蜂蜜中青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素残留量的测定方法液相色谱--串联质谱法

蜂蜜中青霉素G、青霉素V、乙氧萘青霉素、苯唑青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素残留量的测定方法液相色谱--串联质谱法

国家标准 GB/T18932.25一2005 蜂蜜中青霉素G青霉素、 乙氧禁青霉素、苯陛青霉素、邻氯青霉素、 双氯青霉素残留量的测定方法 液相色谱-串联质谱法 MethodforthedeterminationfpenieiinG，penieinY， nafeillin,oxacillin,clo%acillin，diclo%acillinresiduesinhoney LC-MS-MSmethod 2005-02-04发布 2005-08-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T18932.25一2005 蜂蜜中青霉素G、青霉素、 乙氧禁青霉素,苯唾青霉素、邻氧青霉素、 双氯青霉素残留量的测定方法 液相色谱-串联质谱法 范围 GB/T18932的本部分规定了蜂蜜中青霉素G、青霉素V,乙氧綦青霉素,苯幽青霉素,邻氯青霉 素、双氯青霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本部分适用于蜂蜜中青霉素G、青霉素V、乙氧禁青霉素、苯陛青霉素、邻氧青霉素、双氧青霉素残 留量的测定 本部分的方法检出限:青霉素G、青霉素V,苯陛青霉素为1.0g/kg;邻氯青霉素、双氧青霉素为 2.04g/kg;乙氧奈青霉素为0.54g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文 件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本 部分 GB/T6379测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性(GB/T 63791986,neqISO5725:l981 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqIsO3696:1987) 原理 试样中青霉素残留,用去离子水溶解后溶液用Oasi、HB或相当的固相萃取柱净化液相色谱 串联质谱仪测定,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为优级纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇;色谱纯 4.2乙晴:色谱纯 4.3乙酸:优级纯 乙睛十水(1十3):量取25mL乙睛(4.2)与75mL水混合 4.5OasisHLB固相萃取柱或相当者;500nmg,6ml 使用前分别用5ml 甲醇(4.1)和10mL水预 处理,保持柱体湿润 4.6青霉素G、青霉素V,乙氧禁青霉素,苯陛青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素标准物质;纯度>99% 青霉素G、青霉素V,乙氧恭青霉素,苯幽青霉素,邻氯青霉素,双氯青霉素标准储备溶液;准确称 取适量的每种标准物质(4.6),分别用乙睛(4.4)配制成浓度为1.0mg/m的标准储备溶液 储备液贮 存在一18C冰柜中 4.8青霉素G青霉素V、乙氧禁青霉素、苯陛青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素标准工作溶液:根据需
GB/T18932.25一2005 要吸取适量青霉素G、青霉素V、乙氧茶青霉素,苯陛青霉素、邻氯青霉素、双氧青霉素标准储备溶液 4.7),用空白样品提取液稀释成适当浓度的基质混合标准工作溶液 仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪:;配有电喷雾离子源(ESI) 5.2分析天平:感量0.1mg和0.01区各一台 5.3液体混匀器 5.4固相萃取真空装置 5.5贮液器:50mL 微量注射器.25L,100L 5.6 5.7刻度样品管;5mL,精度为0.1mL 真空泵:真空度应达到80kkPa pH计测量精度士0.02. 氮气吹干仪 5. 10 试样的制备与保存 6 试样的制备 对无结晶的实验室样品,将其搅拌均匀 对有结晶的样品,在密闭情况下,置于不超过60C的水浴 中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,迅速冷却至室温 分出0.5kg作为试样 制备好的试样置于样 品瓶中,密封,并做上标记 6.2试样保存 将试样于常温下保存 测定步骤 7.1试样溶液的制备 称取5g试样(精确到0.01g)置于150mL三角瓶中,加人25mL去离子水,于液体混匀器上快速 混合lmin,使试样完全溶解 样液移至下接OasisHLB柱(4.5)的贮液器中,以小于或等于3mL/min 的流速通过Oasi、固相萃取柱后,用5mL水洗柱,弃去全部流出液 在65kPa的负压下,减压抽干 20nmin,最后用3ml甲醉醇(4.1)洗脱,收集洗脱液于刻度样品管(5.7)中,于40C水浴中用氮气吹干仪 吹干,用乙睛(4.4定容至1mL,摇匀后,供液相色谱-串联质谱仪测定 7.2测定 7.2.1液相色谱条件 色谱柱:SunFirerMC3.5am,150mm×2.1mm(内径或相当者; a b)流动相及流速见表1; c 柱温;30C; d 进样量:20L 表1液相色谱梯度洗脱条件 水(含0,4%乙酸/%) 乙睛/% 时间/" //min 流速/八 /l/mmin 0.00 200 60.0 40.0 35.0 65.0 15.00 200 15.01 200 60.0 40.0 25.01 200 60.0 40.0
