GB/T27637-2011
副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法
Real-timePCRmethodforthedetectionofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2012-04-01
- 文件格式PDF
- 文本页数10页
- 文件大小395.35KB
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副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法
国家标准 GB/T27637一2011 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法 Real-timePCRmmethodforthedetectionof Mycobacteriumnaviumsubsp.paratubercnlosis 2011-12-30发布 2012-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27637一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口
本标准起草单位;广东出人境检验检疫局、吉林农业大学、北京盈九思科技发展有 限公司
本标准主要起草人:刘中勇、陈茹、杨国海、高云航、曾碧健、朱道中吴晓薇、高小博
GB/T27637一2011 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了副结核分枝杆菌Msycobacderiumawiumsubsp.arulubverculosis)实时荧光PCR检 测方法的技术要求和操作规范
本标准适用于快速检测培养物、血样、奶样,粪便和组织等临床样品中副结核分枝杆菌
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T66822008分析实验室用水规格和试验方法 GB19489一2008实验室生物安全通用要求 缩略语 下列缩略语适用于本文件
C'值;荧光信号量达到设定的闵值时所经历的循环数
dNTP.deoxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核苷三磷酸 DMsoO;dimethylsulfoxide,二甲基亚飘
EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid.乙二胺四乙酸
PBS;phosphatebufersolution,磷酸盐缓冲液 PCR: R;polymerasechainreaction,聚合酶链式反应
Taq;TaqDNA聚合脖
UG酶:uracilDNAgycosylase,尿喀DNA糖基化酶 原理 本标准方法采用了TaqMan探针实时荧光PCR技术原理
反应体系中包括一对用于扩增DNA 的引物,和一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针
探针的5'端标记了被称为报告基团的荧光 素,3’端标记了淬灭基团
在进行PCR延伸反应时,Taq酶的5’外切酶活性将5'端荧光基团从探针上 切割下来,使其与悴灭基团分离,从而仪器能检测到5'端荧光基团所发出的荧光信号，一分子PCR扩 增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生
随着扩增循环次数的增加,仪器检测到的荧光信号的累积 反应了扩增产物量的变化
本标准方法以副结核分枝杆菌特异的F57基因序列为模板,设计特异扩增 引物和探针建立荧光PCR反应体系
材料与试剂 5.
1 仪器与耗材 5.1.1接种棒
GB/T27637一2011 1.2无菌注射器或真空采血管
5. 55 1.3灭菌容器
5. .1.4橡胶管
5.1.5刮匙
5. 1.6荧光PCR仪
1.7恒温水浴锅(室温至100) 5. 我.L.8离心机最高离心力达1500x居以上 51.9混勾器 冰箱(2C8C,一20,一80C)
. .1.11天平(精密度达千分之一以上) 1.12微量可调移液器(10L.00AL.I0or 55 0l)
55 1.13微量带滤芯吸嘴(10AL,100L,1000AL)
研钵
5.1. 14 55. 1.15离心管
5.1.16PCR光学反应管
5.2试剂 试剂级别除另有规定,本方法试验用水应符合GBy/T6682一2008规定的二级水,所用化学试 5.2.1 剂均为分析纯
5.2.2引物与探针;采用无DNA酶,无RNA酶水将每条引物与探针配制成1004mol/L
储存液,置 20C或更低温度冻存;使用时取适量配制成10Amol/L工作液，避免多次冻融
上游引物: GTcAGcGGcGGTcCAG3',下游引物5’GCAGCTccAGATcGTCATTc3’,探针:5’FAM
5 AcGAGCAcGCAGGCATTcCCAAGTc3'-BHQ-1
0.01mol/几LpH7.6PBS配方见A.1
柠檬酸钠缓冲液:;配方见A.2
0.5mol/儿EDTA;配方见A.3. 5 2. 柠檬酸钠-磷酸缓冲液;配方见A.4 6 55 .2.74%氢氧化钠溶液;配方见A.5
2.84%硫酸溶液;配方见A.6 5 5 .2.9Tritonx-100.
