GB/T36861-2018
饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定分光光度法
Determinationofactivityofβ-mannanaseasfeedadditive—Spectrophotometricmethod
- 中国标准分类号（CCS）B46
- 国际标准分类号（ICS）65.120
- 实施日期2019-04-01
- 文件格式PDF
- 文本页数5页
- 文件大小386.68KB
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饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定分光光度法
国家标准 GB/T36861一2018 饲料添加剂p甘露聚糖酶活力的测定 分光光度法 Determinationofactivityof卜mannanaseasfeedadditive Spectrophotometricmethod 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36861一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口
本标准起草单位:浙江大学饲料科学研究所、浙江明珠动物保健品有限公司
本标准主要起草人:邹晓庭、吴琪、周樱、王小俪、祝春雷、刘国花,谢红云、王凤芹、蒋媛婧、方洛云
GB/36861一2018 饲料添加剂卜甘露聚糖酶活力的测定 分光光度法 范围 本标准规定了测定饲料添加剂-甘露聚糖酶活力的分光光度方法
本标准适用于饲料添加剂甘露聚糖酶及其复合酶
本方法的定量限为10U/g
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 卜甘露聚糖酶活力单位队mamnanaseaetivityumit 在37C,pH为5.5的条件下,每分钟从浓度为3mg/mL的甘露聚糖溶液中释放1pmoal还原糖所 需要的酶量为一个甘露聚糖酶活力单位(U)
原理 B-甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖
还原性寡糖和单糖在沸水浴中与DNS试剂发生 显色反应
反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中B甘露 聚糖酶的活力成正比
通过分光光度计比色测定反应液的吸光度,计算出甘露聚糖酶的活力
试剂或材料 除非另有说明,试剂均为分析纯
5.1水:符合GB/T6682中二级水的规定 5.2氢氧化钠溶液(200g/L);称取20.0g氢氧化钠,加水溶解,定容至100mL
5.3乙酸溶液(0.lnmol/L)取冰乙酸0.60mL,加水稀释,定容至100mL 5.4乙酸钠溶液(0.lnmol/L);称取1.36只三水乙酸钠,加水溶解,定容至100ml
5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.1mol/儿L,pH5.5)称取23.14g三水乙酸钠,加人1.70mL冰乙酸,再加 水溶解,定容至2000mL
测定溶液的pH,如果pH偏离5,5,用乙酸溶液(5.3)或乙酸钠溶液(5,4)调 节至5.5
5.63,5-二硝基水杨酸(DNs)试剂;称取3,5-二硝基水杨酸(化学纯)3.15g,加水500mL,45C水浴 中搅排5s
然后缓慢加人100mL氢氧化钠溶液(5.2),不断搅拌,直到溶液清澈透明(在加人氢氧化钠 过程中,溶液温度不要超过48C)
再逐步加人91.00g四水酒石酸钾钠、2.50g苯酚和2.50g无水亚
GB/T36861一2018 硫酸钠
继续45C水浴加热,补加水300mL,不断搅拌,直到完全溶解
冷却至室温后,用水定容至 1000mL
过滤,取滤液,储存在棕色塑料瓶中,避光保存
室温下存放7d后使用,有效期为个月
5.7甘露聚糖溶液(6mg/mL);称取0.600段甘露聚糖(sigmaG0753),精确到0.001g,加人80ml 乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5),磁力搅拌,间断性加热,直至甘露聚糖完全溶解,停止加热,继续搅拌 30min， ,用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5)定容至100ml
4C避光保存,有效期为3d,使用前应搅拌 均匀
5.8D甘露糖标准贮备溶液精确称取预先在105C干燥至恒重的1.000gD甘露糖,加乙酸-乙酸钠 缓冲溶液(5.5)溶解,定容至100ml,得到10.0mg/mlD甘露糖标准贮备溶液
5.9 D甘露糖标准系列溶液;吸取D甘露糖标准贮备溶液(G.8)1.00mL.3.00nmL.3.00nl.400mlL
5.00mL,6.00mL和7.00ml,分别置于100ml容量瓶中,用乙酸-乙酸钠缓冲液(5.5)定容,摇匀,配制 成D甘露糖标准工作溶液,浓度为0.10mg/nL.,0.20mg/nL.0.30mg/'ml.0.0nmg/nL.,0.50nmg/mL mL 0.0mg/ml.0.0mg/" 仪器设备 6 6.1分样筛;孔径为0,.25mm. 6.2分析天平:感量0.1mg 6.3pH计精度为士00. 6.4磁力搅拌器;附加热功能
6.5恒温水浴锅:37 6.6秒表:每小时误差不超过5s
6.7分光光度计;吸光度540nm
6.8离心机:;离心力不低于为2000
试验步骤 7.1标准曲线绘制 吸取缓冲液(5.5)4.0ml,加人DNS试剂(5.6)5.0mL,沸水浴加热5nmin
用水冷却至室温,用水 定容至25ml,制成试剂空白溶液
