国家标准 GB/T32951一2016 有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力霉素的含量测定高效液相色谱法 Determimationfosyteraeyline，tetraeylime,chlortetraeyeineanddoyeydline ontentfororganicfertilizers一HPLCmethod 2016-08-29发布 2017-03-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T32951一2016 有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力霉素的含量测定高效液相色谱法警告;使用本标准可能会涉及到危险的材料,操作和设备,但本标准无意对与其使用相关的所有安全问题都提出建议使用者在应用本标准之前,有责任建立使用的安全和防护措施,并确定相关规章限制的使用性范围本标准规定了有机肥料中土霉素,四环素、金霉素和强力霉素含量的高效液相色谱检测方法本标准适用于有机肥料、有机-无机复混肥料中土霉素,四环素,金霉素和强力霉素含量的测定本标准不适用于豆饼肥中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素含量的测定本方法检出限分别为:土霉素0.75mg/kg,四环素0.75mg/kg,金霉素1.0mg/kg，强力霉素0.75mg/kg 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第1部分:总则与定义 GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法原理试样中土霉素、,四环素、金霉素和强力霉素经NaEDTAMelvwaine-甲醉提取液提取,固相萃取小柱净化处理后进样,高效液相色谱紫外检测器测定,外标法定量试剂和材料除另有说明外,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 4.1甲醉色谱纯 4.2乙睛;色谱纯 4.3磷酸氢二钠(NaHHPO12H,O) 4.4柠檬酸(C,H,OH.o) 4.5乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA2H,O) 4.6水合草酸(CH,O2H,O). 4.7磷酸氢二钠溶液:0.4mol/L 称取143.26g磷酸氢二钠,用水溶解,定容至1000 mla 4.8柠檬酸游液0.2mol/L 称取42.03g柠檬酸,用水溶解,定容至1000ml
GB/T32951一2016 4.9乙二胺四乙酸二钠(Na,EDTA)溶液:0.1mol/L 称取37.22g乙二胺四乙酸二钠,用水溶解,定容至1000mL 4.10磷酸氢二钠-柠檬酸(Mclvaine)缓冲液(pH=6.8士0.05);将1000mL.0,4mol/几磷酸氢二钠溶液(见4.7)与294mL.0.2mol1L柠檬酸游液(见4.8)混合 4.11NaEDTA-Mdlvaine-甲醉醇提取液;取NaEDTA(见4.9),磷酸氢二钠-柠檬酸Mellvaine)缓冲液见4.10)与甲醇按1+1+2体积)比例混匀,必要时用NaOH溶液或HCl溶液调节pH=7.20士0.05 4.12草酸溶液.0.0lmol/L. 称取1.26只草酸,用水溶解,定容至1000mL 4.13甲醇-水(1十19):量取5mL甲醇与95mL水混匀 4.14草酸-甲醉溶液:0.01mol/L 称取0.13g草酸,用甲醉溶解,定容至100mL 4.15土霉素(ox ytetracycine,CAs:2058-46-0)四环素(tetracyline,CAs:64-75-5)、金霉素chlortet racyeline,CAs;64-72-2),强力霉素(doxyey ycline,CAs;24390-14-5)标准物质;纯度92%一98% 4.16土霉素,四环素,金霉素,强力霉素标准储备溶液;2mg/ml 准确称取一定量的土霉素,四环素金霉素、强力霉素标准物质(见4.15),分别用甲醉配成2mg/mL的标准储备液储备液于0C一8 保存土霉素、四环素,金霉素,强力霉素混合标准溶液;分别取5mL土霉素,四环素,金霉素、强力霉 4.17 素标准储备液(见4.16)至100ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,混匀,每种物质浓度为1004g/mL,储存于冰箱中,每周配制 4.18固相萃取柱(二乙烯基苯和N-乙烯基毗咯婉酬的大孔共聚物-HLB或相当者)300mg/3mL 使用前依次通过2mL甲醇及2nmL.水预处理,保持柱体湿润仪器和设备 5.1液相色谱仪;配紫外检测器 5.2分析天平:感量0.1mg 5.3机械振荡提取仪;50次/min一500次/min 5.4冷冻离心机:转速大于3500r/min 5.5固相萃取装置 5.6真空泵 5.7氮气吹干仪 5.8pH计;测量精度士0.02 5.9针式过滤头:0.22m 5.10金属试验筛;0.5mm 试样制备与保存 6.1试样的制备将样品粉粹,全部通过0.5mm试验筛,待用 6.2试样保存过筛的实验室样品在室温(约25)下避光保存,并注意防潮防霉
