蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22946一2008 蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、 红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、 克林霉素、吉他霉素、交沙霉素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法 Determinationoflineomyein,erythromyein,tilmie0sin,tylosin,spiramyein， elindamyein,kitasamycinandjosamyeinresiduesinroyaljelland yophilizedroyaljellypowder一ILC-NMIS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22946一2008 前 言 本标准的附录A、附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人:王飞、王海洋、曹彦忠,贾光群、张进杰、石玉秋、庞国芳
GB/T22946一2008 蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、 红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素 克林霉素、吉他霉素、交沙霉素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉 素,吉他霉素和交沙霉素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、,替米考星,泰乐菌素、螺旋霉素,克林霉 素、吉他霉素和交沙霉素残留量的测定 本标准的方法检出限;蜂王浆中的林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素,克林霉素、吉 他霉素,交沙霉素均为2.04g/kg;蜂王浆冻干粉中的林可霉素、红霉素、泰乐菌素,克林霉素、交沙霉素 均为2.04g/kg,替米考星、螺旋霉素、吉他霉素均为5.04g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 GB/T6379.1一2004,IsO5725-1:1994,IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法GB/T6379.2一2004,IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,IsO3696;1987,MOD 原理 蜂王浆和蜂王浆冻干粉中林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素和 交沙霉素的残留用Tris提取液提取,提取液经OasisHLB固相萃取柱'净化,甲醇洗脱,洗脱液浓缩定 容后,供液相色谱-串联质谱法测定 外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯 水:GB/T6682,一级 4.2甲醇;色谱纯 4. 乙酸铵 3 4 4 乙睛色谱纯 5 4 盐酸 OasisHlB固相萃取柱是water公司产品的商品名称,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不是表 示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T22946一2008 4.6三胫甲基氨基甲烧(Iris):CHNO 4.7氯化钙(CaCl2H.O. 4.8甲醉溶液(23);量取400ml.甲醉(4.2)与600ml水混合 4.90.01mol/儿L乙酸铵溶液;0.77g乙酸铵(4.3)溶解于水中,定容于1000ml容量瓶中 4.10定容液:0.01mol/1乙酸铵溶液(4.9)十乙睛(4.4)(17十3). Tris提取液:称取12.0g三胫甲基氨基甲炕(4.6)和7.35g氯化钙(4.7)溶解于水中,用盐酸 (4.5)调节pH值为9,定容至1000 ml 标准物质:林可霉素(CAS:7179-49-9)、红霉素(CAS59319-72-1),替米考星(CAS.l08050-54-0)、泰 乐菌素CAs;74610-55-2、螺旋霉素CAs;8025-81-8)、克林霉素CAS;21462-39-5)、吉他霉索 CAS:1392-21-8)和交沙霉素(CAs:16846-24-5)纯度>95% 4.13标准储备溶液I;l.0mg/ml 分别准确称取每种标准物质(4.12)适量,分别放人相对应的 10ml容量瓶中,用甲醉溶解并定容至刻度,混匀 4C保存 414标准储备溶液10.0pg/ml 分别吸取0.1ml各标准储备溶液(4.13),分别放人相对应的 10ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度 4C保存 48/ml 分别吸取2.0mL标准储备蔗液(4.1),分别放人相对应的10ml 4.15标准工作溶液:2.0 容量瓶中,用甲醇定容至刻度 4.16OasisHLB固相萃取柱或相当者;500mg,6mL 使用前,依次用10mL甲醇和10mL水活化 在抽真空前的各步骤中,都保持柱体湿润 滤膜:0.2 pm. 仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪.配有电喷雾离子源 5 天平感量0.01g.0.0001只 2 5.3固相萃取装置 ,4 氮气浓缩仪 5.5具塞聚丙烯离心管.50mL. .6 离心机 5.7超声谈清洗仪 8 pH计 5 55 g 振荡器 试样制备与保存 试样的制备 6 从全部样品中取出有代表性样品约200g,充分混匀,均分成两份,分别装人洁净容器内 密封后作 为试样,标明标记 在抽样和制样的操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 试样的保存 6 2 将蜂王浆试样于一18C保存 蜂王浆冻干粉试样密封保存,防止吸潮 测定步骤 提取 称取2g蜂王浆试样(蜂王浆冻干粉取1g),精确至0.01g,置于50ml离心管(5.5)中,加人 10.0mLTris提取液(4.11),于振荡器上剧烈振荡10min 以18000片离心力离心l0min,取上清液 以小于1.0ml/min的流速通过OasisHLB固相萃取柱(4.16) 再加人10.0mlTris提取液(4.ll).
