图见图B.1 第1 8- 16- 4 试验 试验 0- 试验三 -1.4 -1.0-08-06-0.4-02 0.0 0.2 g(4/n) 图B.1杆菌肽对S Arcc25923的线性关系图 areIS B.2抗丝状真菌性能测定 碗酸多粘菌素B二倍梯度稀释5个浓度,浓度范围为0.125mg/mL一4.0mg/mL 硫酸多粘菌素 nigerArcc160!的线性关系图见图B2 B对A， 2 20 18- 16- 心 12- 0- -L6-4---d-dG-d-ao 02 g(1/m 图B.2硫酸多粘菌素B对A nigerATcC16404的线性关系图

多肽抗菌性测定抑菌圈法GB/T39101-2020

多肽是由氨基酸组成的一种生物大分子，具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒等作用。目前，多肽被广泛应用于医药、农业等领域。

为了评估多肽的抗菌活性，科学家们开发了各种不同的实验方法。其中，抑菌圈法是最常用的一种方法之一。抑菌圈法通过观察菌落周围的清晰区域大小来评估抗菌剂的抗菌能力。

2015年，GB/T39101-2020标准正式发布，规范了多肽抗菌性测定抑菌圈法的实验要求和操作步骤，提高了多肽抗菌性测定的准确性和可重复性。

多肽抗菌性测定抑菌圈法GB/T39101-2020的实验方法

多肽抗菌性测定抑菌圈法GB/T39101-2020包括以下步骤：

1. 制备细菌培养基

根据不同的细菌类型选择合适的培养基，按照标准操作程序制备细菌培养基。将培养基倒入培养皿中，待其凝固后，在培养皿上均匀播种待测菌株。

2. 布施待测样品

将待测的多肽样品均匀涂布在培养皿表面，让其在培养皿上干燥10-15分钟。

3. 培养

将涂有多肽样品的培养皿在适宜温度下进行培养，一般培养24小时左右。

4. 观察抑菌圈

观察培养皿上菌落周围的清晰区域大小，使用尺子等工具测量抑菌圈的直径。

5. 数据处理

根据测得的抑菌圈直径大小，计算出多肽样品的抑菌能力，通常用抑菌圈直径平均值来表示多肽样品的抗菌效果。

总结

多肽抗菌性测定抑菌圈法是一种常用的实验方法，可以用于评估多肽的抗菌能力。GB/T39101-2020标准规范了该方法的操作步骤和实验要求，提高了评估结果的准确性和可重复性。

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