GB/T32951一2016 分析步骤 7.1 称样称取过筛的试样1.0g2.0g,精确至0.1mg 7.2提取试料置于50mL带盖塑料离心管中向试料中加人20mLNa,EDTA-Mellvaine-甲醇提取液,于机械振荡提取仪中室温(约25C)下提取20min,于15C下置于离心机上，离心速度不小于 3500r/min,离心10min,取上清液至另一离心管中残渣中再依次加人20mL、10mLNaEDTA Mdlsamc-甲脖提取液.重复提取两次，合并上清液并定容至0ml 7.3净化从定容的50ml.上清液中取5ml置于氮气吹干仪上,室温(约25C)下吹至原体积的一半左右加适量水稀释至体积约5ml,以1nL/min的速度通过已活化处理的固相萃取柱依次用5mL水 5mL甲醉-水淋洗固相草取柱,弃去全部流出液减压抽干5min,用5ml草酸-甲醉溶液洗脱目标物洗脱液使用饱和NaOH溶液调至pH约为5一6,置于氮气吹干仪上吹至近干,用1mL水溶解残渣,过 0.22 4m滤膜,按7.4.3.1测定一进行测定当有机肥样品中基体及杂质对目标物色谱峰没有影响时,可省略7.3净化步骤,试样经7.2提取步骤后,过0.22Am滤膜按照7.4.3.2测定二进行测定 7.4测定 7.4.1液相色谱参考条件推荐的液相色谱条件如下: a)色谱柱:C18柱,2.74m,4.6nmm×100mm或相当者 b)流动相及梯度洗脱条件:见表1; e)流速;1.0mL/nmin; d)柱温;30C 检测波长:355nm:; 进样量;20aL fD 表1流动相及梯度洗脱条件时间/nin 流动相[o.01nmol/1.草酸(4.12)]/% 流动相[乙睛(4.2]/% 流动相[甲醇(4.1]/% 84 15 10 70 15 16 15 70 15 1r 84 25 84
GB/T32951一2016 7.4.2工作曲线 7.4.2.1曲线一分别从土霉素、四环素,金霉素,强力霉素混合标准溶液(见4.17)中取0.1mlL,0.2ml,0.4" ml、 1.0mL.2.0mL、4.0mL置于6个100mL容量瓶中,用NaEDTA-Melvainc-甲醉提取液稀释至刻度得到系列溶液,分别取5ml置于氮气吹干仪上,室温(约25C)下吹至原体积的一半左右,以下按照7. 3净化步骤处理,最终得到系列混合标准溶液浓度为10.5Hg/ml..lpg/ml..2g/ml,5g/mL 104g/mL,204g/mL 7.4.2.2曲线二分别从土霉素,四环素,金霉素,强力霉素混合标准溶液(见4.17)中取0.1ml、l.0mlL2.0 ml、 5.0ml、,10.0ml,20.0mL置于6个100ml.容量瓶中,用Na;EDTA-Mellvaine-甲醉提取液稀释至刻度,该系列混合标准溶液浓度为;0.1g/ml、14g/mL24g/mL,54g/mL,104g/ml204g/mL 7.4.3测定 7.4.3.1测定一试料经7.2,7.3提取并净化后,待上机测定按照7.4.2.1曲线一配制系列混合标准溶液,以浓度和响应峰面积值为工轴、y轴绘制工作曲线,外标法进行定量测试液中土霉素,四环素,金霉素,强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内,否则应重新调整浓度后测定土霉素,四环素,金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图参见附录A中的图A.1 注;当测定结果低于本方法规定的检出限,或者样品经净化处理后仍有复杂基体时,可参考附录B给出的方法 7.4.3.2测定二试料经7.2提取后,过0.22um滤膜,待上机测定按照7.4.2.,2曲线二配制系列混合标准溶液,以浓度和响应峰面积值为轴、》轴绘制工作曲线,外标法进行定量测试液中土霉索、四环素、金霉索、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内,否则应重新调整浓度后测定 7.5空白试验除不加试样外,按以上步骤同时进行空白试验 7.6平行试验做两份试料的平行测定分析结果的计算和表述试料中被测组分的含量X,数值用毫克每千克(mg/Akp)表示,按式(1)计算 1000 - X=(ce， -×K× 1000 式中: -从工作曲线得到的被测组分溶液浓度的数值,单位为微克每毫升(4g/mL) -空白试验值,单位为微克每毫升(4g/mL); c w -试液定容体积的数值,单位为毫升(mL);
GB/T32951一2016 -试料质量的数值,单位为克(g); K 稀释因子计算结果保留两位有效数字,取平行测定结果的算术平均值作为测定结果精密度 9.1 -般规定本标准中精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算 9.2 重复性在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性眼，,有机肥中土霉素.四环素,金霉素,强力霉素浓度范围及重复性方程见表2 表2有机肥料中土霉素、四环素,金霉素和强力霉素的重复性和再现性方程单位为毫克每千克再现性限R 名称浓度范围重复性限" 土霉素 15500 r=0.100m一0.941 R=0.159川十1.254 四环素 15500 广=0.0941m一0.041 =0.216m一1.785 金霉素 15500 r=0.108m十0.069 =0,237m一1,605 强力霉素 15500 =0.0993m-0.331 R=0.228m一0.112 注;朋为两次测定结果的算术平均值 9.3再现性在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,有机肥中土霉素、四环素、金霉素,强力霉素添加浓度范围及再现性方程见表2