2.10DNA提取液;含100mmol/LTris-HC(pH8.0).0.01%TritonX-100,200ug/aL蛋白酶K
55 也可采用等效商品化试剂
灭菌双蒸水
5.2.11 5.2.12三氧甲烧 5.2.13异丙醉
5.2.14无水乙醇
5.2.1570%乙醇;用新开启的灭菌双蒸水配制,一20C预冷
5.2.16荧光PCR反应缓冲液;含50mmol/L
KClI,10mmol/LTris-HCIpH8.3),2.5mmol/L MgCl,.5%二甲基亚硕(DMsO).5%甘油
可采用等效商品化试剂
5.2.17dNTP:dATP,dUTP.dCTP和dGTP
Taq酶
5.2.19 UDG酶
GB/T27637一2011 6 生物安全要求 采样,样品处理及检测过程所涉及的实验操作,应遵守GB194892008的有关规定
采样 7.1样品采集 7.1.1培养物 直接取液体培养基培养的菌液;对于在固体培养基上生长的菌落,用接种棒挑取适量(取用量达到 肉眼可见,菌团大小不超过接种环)菌样,放到0.01mol/LpH7.6PBS中,振荡混匀形成悬浮菌液
7.1.2血样 用无菌注射器或真空采血管,无菌自动物静脉采血,无菌分离血清
用无菌注射器或真空采血管,无菌自动物静脉采血,将血液直接滴人抗凝剂中,并立即连续摇动,充 分混合
抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液,或0.5mol/LEDTA
每6mL血液加1nm抗凝剂
条件允许时,建议优先采集全血,以更有利于富集菌体
7.1.3奶样 无菌采集奶液于灭菌的容器中
一般以后段奶液含菌量较多,早晨挤出的奶液含菌量较高
7.1.4粪便 取新鲜粪便,选取腹泻粪便或混有粘液、血液、粘膜的粪便,或用刮匙从动物直肠深部(约30em)取 少量粘液粪便,盛于灭菌容器中
组织 7.1.5 选取有明显病变的肠段、回盲瓣以及病肠相邻部位的淋巴结
样品的保存和运输 待检样品在2C一8C保存不应超过24h;一20C保存不超过三个月;一80C以下长期保存
样品 应置于低温、密封的容器内运输
操作方法 样品前处理 8.1.1血样,培养物(菌液)前处理 取】ml一2ml
全血样品,1500X片离心10mim,弃上清,加等体积灭菌双燕水充分振荡 15000X离心10min;弃上清,若红血球裂解不完全,需采用灭菌双蒸水重复洗涤;收集沉淀物,继续 进行核酸提取,或置一20C贮存备用
取1mL2mL
血清、菌液样品,15000×g离心10min,弃上清,加1mL0.01mol/LpH7.6PBS. 充分振荡混匀,15000×g离心10min;弃上清,收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一-20备用
GB/T27637一2011 8.1.2奶样前处理 取10ml.奶液,加100LTritonX-100,振荡混匀,2500×g离心20min;弃上清,取沉淀,加lml. 0.01mol/LpH7.6PEBS,充分振荡混匀,将沉淀悬浮液移人微量离心管,15000×片离心10min;弃上 清,收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一20C贮存备用
8.1.3粪样前处理 取粪样1g一2g,按1:5的比例加人4%硫酸溶液(例如1只粪样,加5mL液体)充分振荡混匀,室 温静置0.5h1h;取上层约3mL液体(避免吸取粗渣),5000×发离心1min,取上清,15000×片离心 10min;弃上清,加等量0.01mol/1pH7.6PBS,振荡混匀,使沉淀充分悬浮,15000×片离心10min;弃 上清,重复本步骤1次;收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一20C贮存备用
8.1.4组织样品前处理 取适量组织样品(剔除脂肪、被膜),勇碎,按1:5的比例加人柠檬酸钠-磷酸缓冲液(例如,1只组织 样品,加人5mL缓冲液),充分研磨;加等量4%氢氧化钠溶液,继续研磨5min一10min,使组织液化 充分振荡,75丫温浴0.5h~1h;取上清避免吸取粗渣),15000×迟离心10nmin;弃上清,加等量 Y 0.lmolLpH7.6Ps,振荡混匀,使沉淀充分悬浮,1l5o0x片离心10mim,弃上清,重复本步骤1次 收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一20贮存备用