GB/T22946一2008 于振荡器上剧烈振荡10min 以18000g离心力离心10min,取上清液以小于1.0ml/min的流速通 过OasisHLB固相萃取柱 7.2净化 待样液全部流出后,依次用10ml水和10ml甲醇溶液(4.8)洗柱,弃去全部流出液,将固相萃取 柱用真空泵减压抽干1h 再用10ml甲醉(4.2)洗脱于15ml氮吹管中,用氮气浓缩仪于50C水浴 中吹至近干,准确加人1.0ml定容液(4.10)后,于超声波清洗仪中溶解残渣 过0.2Am滤膜(4.17) 后,供液相色谱-串联质谱仪测定 基质标准混合工作溶液的制备 蜂王浆用基质标准混合工作溶液的制备;分别股取1.0L3.0L5.0nL.25儿的林可霉素、 红霉素、替米考星,泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素标准工作溶液(4.15).依次加人 相对应的阴性样品中,按7.1、7.2步骤制备林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉 素、吉他霉素和交沙霉素分别为2.0ng/mL、5.0ng/ml、,10.0ng/mL、50.0ng/mL 四个浓度水平的系 列基质标准混合工作溶液 7.3.2蜂王浆冻干粉用基质标准混合工作溶液的制备;分别吸取1.0L、2.0L、5.0AL,25L林可 霉素、红霉素,克林霉素,泰乐菌素,交沙霉素标准工作溶液(4.15)和2.5AL5.0L、l0.0nlL25uL的 替米考星、螺旋霉素、吉他霉素标准工作溶液(4.15),依次加人相对应的阴性样品中,按7.1、7.2步骤制 备林可霉素、红霉素、克林霉素、泰乐菌素、交沙霉素分别为2.0ng/mL、4.0ng/ml、l0.0ng/ml、 L、l0.0 ng/ml.,20.0ng/ml.50.0ng/mL.四 0.0聪/mL和替米考星、螺旋霉素,吉他霉素分别为5.0g/ml 个浓度水平的系列基质标准混合工作溶液 测定条件 7.4.1液相色谱参考条件 a 色谱柱.Alanisca，3am，150mmx2.1mm(内径)或相当者 b)流动相:A;乙晴,B;0.1%甲酸水溶液,C;甲醉 梯度洗脱条件见表1; c)流速0.2ml/min; dD 柱温30C; 进样量;20L 表1梯度洗脱条件 时间/min A/% B/% C/% 0.00 90.o 5.0 5.0 5.00 5.0 90.0 5.0 9.00 5.0 90.0 5,0 90.0 5.0 5.0 9.10 17.o 90.0 5.0 5.0 7.4.2质谱参考条件 a)离子源:电喷雾离子源; b) 扫描方式:正离子扫描; e)检测方式:多反应监测; d 电喷雾电压;5500V; e 雾化气压力:0.24MPa; 辅助气流速:0.4L/min 离子源温度;550C; h 碰撞室出口电压:2.0V;
GB/T22946一2008 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压:见表2 表2林可霉素、红霉素、替米考星泰乐菌素、克林霉素,螺旋霉素,吉他霉素和交沙霉素 定性离子对、定量离子对、碰撞气能量和去簇电压 化合物中文名称化合物英文名称定性离子对(m/e|定量离子对(G 碰撞气能量/N 去簇电压/八N n/2 37 50 407/126 407/126 林可霉素 lincomvcin 407/359 224 5o 734/158 42 50 红霉素 ervthromvcin 734/158 734/576 28 50 869/174 62 90 替米考星 tilmicosin 869/174 90 869/132 70 916/174 54 80 泰乐菌素 tylosin 916/174 55 80 916/145 45 53 425/126 克林霉素 425/126 dlindamycin 28 53 425/377 60 843/142 48 螺旋霉素 843/142 spiramyein 843/174 50 60 772/215 43 70 吉他霉素 kitasamyein 772/215 772/109 42 70 828/174 45 80 交沙霉素 josamyein 828/174 45 80 828/109 7.5液相色谱-串联质谱测定 7.5.1定性测定 被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同的试验条件下,样品中待测物质的保留时间与 标准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内;且样品中各定性离子相对丰度与浓度接近的基质标准 工作溶液中被测物的各定性离子相对丰度进行比较,若偏差不超过表3规定的范围,则可判定为样品中 存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示 K>50 20GB/T22946一2008 表4林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素 参考保留时间 化合物名称 保留时间/min 6,96 林可霉素 8.06 红霉素 8.36 替米考星 泰乐菌素 8.48 克林霉素 8.51 8.67 螺旋霉素 8,83 吉他霉素 9,14 交沙霉素 林可霉素、红霉素,替米考星、泰乐菌素,克林霉素、螺旋霉素将吉他霉素和交沙霉素的标准物质多反 应监测(MRM)色谱图参见附录A中的图A.1、图A.2、图A.3、图A.4、图A.5、图A.6、图A.7、 图A.8 林可霉素、红霉素、替米考星,泰乐菌素,克林霉素、螺旋霉素,吉他霉素和交沙霉素添加浓度及其平 均回收率的试验数据参见附录B中的表B.1 7.6平行试验 按上述步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.7空白试验 不称取样品,其余均按步骤7.1和7.2进行 结果计算 林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的残留量按 式(1)计算 00o 1 -x" 1000 式中: 试样中被测组分残留量,单位为毫克每千克(mg/kE) 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为微克每毫升(ug/mL); 试样溶液定容体积,单位为毫升(mL). 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) m7 计算结果应扣除空白值 精密度 9.1一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,其重复性和再现性的 值是以95%的可信度来计算 2 9 重复性 在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,林可霉素、红霉素、 替米考星、泰乐菌素,克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加浓度范围及重复性方程见表5
