国家标准 GB/T15805.4一2018 代替GB/T15805.4一2008 斑点叉尾纲病毒病诊断规程 Codeofdiagnosisforehamneleatishvirusdiseases 2018-07-13发布 2019-02-01实施国家市场监督管理总局发布币国国家标准化管理委员会国家标准
GB;/T15805.4一2018 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准代替GB/T15805.4一2008《鱼类检疫方法第4部分;斑点叉尾酮病毒(cCV)》本标准与GB/T15805.4一2008相比,除编辑性修改外,主要技术变化如下 -增加了斑点叉尾酮病毒病的临床症状描述; -增加了酶联免疫吸附试验检测斑点叉尾酮病毒抗原的方法 -改为酚氧仿法抽提病毒核酸; -PCR检测增加内控DNA,长度为186bp -增加了资料性附录C“斑点叉尾酮病毒病(CCVD)” 请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业农村部提出本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口本标准起草单位全国水产技术推广总站、检验检疫科学研究院、北京出人境检验检疫局本标准主要起草人;吕永辉、张曼、王娜、谷强、余卫忠,景宏丽、张利峰,徐哗、周毅本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T15805.1一1995; GB/T15805.4-2008
GB/T15805.4一2018 Taq:水生栖热菌(h. hermusaquaticuus TBE:三胫甲基氨基甲婉棚酸乙二胺四乙酸缓冲液(tris-Borate-EDTA infectivedose TcD;半数组织培养感染剂量(tisite.culkure" TMB3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine Tis;三(羚甲基)氨基甲婉[uris(hydroymethy)aminomethane 试剂和材料 4.1Ta酶:5U/pL 一20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化 4.2dNTP:含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各2.5mmol/L,-20C保存 4.3无水乙醇;分析纯,使用前预冷到-20C 4.4琼脂糖:电泳级 4.5青霉素100mg/'ml. 4.6链霉素50mg/mL. 过氧化氢;3%. 4.7 4.8Tris饱和酚;pH8.0 氧仿,又称三氧甲烧,分析纯 4.9 4.10异戊醇;分析纯 4.11矿物油,PCR级 4.12澳酚蓝:分析纯 4.13水;应符合GBT6682中一级水的规格 4.14ccV参考株(阳性对照);由农业部相关部门指定机构提供 4.15羊抗ccV的lgG和抗血清;由农业部相关部门指定机构提供 4.16鼠抗ccV的单克隆抗体;由农业部相关部门指定机构提供 4.17斑点叉尾酮卵巢细胞,应符合sC/T7016.8的规定，培养液见附录A中A.1,细胞消化液见A.2 4.18内控DNA,是一段长186bp的人工合成DNA片段,其两端的序列和CCV的引物序列互补由检测实验室自己合成,或购买商品化试剂,序列参见附录B中B.1 4.19封闭液;1%明胶 4.20包埋稀释液;pH9.6,见A.3 4.21PBST;PBS(磷酸盐缓冲液,见A.4),加人0.05%Tween-20,见A.5 4.22TMB;显色液,配方见A.6 4.23底物缓冲液;pH5.0柠檬酸-磷酸缓冲液,见A.7,用于配制显色底物(见A.8) 4.24终止液;2mol/几的硫酸,见A.9. 4.25蛋白酶K缓冲液;0.5mg/mL,见A.10. 4.26TBE电泳缓冲液:pH8.0,见A.11 4.27引物;浓度为50pmol/L 引物序列: F;5'-TCATcCGAATcCGACAACTGA-3' R:5'-CCAAGATcGCGGAGAAAC-3' 扩增cCV蛋白激酶基因序列中136bp片段 5 器材和设备 5.1倒置显微镜