8.2核酸提取 在上述已完成前处理的样品(沉淀物)中加人50l一100LDNA提取液,充分振荡混匀,56C温 浴301 min,98C100C加热10 min， n,瞬时离心使液滴聚集管底,加等体积三氯甲烧,振荡混匀 12000×片离心5min,取上清,直接用于PCR或贮存于-80C备用(适用于除粪样外的其他样品)
粪 样样品还需进行以下步骤加人等体积异丙醉(一20笔预冷),颠倒混匀,放置5min一10min;4c、 15000×买离心10min,弃上清,加3倍体积70%乙醇(4C预冷),振荡洗涤;4C,15000×离心 10min,弃上清,室温干燥5min;加人50L无DNA酶、无RNA酶水,混匀,溶解核酸,直接用于PCR 或贮存于一80C备用
可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒
8.3扩增反应 8.3.1对照设立 从样品处理开始,应设置阳性对照、阴性对照
阳性对照;取已知阳性的同类样品作为阳性对照,也可将适量灭活的病原菌添加到已知阴性样品中 作为阳性对照样品
阴性对照;取已知阴性的同类样品作为阴性对照
空白对照;在扩增反应阶段设置
以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照
8.3.2扩增试剂准备 采用25aL反应体系,含以下成分;10mmol/ITris-HHCl(pH8.3),50mmol/LKcI,2.5mmol/L nol/L,探针0.1mol/L.5%DMsO,5%甘油,0.4u Mkcl,0.2mmo/L.dNTP.上、下游引物各0.2pmm UDG酶,lUTaq酶,5AL核酸模板
取出荧光PCR反应缓冲液等试剂,室温融化(Taq酶、UDG酶除外),瞬时离心后置冰上,根据上述
GB/T27637一2011 反应体系,按每个反应20L的用量配制荧光PCR预混反应液,不足部分加灭菌双蒸水补足;需配制的 荧光PCR预混反应液数量=样品个数十对照个数+1
将各试剂按使用量吸取到微量离心管中,充分 混匀,然后在每个PCR光学管中分装20L 8.3.3加样 在已分装有荧光PCR预混反应液的PCR光学管中每管分别加人5AL样品或对照的核酸模板,混 匀,盖上管盖,放人荧光PCR仪,记录样品放置顺序
8.3.4荧光PCR扩增检测 反应条件设定,第一阶段50C2min,.95C4nmin,1个循环;第二阶段.;95C10s,60C45s.l0个 循环,60C时设置采集荧光 茨光素设定;报告荧光(reonde)设定为FAM(或按探针实际标记的荧光基团设定),掉灭荧光 quencehdye)设定为None,校准荧光(relereneedye)设定为None
可根据不同品牌仪器说明等效设置 参数
分析条件设定和结果判定 阔值设定 综合分析仪器给出的各项结果,基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考,值(threshold)设 定原则以阂值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准,具体还需根据仪器噪声情况进行 调整,选择反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析
9.2质控 阴性对照和空白对照应无Ct值,阳性对照的C值应<30,且呈现S型典型扩增曲线
否则,此次 实验视为无效
9.3结果分析及判定 在质控有效的条件下进行结果判定
阴性反应结果判定;检测结果呈现无Ct值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期,判为荧光 PCR阴性反应,样品判为副结核分枝杆菌核酸检测阴性
阳性反应结果判定;检测结果呈现Ct值<35,且扩增曲线有明显的对数增长期,判为荧光PCR阳 性反应,样品判为副结核分枝杆菌核酸检测阳性
对于35
GB/T27637?2011 A.64%? ?20ml.?,500ml??,?档