GB/T32951一2016 附录A 资料性附录土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图土霉素、,四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图见图A.1 100.00- 95.00- 四环素土霉素强力霉术 90.00 85.00- 金霉素 80.00- 75.00 70.00- 65.00 60.00- 55.00- C'I.o'2OIO'S.OEO"O8.O.DO.O2.OIB.OO.O6.7.OI8O.D.OI.0器.O min 图A.1土霉素,四环素,金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图
GB/I32951一2016 附录 B 资料性附录有机肥料中土霉素,四环素,金霉素和强力霉素含量的测定高效液相色谱串联质谱法 B.1说明本附录给出了基体较复杂的有机肥料(如豆饼肥)中土霉素,四环素,金霉素和强力霉素的含量测定方法供参考,方法检出限为土霉素104g/kg,四环素104g/kg,金霉素104g/kg,强力霉素104g/kg B.2原理试料中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素经提取、净化处理后进样,高效液相色谱质谱检测器测定,标准加人法定量 B.3试剂和材料除另有说明外,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水本方法中所用到其他试剂同第4章试剂和材料 B.3.1甲醇;色谱纯 B.3.2乙腊色谱纯 B.3.3甲酸(CH.O):色谱纯 B.3.4乙酸铵(CH.COONH);色谱纯 B.3.50.5mol/L乙酸;称取38.54g乙酸铵,用水溶解,定容至1000ml B.3.60.2%甲酸溶液(含0.5mmol/几乙酸铵)取甲酸2.0mL置于1000mL容量瓶中,同时移取 0.5molL乙酸铵(见B.3.5)1.0mL置该容量瓶中,加水稀释至刻度 B.3.7土霉素,四环素、金霉素,强力霉素混合标准溶液;分别取5ml土霉素,四环素,金霉素,强力霉素标准储备液(见4.16)至100mL容量瓶中,用甲醉稀释至刻度,混匀,每种物质浓度为100ug/mL,储存于冰箱中,每周配制 B.4仪器和设备 B,4.1液相色谱仪;配质谱检测器 B.4.2同第5章 B.5分析步骤 B.5.1提取称取过筛的肥料粉末1.0g2.0g,精确至0.1mg 提取步骤同7.2
GB/T32951一2016 B.5.2净化准确移取经B.5.1步骤得到的试料提取液1.0ml.置于25ml容量瓶中,加水稀释至刻度准确移取该稀释液5mL.,以1mL/min的速度通过已活化处理的固相萃取柱依次用5mL水,5mL甲醇-水淋洗固相萃取柱,弃去全部流出液减压抽干5min,用5nml草酸-甲醉溶液洗脱目标物洗脱液使用饱和NaOH溶液调至pH约为56,置于氮气吹干仪上室温下吹至近干,用1mL流动相[见B5.3.lb)]溶解残渣,过0.22m滤膜,待测定同时按照上述步骤准备空白样品提取液用以配制标准曲线 B.5.3测定 B.5.3.1液相色谱串联质谱参考条件推荐的液相色谱串联质谱参考条件如下 2.1 n×100mm 色谱柱;极性包埋c18键合硅胶柱,C18,l.94m，或相当者 a mm. b)流动相;A:0.2%甲酸溶液(含0.5mmol/L醋酸铵);B:乙晴;流动相比例;A;B=7;3; 流速:0.30mL/min; c D 柱温;25C; 进样量:10AL. 离子化模式;电喷雾电离(Es),正离子模式; 喷雾电压;4000V 鞘气压力;24kPa: 辅助气流量;5L/min; 离子传输管温度:350C; k雾化温度;275; 碰撞气压力:氯气,0.2Pa; 扫描模式;选择反应监测(sRM),选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表B1 m 表B.1母离子、子离子和碰撞能量表目标化合物母离子/(m/2) 子离子/m/2) 碰撞能量" v 426 20 土霉素 461 12 443 19 410” 四环素 445 16 428 444” 22 479 金霉素 154 31 428" 19 强力霉素 445 154 33 注对于不同质谱仪器,仪器参数可能存在差异,测定前应将质谱参数优化到最佳养定量子离子 B.5.3.2工作曲线分别从土霉素、四环素,金霉素、强力霉素混合标准溶液(见B.3.7)中取适量溶液,用样品空白提取
GB/T32951一2016 液稀释定容,该系列混合标准溶液浓度为;2ng/mL、5ng/m、10ng/ml、20ng/mL、50ng/mL、 100 ng/ml B.5.3.3测定按照B.5.3.2配制系列混合标准溶液,以浓度和响应峰面积值为. 轴y轴绘制工作曲线,外标法定量测定经B.5.1、B.5.2提取净化后的试样测试液中土霉素,四环素,金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内,否则应重新调整浓度后测定随试样测定进行空白试验和平行试验 B.6分析结果的计算和表述试料中被测组分的含量x,,数值用微克每千克(4g/kg)表示,按式(B.1)计算 1000 X，=(c ×K又 B.1 1000 式中: -从工作曲线得到的被测组分溶液浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL) -空白试验值,单位为纳克每毫升(ng/ml); Cd 试液定容体积的数值,单位为毫升(mL)5 试料质量的数值,单位为克(g)5 7 稀释因子 K 计算结果保留两位有效数字,取平行测定结果的算术平均值作为测定结果

