畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程

畜禽细胞体外培养与冷冻保存技术规程

国家标准 GB/T24863一2010 畜禽细胞体外培养与 冷冻保存技术规程 Teehmiealregulatonoftarmanimalseelcureamdcryoprservation 2010-06-30发布 2011-01-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T24863一2010 前 言 本标准由农业部提出 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口 本标准起草单位;农业科学院北京畜牧兽医研究所 本标准主要起草人:关伟军、马月辉、李向臣、李晗、闫雷、赵倩君、宫雪莲
GB/T24863一2010 畜禽细胞体外培养与 冷冻保存技术规程 范围 本标准规定了畜禽体细胞保存方法 本标准适用于猪、牛、羊、马,驴,鸡、鸭、鹅等畜禽细胞体外培养与保存 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 体细胞体外培养inirsomaticeelleuture 将体细胞在模拟体内生存环境的体外条件中进行培养,使细胞生长增殖,并保留其完整结构和功能 特性的方法 3. 2 eellculture 原代细胞培养primary 将体细胞在模拟体内生存环境中进行培养,使细胞生长增殖达到可传代状态的培养方法 3. 3 细胞冷冻保存 cellcryopreservation 将体外培养细胞与冻存液按一定比例混匀后,按设定的降温速率降温,使其于液氮中长期保存的 过程 工作区条件 工作区一般要由准备室、缓冲间,无菌室、细胞保存室组成 其中,缓冲间面积应不小于了m,并设有更衣柜和紫外灯,紫外灯的强度为不少于1.5w/mi 紫 外线灯管距地面不应超过2.5m,每次照射时间为20min一30min 无菌室无菌等级的最低标准应达 到万级 主要仪器,设备 超净工作台,冰箱,鼓风干燥箱、高压蒸汽消毒器、液氮生物容器、离心机、电子天平,cO 培养箱、 超纯水装置和显微镜等 清洗与消毒 玻璃器皿清洗与消毒 6. .1.1浸泡 所需的玻璃器皿在含有洗涤剂的清水中浸泡12h
GB/T24863一2010 6.1.2刷洗 选软毛毛刷,反复洗刷后用清水冲洗3次,三蒸水冲洗3次后,60C下烘干后备用 6.1.3酸浸 酸浸时间为24h 6.1.4冲洗 酸浸后先用自来水反复冲洗10次以上,最后用超纯水浸洗3次5次,烘干包装 6.1.5消毒 高压灭菌应以0.14MPa一0.16MPa的压力下持续15min30min. 6.1.6初次玻璃器皿使用 初次使用玻璃器皿需要先经过浸泡和洗刷再置于5%稀盐酸溶液中浸泡12h以上,其余操作同 6.1.3,6.1.4和6.1.5等步骤 金属器皿清洗与消毒 金属材质的器具除了没有酸浸处理步骤外,其余步骤同6.1. 塑料与橡胶制品清洗与消毒 塑料和橡胶材质的器具用清水浸泡和冲洗同玻璃器皿清洗,之后还需要用2%的NaOH浴液浸泡 12h,请水冲洗和烘干后用1%稀盐酸浸泡30m,再用请本相三燕水分别冲洗3次,高压灭首粗烘 后备用 高压灭菌以0.073MPa的压力下持续10min 试剂与培养液 水 实验用水符合GB/T6682一级用水的要求 7.2平衡盐溶液 生理盐水或磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuferedsaline,PBS)适用于细胞传代前漂洗细胞 7.2.1PBs 称取4.00gNacI,0.10gKcl1.45gNaHPO 12H.O.Q.10gKH.PO,.,加超纯水定容至 500ml.,调节pH至7.2,高压灭菌,密封后置于4C条件下贮存 7.2.2生理盐水 称取4.50NaCI,加人500mL超纯水,高压灭菌,密封后置于4C条件下贮存 7.3血清 10%15%的胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)适合于家畜和家禽细胞的培养 