GB/T18869-2019
饲料中大肠菌群的测定
Determinationofcoliforminfeeds
- 中国标准分类号（CCS）B46
- 国际标准分类号（ICS）65.120
- 实施日期2020-01-01
- 文件格式PDF
- 文本页数17页
- 文件大小989.97KB
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饲料中大肠菌群的测定
国家标准 GB/T18869一2019 代替GB/T188692002 饲料中大肠菌群的测定 Determinationofcoiformsinfeedls 2019-06-04发布 2020-01-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/T18869一2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准代替GB/T18869一2002《饲料中大肠菌群的测定》
本标准与GB/T188692002相比,主要技术内容修改如下 -修改了适用范围(见第1章,2002年版的第1章); -增加了术语和定义(见第3章); -修改了原理的描述(见第4章,2002年版的第3章; -增加了LsT发酵法(见8.3)
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口
本标准起草单位农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 北京)]
本标准主要起草人;李丽蓓、刘晓露、李胜、王彤
本标准的历次版本发布情况为 GB/T188692002
GB/T18869一2019 饲料中大肠菌群的测定 范围 本标准规定了饲料中大肠菌群的测定方法
本标准适用于饲料和饲料添加剂中大肠菌群的测定
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列定义适用于本文件
3.1 大肠菌群eoliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖产酸产气的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽袍杆菌
3.2 最可能数 mstprobabhlenumbher;MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法
原理 将待测样品稀释至适当浓度并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计 学概率论推算表,查出待测样品中大肠菌群的最大可能数
培养基或材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂
5.1水:符合GB/T6682中三级水的要求
5.2乳糖胆盐发酵培养基:见附录A中A.l 5.3伊红美蓝琼脂见附录A中A.2.
5.4乳糖发酵培养基;见附录A中A.3 5.5革兰氏染色液见附录A中A.4
5.6月桂基硫酸盐胰蛋白(laurylsulfatetryptose,LsT)肉汤:见附录A中A.5
5.7煌绿乳糖胆盐(brilliantgreen lactosebile,BGLB)肉汤;见附录A中A.6
5.8磷酸盐缓冲液:见附录A中A.7
5.9无菌生理盐水见附录A中A.8.
GB/T18869一2019 5.10氢氧化钠溶液:c(NaOH)=1mol/儿L
见附录A中A.9
5.11盐酸溶液:e(HCl)=lnmol/L
见附录A中A.10. 仪器设备 6 6.1天平;感量0.1g
6.2恒温培养箱:36C士1C
6.3无菌吸管lmL(具0.01mL刻度),10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头 6.4无菌锥形瓶;容量500mL
6.5均质器
6.6振荡器
6.7显微镜;普通生物显微镜 pH计或精密H试纸 6.8 样品 7.1采样原则 样品的采集应遵循随机性、代表性的原则
采样过程应遵循无菌操作程序,防止一切可能的外来 污染
7.2采样方法 7.2.1应在同一批次产品中采集样品,每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求，一般不少于 500g(mL. 独立包装小于,等于500x的固态产品或小于,等于500mL的液态产品,取完整包装
7.2.2 7.2.3独立包装大于500mL的液态产品,应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体,使其达到均质后采集 适量样品,放人同一个无菌采样容器内作为一件样品
7.2.4独立包装大于500g的固态产品,应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品,放 人同一个无菌采样容器内作为一件样品
7.3采集样品的贮存和运输 7.3.1应尽快将样品送往实验室检验
7.3.2应在运输过程中保持样品完整
7.3.3应在接近原有贮存温度条件下贮存样品,或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化
试验方法 8 8.1试验方法类别 本标准试验方法分为乳糖胆盐发酵法和L.ST发酵法,乳糖胆盐发酵法适用于限量要求以 MPN/100g(mL)为单位的产品,LST发酵法适用于限量要求以MPN/g(mL)为单位的产品
8.2乳糖胆盐发酵法 8.2.1试样的稀释 8.2.1.1固态和半固态样品;称取25g试样,放人盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质
GB/T18869一2019 杯.800r/min一10o00r/mim均质1min一2min,或放人盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无 菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成10倍稀释的样品匀液
注:含有硬物的原料,如肉骨粉等里面含骨渣易扎破均质袋,不宜用拍击式均质器
8.2.1.2液态样品;以无菌吸管吸取25mL样品置于盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥 形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中,置于振荡器中振荡,充分混匀,制成10倍稀 释的样品匀液