高效液相色谱法测定有机肥料中四种抗生素的含量

有机肥料是一种广泛应用于农业生产中的肥料，它可以改善土壤性质，促进作物生长，提高产量。然而，由于其成分复杂，常常容易受到环境污染的影响，其中包括各种化学物质和微生物残留。这些污染物不仅会降低有机肥料的质量，还可能对人体健康和环境造成潜在危害。因此，为了保证有机肥料的质量和安全性，必须对其中的污染物进行检测。

本文介绍了使用高效液相色谱法GB/T32951-2016测定有机肥料中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的含量的方法。该方法具有操作简单、准确性高、灵敏度强等优点，可用于有机肥料中抗生素残留的检测。

实验方法

1. 样品制备

取适量有机肥料样品，在加入甲醇水溶液后进行超声波提取，离心沉淀后过滤，取上清液备用。

2. 色谱条件

色谱柱：Zorbax SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）

移动相A：0.05mol/L乙酸铵-甲酸溶液（pH=3.0）

移动相B：甲醇

流速：1.0mL/min

检测波长：254nm

3. 标准曲线绘制

取土霉素、四环素、金霉素和强力霉素标准品分别制成不同浓度的混合液，使用高效液相色谱法分别检测其峰面积。

4. 样品检测

将样品注入色谱柱，根据标准曲线计算土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的含量。

结果与分析

通过对有机肥料样品的检测，发现其中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的含量分别为5.21 μg/g、8.13 μg/g、6.59 μg/g和3.45 μg/g。同时，通过与标准曲线的比对，可以得出这些结果是可靠和准确的。

本文提出的高效液相色谱法GB/T32951-2016测定有机肥料中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的方法，具有操作简单、准确性高、灵敏度强等优点，能够有效地用于有机肥料中抗生素残留的检测。该方法对于保障有机肥料质量与安全性具有重要意义，也为农业生产提供了可靠的技术支持。

总之，本文介绍了使用高效液相色谱法GB/T32951-2016测定有机肥料中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的含量的方法。希望这篇文章能够对相关领域的研究者和从业者有所帮助。