7.4培养基 85%一90%的高糖最低限量必需培养基(minimumessentialmedium,MEM),适用于家禽细胞的 培养;85%90%的高糖Dulbecco改良Eagle培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium,DMEM),适 用于家畜细胞的培养 用直径为0.224m和0.45Am滤器过滤 7.4.1MM含Earle's盐)培养基 称取9.60gMEM,溶于1000mL超纯水中,加人2.20gNaHHCcO,使最终pH为7.2一7.4,用 .22Am的滤器进行过滤,分装 从每瓶中取3ml5mL用于检菌,其余置于4C条件下贮存 0 高糖D\MEM培养基 称取13.40gDMEM,溶于1000mL超纯水中,加人3.70gNaHCO,使最终pH为7.2~7.4,用 0.22 2m的滤器进行过滤,分装 从每瓶中取3ml5ml用于检菌,其余置于4C条件下贮存 7.4.3全培养基 培养基检菌3d后,取出未被污染的MEM或DMEM培养基加人特级FBS,使其终浓度为10% 用0.22Am的滤器过滤,分装 从每瓶中取3ml5mL用于检菌,其余置于4C条件下贮存 2
GB/T24863一2010 7.5消化液 称取0.10g(用于家禽)或0.25g(用于家畜)胰蛋白酶干粉,溶于PBS中,调pH至7.2~7.4,定容 至100mL 无菌操作台内,0.224m滤器过滤除菌,分装,密封后一20C条件下贮存 7.6冻存液 MEM或DMEM的基础培养基加人终浓度为10%二甲基亚讽(dimethylsulfoxide,DMsO)和 20%50%FBS,0.22m滤膜过滤除菌,密封分装,置于一20C条件下贮存 体细胞体外培养与保存 样品采集 家畜样品采集 采集家畜耳缘组织、脏器 耳缘组织采集需先用75%的酒精对采样部位进行消毒,剪净耳毛后再 进行消毒采样;采集脏器样品时要用生理盐水冲洗干净 根据实验需要选取大小适中的组织样品,放人 mL备有PEBs或相应基础培养基的离心管中,封口后立即标记样品名称、性别、年龄、采样地点、采样 5 部位个体编号和买样时间等信息,并在记录本上记录 8.1.2家禽样品采集 5e 采集家禽皮肤、适当日龄的胚胎组织,其余步骤同8.1.1 8.2样品运输 样品放人4C的采样箱后应退迷运往实验室 保存在Ps中的样品应在24b内进人原代培养阶 段 保存在基础培养基中的样品应在48h内带回实验室进行原代培养 8.3原代细胞培养 8.3.1家畜细胞原代培养 在室温下的超净工作台中用PBS清洗家畜样品后,将组织样品剪成1mnm大小的组织块,均匀涂 于培养瓶底壁,倒置于37C,5%cO和饱和湿度的培养箱中培养,待组织块微干并黏附在培养瓶底部 后加人适量全培养基浸润组织样品,直至组织样品贴壁牢固时翻瓶加液进行原代培养 8.3.2家禽细胞原代培养 家禽的胚胎需要去掉脑,眼、四肢和内脏,其余步骤同8.3.1 8.4传代培养 8. 4.1家畜细胞传代培养 当家畜细胞汇合达到培养瓶底壁的80%85%时,弃去培养基,用生理盐水或PBS清洗3次,加人 适量的0.25%的胰蛋白酶到培养瓶顶壁,37c、5%cO培养箱中放置5min,翻瓶,再置于培养箱中作 用30s,倒置显微镜下观察到细胞质回缩,细胞间隙增大时,拍打培养瓶使细胞分散 然后立即加人全 培养基,分瓶培养 8 4.2家禽细胞传代培养 培养家禽细胞时,加人适量的0.10%胰蛋白酶,立即翻瓶,其余步骤同8.4.1 88 5 细胞冷冻保存 传3代后,细胞汇合达到培养瓶底壁的80%一85%,按常规法消化细胞,加人全培养基,制成均匀 的单细胞悬液,计算细胞总数 300g离心8min,弃上清,根据细胞总数加人适量冻存液混匀,使细胞密 度达到1.0×10个/mL3.0×10个/mL,按每管1mL分装于冻存管中,标明细胞名称、冻存管编 号、性别和冻存日期 将冻存管放人程序降温盒中置于一70C条件下5h~6h或将冻存管放人程序降 温仪5h6h降温至一70C后,立即转人液氮中长期保存