GB/T22946一2008 表5林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素 添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 添加浓度范围 重复性限r" 化合物名称 再现性R =0,8741 林可霉素 2.050.0 gR lgm一0.5182" gr=0.9392lgm-1.0304 gr=0.7974 -0.5775 红霉素 2.050.0 gR=1.0506gm lgm-0.981 替米考星 2.050.0 gr=1.0318lgmn lg朋一0.9859 gR=0.9853lgm一0.556" 泰乐菌素 2.050.0 1.0569lgm一0.9993 lgR=0.8513lgm一0.5616 lg 克林霉素 2.050.0 lgr=1.0798lgm-1.1495 lgR=0.8854lgm-0.4146 螺旋霉素 2.050.0 lgr=0.9125lgm-0.975l lgR=1.0432lgm-0.5917 吉他霉素 2.050.0 lgr=1.1001lgm-1.0250 lgR=1.1453lg-0.7665 交沙霉素 gr=1.4389lgm lgR=1.1227lgm一0.6965 注，"为两次测定值的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.3再现性 在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,林可霉素、红霉素、 替米考星,泰乐菌素,克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉索的添加浓度范围及再现性方程见表5
GB/T22946一2008 附 录A 资料性附录 标准物质多反应监测(MRN)色谱图 林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素的标准物质多反 应监测(MRM)色谱图分别见图A.1、图A.2,图A.3,图A.4,图A.5,图A.6,图A.7、图A.8 响应" 6.96 2.00e5 1.00e5 0.0 12 131415 10 图A.1林可霉素标准物质多反应监测(RM)色谱图 8.06 唰应值 6.00e4 5.00e4 4.00e4 3.00e4 2.00e4 .00e4 0.0 10 1 12 1s3 14 l5/minm 2 图A. 红霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图 响应值 3.00e4 8.36 2.00e4 1.00e4 0.0 10 11 12 131415 /min 图A.3替米考星标准物质多反应监测(RM)色谱图 I涮应值 8.48 6.0e4 5.00e4 4.00" 3.00e4 2.00e4 l.0e4 0.0 12 13 15 1/min 图A.4泰乐菌素标准物质多反应监测(RM)色谱图
GB/T22946一2008 响应值 2.00e5 8.51 l.00e5 0.0 12 13 15 /min 图A.5克林霉素标准物质多反应监测MRM)色谱图 响应值 8.67 6.00e3 5.00e3 4.00e3 3.00e3 2.00e3 l.0e3 0.0 15 10 12 13 14 /min 图A.6螺旋霉素标准物质多反应监测(MRM)色谱图 响应值 8.83 6.00e4 5.00e4 4.00e4 3.00e4 2.00e4 1.00e4 0.0 12 13 14 15 10 /min 图A.7吉他霉素标准物质多反应监测(MRNM)色谱图 制应值 9.14 6.00e4 5.00e4 4.00e4 3.00e4 2.00e4 1.00e4 0.0 0 13 15 /min 图A.8交沙霉素标准物质多反应监测(MIRM)色谱图
GB/T22946一2008 B 附 录 资料性附录 回 收 率 本方法中,林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和交沙霉素添加 浓度及其平均回收率的试验数据见表B.1 表B.1林可霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉他霉素和 交沙霉素添加浓度及其平均回收率的试验数据 化合物名称 添加浓度/ug/kg 平均回收率/% 94.9 2.0 5.0 94.9 林可霉素 10.0 101.9 20.0 88.8 2.0 97.l1 98.0 5.0 红霉素 10.0 96.6 20.0 94.1 2.0 94.2 5.0 98." 替米考星 92." 10.0 85.8 20.0 89.6 2.0 5.0 86.8 泰乐菌素 96.6 10.0 20.0 91.9 2.0 98. 8.1 5.0 克林霉素 10.0 93." 20.0 90.5 87.6 2.0 5.0 93.1 螺旋霉素 95.8 10.0 20.0 92.2 2.0 87.9 5.0 80.0 吉他霉素 10.0 99.6 20.0 86.4 89. 2.0 5.0 91.8 交沙霉素 10.0 94.2 20.0 94.2