注:黏稠样品宜采用固态称量法
8.2.1.3用1ml无菌吸管或微量移液器吸取10倍稀释的样品匀液1mL,沿管壁缓缓注人9mL磷酸 盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管和吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换一只1ml 无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成100倍稀释的样品匀液
8.2.1.4根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液
每递增稀释 -次,换一只1mL无菌吸管或吸头
从制备样品匀液至样液接种完毕,全过程不超过15min 8.2.2乳糖发酵试验 每个样品选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管 乳糖胆盐发酵管,每管接种1ml(如接种量超过lmL,则用双料乳糖胆盐发酵管),置36C士1C培养 箱内,培养24h土2h,观察倒管内是否有气泡产生,如未产气则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则 按8.2.3和8.2.4程序进行操作
8.2.3分离培养 将产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上,置36C士1培养箱内,培养18h一24h,然后 取出,观察菌落形态,并做确证试验 8.2.4确证试验 在上述平板上,挑取可疑菌落1个2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36C士1C培 养箱内,培养24h士2h,观察产气情况
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽抱杆菌,即可报告大 肠菌群为阳性
8.2.5试验程序图 乳糖胆盐发酵法试验程序图见附录B. 8.3IST发酵法 8.3.1试样的稀释 操作同8.2.1
8.3.2初发酵试验 每个样品选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管 LST肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1nmL,则用双料IST肉汤),36C士1C培养24h士2h,观察 倒管内是否有气泡产生,24h士2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h士2h 产气者进行复发酵试验
未产气者为大肠菌群阴性
8.3.3复发酵试验(证实试验》 用接种环从产气的IST肉汤管中分别取培养物1环,移种于GLB管中,36C士1C培养48h士2h
GB/T18869一2019 观察产气情况
产气者,计为大肠菌群阳性管
8.3.4试验程序图 LST发酵法试验程序图见附录C o 结果报告 9.1根据确证为大肠菌群阳性的管数,检索乳糖胆盐发酵法大肠菌群最可能数(MPN)检索表见附录 D),报告每100g(mL)样品中大肠菌群的MPN值
9.2根据确证为大肠菌群阳性的管数,检索IST发酵法大肠菌群最可能数(MPN)检索表(见附录E)， 报告每克(毫升[g(ml)]样品中大肠菌群的MIPN值
GB/T18869?2019 ? A 淶?? A.1?η A.1.1? ? 20g (?, 5g 0g 25 0.04%???? mL ? 1000mL A.1.2? ??μ?,pH7.4?0.2,??,??10mL,? С,l15C?15min??η????,??? A.2?(EMB A.2.1? ? 10g 10 g 2g ? 17g 2%Y? 20mL 0.65%? 10ml ? 1000mL A.2.2? ?衢????,pH7.1?0.2,??,121? 15min???,50C55C,?,?,??塣 A.3? A.3.1? ? 20g 0g 25mL 0.04%??? 10001 ml ??
GB/T18869一2019 A.3.2制备 将蛋白陈及乳糖溶于水中,调节pH至7.4士0.1,按检验要求分装30mL、10ml或3mL,并放人 一个小导管,l15C高压灭菌15 min
3ml供证实试验用 A.4革兰氏染色法 A.4.1结晶紫染色液 A.4.1.1 成分 结晶紫 1 8 95%乙醉 2g 0g/1草酸铵溶液 80mL A.4.1.2制备 将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合
A.4.2革兰氏碘液 A.4.2.1成分 碘 碘化钾 2g 蒸水 300ml A.4.2.2制备 将碘与碘化钾先进行混合,加人蒸僧水少许,充分振摇,待完全溶解后,加人蒸水300mL
A.4.3沙黄复染液 A.4.3.1成分 沙黄 0.25g 95%乙醇 2g" 90mL 蒸憎水 A.4.3.2制备 将沙黄溶解于乙醉中,然后用蒸榴水稀释
A.4.4染色 A.4.4.1将涂片在火焰上固定,滴加结品紫染色液,染色1min,水洗
A.4.4.2滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗
A.4.4.3滴加95%乙醇脱色,约30s,或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色 0s
A.4.4.4水洗,滴加复染液,复染1min
水洗,待干,镜检
亦可用1:10稀释石灰酸复红染色液作复 染液,复染时间仅需10s
GB/T18869?2019 A.4.4.5 ????? A.5???(L.ST) A.5.1? 20.0 ???? g 5.0g ? 5.0g 2.,75g (K,HPO (KHPO 2.75g 0,1 ? g ? 1000mL A.5.2? ??1000ml?,pH6.8?0.2?вС??,? 10ml121C?15min A.6?(BGLB) A.6.1? ? 10.0g 10.0g ?(oxgalloxbile)? 200mL 0.1%?? 13.3ml ? 1000mL A.6.2? ??500mL?,??200mL(20.0g?? 200mL??,pH7.07.5),???975mL,pH7.2?0.1,?0.1% ??13.3mL,??1000mL,??,?вС??,? 0mL121C?15min. λ? A.7.1? a4.0g (KH,PO 500 ? ml A.7.2? ?;?34.0g500ml.?,??175ml1mol/ ?pH7.2?0.2,???1000mlL????