GB/T18932.25一2005 7.2.2质谱条件 离子源;电喷雾离子源(EsI); a b)扫描方式正离子扫描; 检测方式:多反应监测: c 电喷雾电压:5500V; 雾化气压力:0.055MPa; 气帘气压力:0.079MPa; 辅助气流速:6L/min g h 离子源温度:400C; 定性离子对、定量离子对和去簇电压(DP),聚焦电压(FP)、碰撞能量(CE)及碰摧室出口电压 CXP),见表2. 表2六种青霉素的定性离子对、定量离子对去簇电压、聚焦电压,碰撞能量和碰撞室出口电压 碰撞室 定性 定量 碰撞 去簇 聚焦 离子对 能量 名称 离子对7 电压， 电压/ 出口电压/ m/z m/z) 35/10 20 335/16o 45 200 11 青霉素G 335/176 23 351/160 40 11m 青霉素V 351/160 200 351/192 02/160 45 1 苯陛青霉素 402/160 200 402/243 2 436/160 邻氯青霉素 436/160 50 200 2 436/277 415/199 1nm 415/199 200 乙氧禁青霉素 45 15/256 23 470/16o 双氯青霉素 470/160 50 200 1m 21 470/311 液相色谱-串联质谱测定 7.2.3.1定性测定 在相同试验条件下,样品中待测物质与同时检测的标准品具有相同的保留时间,并且所选择的两对 离子丰度比相一致,则可判定为样品中存在该残留 7.2.3.2定量测定 在仪器最佳工作条件下,用青霉素G、青霉素V、乙氧綦青霉素、苯坐青霉素、邻氯青霉素,双氯青霉 素标准储备溶液配成的基质混合标准溶液(4.8)分别进样,以标准工作溶液浓度为横坐标,以峰面积为 纵坐标,绘制标准工作曲线 用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中青霉素G、青霉素V、乙氧茶 青霉素、苯哗青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内 在上述色谱条件下,青霉素G,青霉素V乙氧綦青霉素,苯陛青霉素、邻氯青霉素、,双氯青霉素的总 离子流图参见图A.1 青霉素G,青霉素V.乙氧慕青霉素,苯陛青霉素、邻氧青霉素,双氧青霉素的保 留时间和离子丰度比见表3
GB/T18932.25一2005 表3六种青霉素的参考保留时间和离子丰度比 离子对丰度比/(%) 保留时间/min 青霉素名称 定性离子对/m/2 335/160 100 7.44 青霉素G 335/176 87 351/16o 100 青霉素V 9.21 351/192 9,6 402/16o 100 苯陛青霉素 10.56 76 402/243 436/160 100 12.49 邻氯青霉素 436/277 83 15/199 100 乙氧荞青霉素 13.05 13 415/256 470/16o 100 双氯青霉素 15.60 42 470/311 本方法的添加回收率数据参见表B.1 7.3平行试验 按上述步骤对同一试样进行平行试验测定 7.4空白试验 除不称取试样外,均按上述分析步骤进行 结果计算 蜂蜜中青霉素残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算 1000 e十！ × X= l000 式中 试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(ug/kg): 从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 试样溶液定容体积,单位为毫升(mL); 最终试样溶液所代表的试样质量,单位为克(g). m 注:计算结果需将空白值扣除 精密度 本部分的精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的,其重复性和再现性的值以95%的可信度来 计算 9.1重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r),蜂瑾中青霉素G、青 霉素V乙氧紫青霉素,苯陛青霉素、邻氯青霉素,双氯青霉素含量范围及重复性方程见表4 如果两次测定值的差值超过重复性限(r),应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 g. 再现性 2 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R),蜂蜜中青霉素G,青 霉素V、乙氧奈青霉素、苯陛青霉素、邻氯青霉素,双氯青霉素含量范围及再现性方程见表4
GB/T18932.25一2005 表4六种青霉素含量范围及重复性和再现性方程 青霉素名称 含量范围/g/kg 重复性限r" 再现性限R 青霉素G l一40 lgr=1.0027lgm-1.0946 lgR=0.8860lgm-0.6277 V 青霉素 gR=0.9572lg朋一0.6451 140 gr=0.9809lgm-1.1480 苯陛青霉素 g"=0.7579g朋一0.9166 gR=0.8137g朋一0.6173 140 2 g尸=0.9364lgm-1.0862 gR=0.8489lgm一0.5625 邻氯青霉素 -80 乙氧禁青霉素 0.520 gr=1.0233lgm-1.1511 lgR=0,8311lgm一0,6066 双氯青霉素 280 gr=1.0171lgm-1.1383 lgR=0.8018lgm一0.5164 注:m为两次测定结果的算术平均值
GB/T18932.25一2005 附 录A 资料性附录 六种青霉素标准物质的总离子流图 六种青霉素标准物质的总离子流图,见图A.1 12.49 8.0es 7.0e5 0,56 7.44 6.0e5 7.44nmin为青霉素G 13.05 5.0e5. 15.60 9.21min为青霉素V; 9.21 4.0e5. 10.56min为苯陛青霉素; 12.49min为邻氯青霉素; 3.0e5 13.05min 为乙氧禁青霉素 2.0e5 15.60min为双氧青霉素 1.0e5 0.0 18 12 e 201/mim" 图A.1六种青霉素标准物质的总离子流图
GB/T18932.25一2005 附录B 资料性附录 回 收率 本部分中青霉素G、青霉素V、乙氧禁青霉素,苯陛青霉素、邻氯青霉素、双氯青霉素添加浓度及平 均回收率的试验数据见表B.1 表B.1六种青霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据 青霉素名称 添加浓度/4g/kg) 回收率/(% 92.1 1.0 91.6 l 青霉素G 91.9 20 40 91.3 88.4 l.o 10 88. 青霉素V 90." 2 40 86,l 0.5 94.3 92.2 5.o 乙氧青霉素 92.3 10 20 93.2 90.9 l.o 89.2 10 苯陛青霉素 20 92.o 40 87.8 2.0 88.6 87.1 20 邻氯青霉素 89.0 80 87.8 2.0 90.3 20 87.0 双氢青霉素 40 88.2 80 89.0