GB;/T15805.4一2018 5.2生化培养箱 5.3普通冰箱和超低温冰箱 5.4离心机和离心管 5.5超净工作台 5.6PCR仪 5.7电泳仪 5.8凝胶成像仪 5.9酶标仪临床症状和组织病理学特征参见附录C 采样 7.1采样对象斑点叉尾酮 7.2采样水温与数量采样时水温应在20C以上采样数量应符合sc/T7103的要求 7.3样品采集按GB/T18088的规定执行对有临床症状的鱼,体长4em的鱼苗,取整条鱼,若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊体长4m一信cm的鱼首取内胜(包括侍)体长大于6cm的鱼则取肝.和脾对无症状的鱼取肝、肾和脾;成熟雌鱼还需取卵巢液;鱼卵则取卵膜 8 病毒分离 8.1样品处理 ccV的分离,无临床症状的成鱼,5尾一15尾为一个样品,有临床症状的成鱼每1尾为1个样品先用组织研磨器将样品匀浆成糊状,按1:1的最终稀释度重悬于含有1000U/mL青霉素和 004g/mL链霉素的培养液中 25C下孵育2h一4h,或4C下孵育过夜,以释放病毒 8000g离心20min,收集上清液 8.2病毒分离 8.2.1用细胞培养液对1:10的组织匀浆上清液再作2次10倍稀释,然后将1;10,1:100和 l;1000三个稀释度的上清液分别接种到生长约24h的CcO单层细胞上(96孔板中),每稀释度至少 2孔,每孔接种100AL 25C30C吸附1h后,不弃去接种液,直接加人100AL细胞培养液,置于 25C一30C培养试验中要有2孔阳性对照(接种CCV参考株),和阴性对照(未接种病毒的细胞) 8.2.2阳性对照和待测样品都接种细胞后,用无菌封板膜封盖96孔板 10天内每天用40倍到100倍倒置显微镜检查 8.2.3如果待检样品没有CPE出现,则还要盲传一次,然后进行鉴定
GB/T15805.4一2018 8.2.4盲传时,将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，80004C离心20 min，收集上清液将上清液接种到新鲜细胞单层,继续置于25C30C培养7天每天用40倍100倍倒置显微镜检查 8.3结果判定在阴性对照细胞始终正常,阳性对照细胞出现了CPE的情况下,当接种了被检上清稀释液的细胞出现CPE时,为病毒分离阳性,需要立即取病毒悬液用下述任意一种方法进行CCV鉴定如果样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现,则结果判断为阴性如果阳性对照也未出现CPE,则实验失败应换用新的CCO细胞和一批新的组织样品重新进行病毒分离中和试验 9.1收集出现CPE的待检样品病毒液,反复冻融2次后,2000g4C离心15min去除细胞碎片 9.2将含病毒的上清液系列稀释到10- 9.3 每稀释度的柄毒液与等体积的抗ccV抗血清混合同时另取这些病毒稀释液与等体积的细胞城养液混合(中和抗血请使用前于58C灭话30min,效价拨50%蚀斑减少单位计算不少于1120o. g.4同时,取参考毒株作为阳性对照,取其他病毒株作为阴性对照,按照9.3的方法制备混合液 9.5各混合物在25下孵育1h g.6将上述混合物分别接种到生长约24h的cco单层细胞上(培养于96孔板中),每稀释度接2孔每孔504L,于25C下吸附0.5h~1h 9.7吸附后每孔加人含有10%胎牛血清的pH7.37.6的细胞培养液50AL,于25C一30C下培养 9.8检查CPE发生情况 9.9按照ReedMuench法,计算并比较非中和对照组和中和试验组的TCID值若病毒悬液被抗 ccV特异性抗血清处理后,CPE被抑制或被显著推迟,而未被处理的细胞培养液中CPE明显,导致二者病毒滴度相差2个以上,则待测的病毒样品为ccV中和试验阳性 10 ELISsA检测 0.1用pH9.6的包埋稀释液(见A.3)适量稀释纯化的羊抗ccVlgG,包被ELIsA板,每孔100l 4C孵育过夜 0.2用PBST(见A.5)洗3次 0.3用1%明胶(溶于PBST中)封闭,每孔200AL 37C反应1h,用PBST洗3次 0.4加人待检的样品、cCCV参考毒株(阳性对照),未接种cCV的ccO悬液(阴性对照)和PBS(空白对照),每组设2个平行对照孔,每孔100AL,37C反应1h 用PBST洗3次 10.5加鼠抗CCV单克隆抗体到小孔中,每孔100 ,37C反应1h 用PBST洗3次 l 0.6加人0.1%的H,O.(用蒸水稀释),每孔150AL,37C反应15min以便去除非特异性过氧化物酶用PBST洗2次 0.7加人标记辨根过氧化物酶的抗鼠Ig(G(酶标二抗),每孔100AL，37C反应1h 用PBST洗 3次 0.8加人底物底物缓冲液配制的TMB和过氧化氢,见A.8) 当阳性对照出现明显蓝色，阴性对照无色时加人终止液(见A.9),在450nm波长下读取结果如果用其他底物(如底物缓冲液配制的OPD 和过氧化氢)则需改用相应光波长(如490nm)测量 10.9结果判定以空白对照的光密度值即OD值)为零,测量各孔的光吸收值先计算阳性对照和