GB/T27637一2011 附录 B 规范性附录 检测过程防止交叉污染的措施 B.1采样及样品处理过程,应防止不同样品之间通过器具、手套等的交叉污染
采样及样品处理工具 应经过高压灭菌或高温烘烤处理，一套工具仅限一个样品使用
存放样品的容器应清洗、高压灭菌或高 温烘烤处理,或使用一次性灭菌容器
B.2实验过程,应穿工作服和戴一次性手套,勤换手套,工作服应经常清洗
B.3使用带滤芯吸嘴
吸嘴、离心管,PCR管等应一次性使用,不得回收清洗后重复使用
B.4样品处理与PCR加样应在不同的区域进行,不同区域配备独立的加样工具和用具
该区域可以 是独立的空间间隔、有紫外消毒设施的独立的设备如核酸提取工作站,PCR加样工作站、可密闭进行紫 外消毒的超净工作台生物安全柜等
若在敞开的空间进行核酸提取或PCR加样,该空间应安装紫外 灯或配备具有等同降解核 带紫外消毒功能的空气消毒净化器等
上述区 酸功泥的设备如秘动紧9外灯 域在每次使用后应及时清洁处理,并在使用前后照射紫外30min以上
每个区域应有专门的废弃物容 器,该容器应能耐受煮沸,10%次氯酸钠溶液消毒处理
每次实验结束,应在紫外消毒前,及时清理废弃 物及消毒容器,并将该废弃物容器放回工作区进行紫外消毒
B.5PCR反应试剂应按检测需求分装贮存,避免同一管试剂多次开启使用
B.6装有核酸模板、样品或试剂的离心管在打开之前,应短暂离心,避免离心管崩开,所有操作尽量避 免产生气溶胶
B.7 上机运行前,应检查并盖紧各PCR管,以防荧光物质或模板泄漏而污染机器 B.8应遵循基因检测实验室其他技术要求
副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T27637-2011
副结核分枝杆菌是一种常见的病原菌，能引起多种疾病，如肺结核、淋巴结核等。对于副结核分枝杆菌的检测，传统的方法存在时间长、准确率低等问题，因此需要使用更为快速、准确的检测方法。副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T27637-2011便是一种常用的检测方法。
检测原理
副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T27637-2011的检测原理基于PCR技术，通过荧光信号实时监测扩增过程中的DNA量变化，以确定样品中是否存在副结核分枝杆菌。
试剂盒
副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T27637-2011使用的试剂盒包括以下组成部分：
- 引物：用于特异性扩增副结核分枝杆菌的DNA片段。
- 探针：通过与引物相结合，产生荧光信号来监测扩增过程。
- 酶：用于逆转录反应和PCR扩增。
- 缓冲液：用于维持反应环境并提供必要的离子。
操作步骤
副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T27637-2011的操作步骤如下：
- 提取样品DNA：从样品中提取副结核分枝杆菌的DNA。
- 制备PCR混合液：根据试剂盒说明书，将引物、探针、酶和缓冲液混合制备PCR混合液。
- 装载样品：将提取好的DNA加入PCR混合液中，并加入阳性对照和负性对照。
- 进行PCR扩增：将已装载好的PCR混合液放入实时荧光PCR仪中进行扩增，同时监测荧光信号。
- 数据分析：根据实时荧光PCR仪输出的数据，进行结果判读。
优点与应用
相对于传统的检测方法，副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T27637-2011具有以下优点：
- 快速：整个检测过程只需要几小时即可完成。
- 高灵敏度：能够检测到非常低浓度的病原体。
- 高特异性：能够区分不同种类的细菌，避免假阳性结果的出现。
- 操作简单：只需要基本的实验室技能即可完成。
因此，副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T27637-2011在临床诊断和疫情监测等方面应用广泛，具有重要的意义。
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