GB/T18869?2019 ??;??1.25mL,???1000mL,???(6.4),121C? 15min A.8?? A.8.1? 8.5 ? g 1000m ?? A.8.2? ?8.5g?1000ml??,121C?15min A.9 mol/L? A.9.1? (NaOH 40.0g ? 1000ml A.9.2? ?40g1000mL???С A.101mol/I? A.10.1? (HCI) 90ml ?? 1000mml A.10.2? ??90mL,???1000mL
GB/T18869一2019 附录 B 规范性附录 大肠菌群乳糖胆盐发酵法试验程序图 大肠菌群乳糖胆盐发酵法试验程序见图B.1
mL十225mL稀释液，均质 检样25gG 10倍系列稀释 选择适宜3个连续稀释度的样品匀液，接种乳糖胆盐发酵管 36c土！ 24h士2h 不产气 报告 伊红美蓝琼脂平板 36C土1C，24h士2h 革兰氏民染色 乳糖发酵管 36土1C，24h土2h 革兰氏阳性 革兰氏阴性菌无芽刊杆菌 不产 大肠曲群阴性 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 结果报告 结果报告 结果报告 图B.1大肠菌群乳糖胆盐发酵法试验程序
GB/T18869一2019 录 附 C 规范性附录) 大肠菌群LST发酵法试验程序图 大肠菌群IST发酵法试验程序见图C.1
检样5g(ml) 稀释液，均质 +225ml 10倍系列稀释 选择适3个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管中 36C士1 24h~48" 不产" 产气 BGLB肉汤 36土！c 48h土2h 不产气 大肠菌群阴性 大肠菌群阳性 查MPN表 结果报告 图c.1大肠菌群IST发酵法试验程序 0
GB/T18869一2019 录 附 D 规范性附录 乳糖胆盐发酵法大肠菌群最可能数(MPN)检索表 每100gmL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索，见表D.1
表内所列检样量如改用 10g(mL)、1g(mL)和0.1g(mL)时,表内数字相应降低10倍;如改用0.1g(mL),0.01g(mL.)和 0.001g(mL)时,表内数字相应增加10倍,其余可类推
表D.1乳糖胆盐发酵法大肠菌群最可能数(MP)检索表 阳性管数 95%可信限 MPN 1g(ml)×3 0.1gml)×3 0.01g(ml)×3 上限 下限 90 30 5 30 90 5 60 90 90 <5 90 30 5 130 60 <5 130 90 130 120 130 60 90 120 160 90 130 160 190 40 200 70 1o 210 110 150 70 10 230 1l0 30 36o 150 190 110 150 1
GB/T18869一2019 表D.1(续 阳性管数 95%可信限 MPN 上限 下限 g(ml)×3 0.lg(ml)×3 0,01g(ml)×3 200 240 160 200 240 290 90 10 360 l40 3o 370 200 26o 150 30 440 200 70 890 270 340 21o 40 470 28o 100 1500 2 350 420 290 360 440 530 230 40 1200 390 70 l300 640 150 3800 950 430 70 2100 750 2300 140 1200 300 3800 1600 930 50 3800 1500 4400 300 2100 350 4700 12
GB/T18869一2019 表D.1续 95%可信限 阳性管数” MPN 上限 下限 lg(ml)×3 0.lg(ml)×3 0,01g(ml)×3 2900 2400 36o 13000 4600 71o 2400o ll000 1500 48000 >24000 本表采用3个稀释度[lgmL),0.1g(mL)和0.01gmL],每个稀释度接种3管
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GB/T18869一2019 录 附 规范性附录) LS发酵法大肠菌群最可能数(MPN)检索表 每克(毫升[g(mL)]检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索,见表E.1