GB;/T15805.4一2018 阴性对照的OD值之比即P/N值) 如果P/N>2.1,表明对照成立再计算待测样品孔和阴性对照孔的P/N值之比当P/N>2.1时,判为CCVELISA阳性 11 CR检测 11.1DNA提取取490L待检样品,加人10ML蛋白酶K缓冲液(见A.10),56C孵育1h 11.1.2 加人500ALTris饱和酚和500AL氧仿:异戊醉(24:1),振荡混匀 13000！离心10min 11.1.3吸取上层水相,加人新的1.5mL的离心管中注意不要吸到中间层和下层,以免混人蛋白质 1.1.4水相中加人不少于1.5倍体积预冷的无水乙醉,混匀后一20C放置过夜 13000离心10min 11.1.5 11.1.6弃上清,沉淀在室温下晾至半干,50L.水溶解,-20C保存备用 11.1.7也可以用采用其他DNA抽提方法,或相应的试剂盒来抽提病毒DNA 1.2CR扩增DNA 1.2.1应在单独的工作区进行PCR加样工作每次PCR检测都应设置阴性对照和阳性对照 1.2.2反应体系;l0×bufer104L25mmol/L的MgSO10AL,dNTPs(2.5mmol/儿Leach)4AL、每条引物(50pmol/AL)各0.8!lL、Taq酶(5U/L)0.6AL,内控DNA0.6AL,模板6"L,加水到总体积为 100L 如果PCR没有热盖,每管还需加人50Al矿物油,否则可以不加短时间低速离心让试剂集中在底部再将反应管置于PCR扩增仪 11.2.3反应条件;先934min,再93C30s,6030s，72C30s,30次循环，然后72C10min 最后4保温 1.3琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液(见A.11)配制3%的琼脂糖(含0.54g/mlEB见A.12)平板将10Al样品和2L样品缓冲液(见A.13)混匀后加人样品孔在电泳时设立DNA标准分子量作对照 100mA 恒流电泳,溴酚蓝到达凝胶底部停止电泳在紫外灯下或者凝胶成像仪中观察核酸带并判断结果 11.4设立对照在11.1样品处理过程中,设立阳性对照、阴性对照和空白对照: -取含有已知cCV参考株的细胞悬液作为阳性对照; 取未接毒的扣胞悬液作为阴性对照" 取等体积的水代替模板作为空白对照 11.5结果判定 11.5.1内控DNA会扩增出186bp的DNA片段,ccV病毒DNA会扩增出136bp的DNA片段 11.5.2PCR后,阴性对照和空白对照会出现186bp的DNA片段,阳性对照会出现186bp和136bp 2条DNA片段如果对照中ccV浓度较高,186bp的DNA片段有可能很弱或消失,此时应该稀释 CCVDNA浓度后重新试验 11.5.3待测样品PCR扩增后,能在相应186bp和136bpDNA位置上有2条带,可判为PCR阳性仅出现186bp的条带,无136bp条带或带的大小不是136bp判为PCR阴性如果待测样品产生的 DNA带大小异常或无法准确判断大小,需要将片段进行基因测序,并与已知标准基因序列比较参见B.2)
GB/T15805.4一2018 2综合判定 12.1疑似病例的判定鱼体有临床症状,或组织病理学特征,或接种后的细胞产生CPE,判定为疑似病例 12.2确诊病例的判定符合12.1疑似病例的判定,且中和试验、ELISA,PCR任何一项检测结果为阳性时,为确诊病例若无临床症状和组织病理特征,当接种后的细胞产生了CPE,且中和试验、ELISA、PCR任何一项检测结果为阳性时,则判定为CCV携带者
GB;/T15805.4一2018 附录 A 规范性附录试剂及其配制细胞培养液 A.1 使用M19(earle'、salts)或DMEMI培养基,按说明书的要求,用一级水配制,然后加人10%经 56C30min灭活的胎牛血清,用NaHCO粉末将培养液调pH为7.27.4 过滤除菌,分装后一20C保存在开放系统使用时,需要加人过滤除菌的HEPES,使其在培养液中的终浓度为0.02mol/I A.2细胞消化液(EDrA0.02%、胰酶0.06%的PBS缓冲液 NaCI 8g KC 0.2 g KH,PO 0.1 NaHPO 12Ho 2.3g EDTA 0.2g 胰酶 0.6g 加人NaHcO.(大约0.4只一0.6g),调pH=7.4一8.0(pH<7.4时EDTA难溶) 充分搅拌直到无不溶物为止过滤除菌,分装后一20保存 A.3包埋稀释液(pH9.6 NagCO. 1.59g NaHcO 2.93g 1000 水 ml A.40.01mol/LPBspl7.2~7.4) Na,HPO 1.19g NaH,PO. 0.22g NaCl 8.50g 1000m 水充分搅拌帝解后,4七保存 A.5洗涤液PBSr0.01mol/LpH=7.4磷酸盐缓冲液,含0.05%的Iween-20) NaCI 8.0 g Na,HPO12H.O 2.9 g KH.Po 0.2g KCI 0.2g 水 1000ml