分别吸取D甘露糖标准系列溶液(5.9)各2ml,加人至25mL刻度试管中(每个浓度做2个平 行),再分别加人2ml乙酸-乙酸钠缓冲液(5.5)和5mLDNS试剂(5.6),用手微振,沸水浴加热5min， 取出,迅速用水冷却至室温,再用水定容至25mL
以试剂空白溶液调零,在540nm处测定吸光度(A 值)
以D甘露糖浓度为丫轴、吸光度A值为X轴,绘制标准曲线,获得线性回归方程
每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线 7.2试样酶液的制备 7.2.1固态样品 固态试样应粉碎或充分碾碎,过0.25mm孔径筛
称取适量试样两份,精确至0,0001g,分别置于 200m锥形瓶中,加人100mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5)
摇床或磁力搅拌提取30min，上离心机 4000r/min离心5min,取上清液,上清液再用缓冲溶液(5.5)做二次稀释,使稀释后的待测酶液中B甘 露聚糖酶活力控制在0.04U/ml0.08U/mL之间
SigmaG0753是商品名,来源于角豆树种子的胚乳(槐豆胶),给出这一信息是为了给本标准的使用者一个相对 标准,如果其他产品能有相同的效果,则可使用等效产品
GB/36861一2018 7.2.2液态样品 移取适量试样,用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5)进行稀释、定容,稀释后的待测酶液中甘露聚糖酶 活力控制在0.04U/ml0.08U/ml之间
如果稀释后酶液的pH偏离5.5,应用乙酸溶液(5.3)或乙 酸钠溶液(5.4)调整校正至5.5,再用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(5.5)适当稀释并定容
7.3测定 7.3.1移取10.0mL待测酶液,置于具塞试管内.37C士0.2C水浴10nmin
7.3.2称取2g(精确至0.01g)甘露聚糖溶液(5.7),至25ml刻度试管中,37C士0.2C水浴10 mIn 加人5mLDNS试剂5.6),振摇3s,加人2mL经过37C土0.2C平衡的待测酶液,振摇3s. 7C士0.2C保温30nmin,沸水浴加热5min,取出,迅速用水冷却至室温,加水定容至25ml混匀
以 试剂空白溶液调零,用10mm比色皿,在540nm处测定样品空白溶液吸光度(A
) ,加人到25ml
刻度试管中,37C士0.2C平衡 称取2R(精确至0o甘露聚糖游被(G.7) 7.3.3 10 nmin,加人2mL经过适当稀释的酶液(已经过37C士0.2C平衡),振摇3、,37C士0.2C精确保温 30min,加人5mLDNs试剂(5.6),振荡混匀,沸水浴加热5min,取出,迅速用水冷却至室温,加水定容 至25ml混匀
以试剂空白溶液为空白对照,在波长540nm下,测定样品管中样液的吸光度(A),通 过线性回归方程计算甘露聚糖酶的活力
试验数据处理 试样稀释液中-甘露聚糖酶活力以X，表示,单位为酶活力单位每毫升(U/mL),按式(1)计算: A一A)×人十b Xp= -×1000 30×M 式中 -样品管的吸光度; 样品空白管的吸光度; A -标准曲线的斜率 标准曲线的截距; b D甘露糖的摩尔质量,单位为克每摩尔(g/mol)(M=180.2/mol); M 30 -酶解反应时间,单位为分(min); 1000 -单位换算系数
X，值应在0.04U/ml0.08U/mL之间
如果不在这个范围内,应重新选择酶液的稀释度,再进 行分析测定 试样B甘露聚糖酶的活力以X表示,单位为酶活力单位每克(U/g)或者酶活力单位每毫升 U/mL),按式(2)计算 X=Xn×" 式中: Xn -试样稀释液中甘露聚糖酶活力,单位为酶活力单位每毫升(U/mL); 试样的总稀释倍数
计算结果保留三位有效数字
精密度 在重复性条件下,两次独立副定结果绝对差值不超过其算术平均值的10%
饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定分光光度法GB/T36861-2018
饲料添加剂β-甘露聚糖酶是一种能够分解饲料中的β-甘露聚糖为低聚糖和单糖的酶类。在饲料生产过程中，β-甘露聚糖酶的添加可以提高饲料中β-甘露聚糖的降解率，增加动物对营养成分的吸收，从而提高养殖效益。
因此，对于饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的准确测定显得尤为重要。目前，常用的测定方法有多种，包括滴定法、比色法、荧光法、分光光度法等。本文介绍的是一种使用分光光度法测定饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的方法，该方法符合国家标准GB/T36861-2018。
实验步骤
1.制备样品：将待测样品加入适量的缓冲液中，混匀后放置在37℃恒温水浴槽中反应一段时间，使酶反应达到平衡。
2.取适量标准品和制备好的样品，加入适量底物溶液中，恒温反应一段时间。
3.加入止反剂终止反应，并用0.05mol/L NaOH调节至6.5-8.5之间，最后用0.1mol/L HCl进行标准化。
4.用分光光度计测定样品的吸光度值，计算出β-甘露聚糖酶活力。
结果与分析
经过实验测定，计算得出样品β-甘露聚糖酶活力为X单位/g。
在实验过程中应注意以下几点：
- 样品应充分反应，以保证测定结果的准确性；
- 底物和止反剂的加入量应控制在适宜范围内，避免过量使反应受到影响；
- 使用分光光度计时应注意校准仪器，避免误差。
结论
本文介绍了一种符合GB/T36861-2018标准的使用分光光度法测定饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的方法。该方法简便可靠，对于饲料生产中β-甘露聚糖酶活力的准确测定具有重要意义，可以为动物的生长和健康提供重要的保障。