表内所列检样量如改用 1g(mL),0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字相应降低10倍;如改用0.01g(mL),0.001g(mL)和 0.0001g(mL)时,表内数字相应增加10倍,其余可类推
表E.1LST法大肠菌群最可能数(MPN)检索表 阳性管数 95%可信限 MPN 0,1g(ml)×3 0.01g(ml)×3 0,001g(ml)×3 上限 下限 <3.0 9.5 3.0 9.6 0.15 0.15 3.0 n 6. 18 1.2 6.2 18 1.2 3.6 9.4 38 3.6 18 0.17 7.2 18 1.3 11 38 3.6 2o 1.3 7.4 l 38 3.6 11 42 3.6 15 42 4.5 16 42 4.5 9.2 38 1.4 9 14 3,6 20 4.5 42 15 42 3.7 20 42 4.5 27 94 8.7 21 42 4.5 28 94 8.7 8.7 35 94 29 94 8.7 36 8.7 94 23 94 4.6 14
GB/T18869一2019 表E.1续 95%可信限 阳性管数” MPN 上限 下限 0.lg(ml)×3 0,01g(ml)×3 0.001g(ml)×3 l10 38 8.7 64 1n 180o 43 18o 75 200 17 7 120 420 160 420 40 93 420 18 150 420 37 210 430 40 290 1000 90 240 1000 42 460 2000 90 1100 4l100 180 ll00 420 本表采用3个稀释度[o.1g(nL),0.01g(mL)和0.0o1g(nL)],每个稀释度接种3管
饲料中大肠菌群的测定GB/T18869-2019
饲料中大肠菌群的测定是衡量饲料安全性的重要指标之一。大肠菌群是指在大肠杆菌属下的菌株，包括致病性和非致病性菌株。在饲料生产过程中，如果存在大肠菌群超标的情况，可能会对动物的健康造成威胁。
GB/T18869-2019标准介绍
GB/T18869-2019《饲料中大肠菌群的测定》标准规定了大肠菌群的测定方法。该标准适用于饲料样品中大肠菌群的测定，包括试验室内和野外条件下测定。
GB/T18869-2019标准中的大肠菌群测定方法主要分为以下几个步骤：
- 样品制备：将饲料样品按照一定比例加入缓冲液中，并进行均匀混合
- 提取杆菌：通过不同的筛选方法，筛选出大肠杆菌，并将其进行培养和分离
- 计数：对分离出的大肠杆菌进行计数，并根据计数结果计算出饲料中大肠菌群的数量
注意事项
在进行饲料中大肠菌群测定时需要注意以下几个方面：
- 样品制备过程应该充分均匀混合，以确保测定结果的准确性
- 在进行大肠杆菌的培养和分离时，应该控制好温度、时间等因素，避免对培养结果产生影响
- 计数过程中要注意选择适当的计数方法，例如平板计数法、膜过滤法等，以获得准确的结果
总结
饲料中大肠菌群的测定是保障动物健康和生长发育的重要手段。GB/T18869-2019标准提供了详细的测定方法，需要严格按照标准操作，以获得准确的测定结果。
饲料中大肠菌群的测定的相关资料
- 饲料中蜡样芽孢杆菌的检测GB/T26427-2010
- 饲料中产气荚膜梭菌的检测GB/T26425-2010
- 畜禽饲料有效性与安全性评价全收粪法
- 畜禽饲料有效性与安全性评价强饲法
- 饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测GB/T26428-2010详解
- 膜过滤法测定入出境船舶压舱水中大肠菌群GB/T28230-2011
- 饲料中大肠菌群的测定GB/T18869-2019
- 橡胶全硫含量的测定第1部分：氧瓶燃烧法GB/T4497.1-2010
- 气相色谱-质谱法测定海水中16种多环芳烃的方法（GB/T26411-2010）
- 原铝生产用煅后石油焦检测方法第5部分：残留氢含量的测定GB/T26310.5-2010
- 原铝生产用煅后石油焦检测方法第4部分：油含量的测定溶剂萃取法GB/T26310.4-2010
- 加热法测定煅后石油焦表观油含量
- 饲料中大肠菌群的测定GB/T18869-2019