GB/T15805.4?2018 Tween-20 0.5 ml ??,4C(10??洢. A.6TB? 250 TMBTMB mg DMF(N,N-Dimethylformamide5mL/?25ml C??档 ??(pH5.0-?? A.7 (CH,O,H,O 1.02g Na2HP(O12H.(O 3.68g 100 ? ml A.8? ?? 10ml 0,1ml TMB? 30%H.O 4AL~5l A.9?? 2mol/L? A.10?K? ?,??;50mmol/LKCl,15mmol/LTris-HCl(pH8.3)0.5%NonidetP40? ?0.5mg/mL?K A.115TBE??(5?? 54 Tris g 27.5g EDTA 2.922g ? 1000ml 5moLLHClpH8.0 A.12EB(?? ??10mg/'mL????10mL???м1l. A.13?? ?100ml.??к;0.25g,40g
GB;/T15805.4一2018 附录 B 资料性附录扩增产物的参考序列内控NA的参考序列(186p) B.1 其中带下划线的基因片断为扩增引物 TCATCCGAATCCGACAACTGAGCCGTCTGTCGTATCCAGcTGCAAACTTcCAGACAACGT 61 GCAACANTCAGCTATNTCGCGACGTATCGTGANTNTGGTT！ACATAAACGATGCACGTTG 21GCATGGTTGTCGTCTCTAGGTATCTTGAACcCACTAGGTATAGTGTGGGTTTCTcCGCGA 181TCTTGG B.2cCV扩增产物的参考序列(136bp 其中带下划线的基因片断为扩增引物 TCATCCGAATCCGACAACTGACGCGTCGGTAGCcCGACCGATCCGTNTGTTACGGGTGCG 67 GGGGYTCGACACCGTGCTCGCCGCGAT(GAGGCT(GACCGCGGACACGGGGGGTCCCCCTCGT 21TCTCCGCGATCTTGG 参考序列来源:OIE《水生动物疾病诊断手册》2006版)第2.1.6章;斑点叉尾鲷病毒病
GB/T15805.4一2018 附录 C 资料性附录) 斑点叉尾组病毒病(ccwD) C.1 疾病描述斑点叉尾酮病毒病发现于美国地区,由斑点叉尾酮病毒感染斑点叉尾酮等温水鱼而引起的病毒性疾病,死亡率可达100% 该病曾被世界动物卫生组织(oIE)水生动物疾病诊断手册(2006)列为必须申报的疫病,我国农业部公布的“一、二、三类动物疫病病种名录”将其列为二类动物疫病 C.2宿主近几年报道的自然暴发该病仅仅限于斑点叉尾酮(Icta ledtaluruspuncdtalws)的鱼苗和鱼种也有研究结果证明,ccV还能感染南方大口射和加州鲈,并能造成感染鱼的迅速死亡 C3流行水温该病在夏季水温25C以上时会发病,流行适温为28C一30C,会出现斑点叉尾剿鱼苗大量死亡在28C时14天内死亡率达94%,19笔时仅14% 人工感染鱼苗,水温2535C,在一星期内出现症状;水温低,则症状出现较慢 C.4临床症状病鱼表现为摄食活动减弱,痉挛式旋转游动,头上尾下悬挂于养殖池边缘,最后沉人水底衰竭而亡病鱼皮肤及鳍条基部出血,腹部膨大,腹水增多,呈现淡黄色;蟋丝苍白或出血,眼球突出内脏病变包括:肾苍白肿大,肌肉、肝、肾、脾出血,肝、肾、脾肿大,胃内充满黏液样分泌物,腹膜水肿,腹腔内充满黄色渗出物 C.5 组织病理学组织病理变化主要表现为:肾脏、肝脏肿大,脾脏充血,胃肠道水肿;造血组织和胃肠道内出现巨噬细胞聚集区;有些肠壁的粘膜、粘膜下层发生坏死、脱落;有些鱼的肠粘膜下层及绒毛严重出血,甚至血漏人肠腔;骨骼肌出血,胰脏坏死,神经细胞核出现空泡,周围神经纤维肿大 C.6病原病原为斑点叉尾酮病毒(CCV) 病毒为20面体双链DNA病毒,有囊膜病毒粒子直径1751 nm 200nm 病毒只一种血清型,但采用单克隆抗体发现不同株间有不同抗原决定簇,并存在毒力的差异和基因序列的差异 CCV仅能在BB,CCO,KIK细胞株上复制生长,最适温度为25C30C 10
GB;/T15805.4一2018 cCV对乙酥、氧仿,酸、热敏感,在甘油中失去侵染力;-20C冷冻后解冻3次,每次将失去兵~4 侵染力,因此必须用新鲜组织分离病毒;病毒在含有10%血清,pH为7.68.0培养液中,一75C以下保存时间最长 25笔时病毒在池水中能生存2天,在曝过气的自来水中生活11天;4C时病毒在池水中能存活近1个月,在曝过气的自来水中近2个月;病毒在池底淤泥中迅速失活斑点叉尾酮成鱼带有的cCV是传染源,感染途径尚不清楚水平传播主要来自罹病的濒死鱼 nmoribunddiseasedfish)排出的病毒

斑点叉尾鮰病毒病诊断规程GB/T15805.4-2018解读

斑点叉尾鮰病毒病是一种由斑点叉尾鮰病毒引起的急性传染病，主要感染斑点叉尾鮰和其他同属鮰科的淡水鱼类。该病在全球范围内均有分布，对养殖业造成了严重的经济损失。

根据GB/T15805.4-2018《斑点叉尾鮰病毒病诊断规程》，该病应当依据临床表现、病理学检查、血清学检测、病原学检测等方面进行综合诊断。

病原体特征

斑点叉尾鮰病毒属于Birnaviridae科双链RNA病毒，其直径为60-70nm，具有两个立体对称的正二十面体外壳。该病毒在中性或微碱性条件下稳定，能够在4℃下存活数周至数月。

传播途径

斑点叉尾鮰病毒主要通过水体、食品以及养殖工具等方式进行传播。其中，感染鱼类的主要途径是暴露在含有病原体的水中，而人为因素如运输、移植、饲料等也可能成为病原体传播的途径之一。

临床表现

斑点叉尾鮰病毒病的临床表现多种多样，常见症状包括：呼吸急促、皮肤发黑、脱鳞、出血、肝脏和脾脏肿大等。在实际诊断过程中，需要结合病理学检查进行综合分析。

诊断方法

根据GB/T15805.4-2018《斑点叉尾鮰病毒病诊断规程》，该病的诊断方法主要包括以下几个方面：

临床表现
病理学检查
血清学检测
病原学检测

其中，病原学检测是本病的唯一确诊方法。目前常用的病原学检测方法包括：RT-PCR、ELISA等。在病毒分离和纯化方面，也有一些新的技术正在逐步应用于实际生产中。

总之，斑点叉尾鮰病毒病的诊断过程需要综合运用多种方法，以提高诊断的准确性和可靠性。同时，也需要加强对该病的监测和预防控制工作，以减少其对水产养殖业的影响。