水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定

水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定

国家标准 GB/T19857一2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫 残留量的测定 Determinationofmalachitegreenandcrystalvioletresidues inaquaticproduct 2005-09-05实施 2005-09-05发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19857一2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫 残留量的测定 范围 lachit 本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿(leucomal itegreen)、结晶紫及其代 谢物隐色结晶紫(eucoerystalviolet)残留量的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱的测定方法 本标准适用于鲜活水产品及其制品中孔雀石绿及其代谢物隐色孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色 结晶紫残留量的检验 液相色谱-串联质谱法 2.1原理 试样中的残留物用乙睛-乙酸缓冲溶液提取,乙晴再次提取后,液液分配到二氯甲烧层,经中性氧 化铝和阳离子固相柱净化后用液相色谱-串联质谱法测定,内标法定量 2.2试剂和材料 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为重蒸馏水 2.2.1乙睛;液相色谱纯 2.2.2甲醇;液相色谱纯 2.2.3二氯甲熔 2.2.4无水乙酸铵 2.2.55mol/L.乙酸铵缓冲溶液;称取38.5g无水乙酸铵溶解于90mL水中,冰乙酸调pH到7.0,用 水定容至100ml 0.1nmol1乙酸铵缓冲溶液;称取7.71区无水乙酸铵溶解于100ml水中,冰乙酸调pH到4.5 2.2.6 5mmol/几乙酸铵缓冲溶液;称取0.385g无水乙酸铵溶解于1000mL水中,冰乙酸调p!到 m滤膜 冰乙酸 0.25g/mL盐酸羚胺溶液 10l.0ml儿对-甲苯碱酿游液，称取17.2《对-甲苯碱酿,用水游解并定容至100mL. 体积分数为2%的甲酸溶液 体积分数为5%的乙酸铵甲醇溶液量取5mL乙酸铵缓冲溶液(2.2.5)用甲醇定容至 2.2.12 100ml 2.2.13阳离子交换柱.MCX,60mg/3mL,使用前依次用3mL乙睛、3mL甲酸溶液(2.2.11)活化 2.2.14中性氧化铝柱;lg/'3mL使用前用5ml乙睛活化 15标准品;孔雀石绿(MG)隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(CV)、隐色结晶紫(LCV)、同位素内标 爪代孔雀石绿(D-MG)同位素内标爪代隐色孔雀石绿(D,-LMG),纯度大于98% 2.2.16标准储备溶液;准确称取适量的孔雀石绿,隐色孔雀石绿结晶紫,隐色结晶紫,尔代孔雀石绿、 尔代隐色孔雀石绿标准品,用乙睛分别配制成1004g/ /mL的标准储备液 2.2.17混合标准储备溶液(14g/mL):分别准确吸取1.00ml.孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐 色结晶紫的标准储备溶液(2.2.16)至100ml.容量瓶中,用乙晴稀释至刻度,lml该溶液分别含1g 的孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿和隐色结晶紫 一18C避光保存
GB/T19857一2005 2.2.18混合标准储备溶液(100ng/mL):用乙睛稀释混合标准储备溶液(2.2.17),配制成每毫升含孔 雀石绿,隐色孔雀石绿,结晶紫,隐色结晶紫均为100ng的混合标准储备溶液 一18C避光保存 2.2.19混合内标标准溶液;用乙晴稀释标准溶液(2.2.16),配制成每毫升含尔代孔雀石绿和尔代隐色 孔雀石绿各100ng的内标混合溶液 一18C避光保存 2.2.20混合标准工作溶液;根据需要,临用时吸取一定量的混合标准储备溶液(2.2.l8)和混合内标标 准溶液(2.2.19),用乙睛+5mmol/L乙酸铵溶液(11)稀释配制适当浓度的混合标准工作液,每毫升 该混合标准工作溶液含有尔代孔雀石绿和尔代隐色孔雀石绿各2ng 2.3仪器和设备 2.3.1高效液相色谱-串联质谱联用仪;配有电喷雾(EsD)离子源 2.3.2匀浆机 2.3.3离心机oor r/min 2.3.4超声波水浴 2.3.5能涡振荡器 2.3. k浓缩瓶,5m. 2.3.7因相苹取装置 2.3.8旋转蒸发仪. 样品制备 鲜活水产品 提取 称取5.00g已捣碎样品于50mL离心管中,加人200L混合内标标准溶液(2.2.19),加人11m 乙晴,超声波振荡提取2min,8000r/min匀浆提取30s,4000r/min离心5min,上清液转移至25ml 比色管中;另取一50mL离心管加人11mL乙睛,洗涤匀浆刀头10s,洗涤液移人前一离心管中,用玻 棒捣碎离心管中的沉淀,旋涡混匀器上振荡30s,超声波振荡5min,4000r/nmin离心5nmin,上清液合 并至25mL比色管中,用乙晴定容至25.0mL,摇匀备用 2.4.1.2净化 移取5.00ml样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱(2.2.14)上,用KD浓缩瓶接收流出液,4ml 乙晴洗涤中性氧化铝柱,收集全部流出液,45C旋转蒸发至约1nml,残液用乙定容至1.00mL,超声 波振荡5min，加人1.0mL.5mmol/1.乙酸铵,超声波振荡1nmin,样液经0.2m滤膜过滤后供液相色 谱-串联质谱测定 2 .4.2加工水产品 2.4.2.1提取 称取5.00只已捣碎样品于100ml离心管中,加人200L混合内标标准溶液(2.2.19),依次加人 lml盐酸羚胺(2.2.9)、2ml，对-甲苯磺酸(2.2.10)、2ml乙酸铵缓冲溶液(2.2.6)和40mL乙睛,匀 浆2min(10000r/min),离心3tmin(3000r/min),将上清液转移到250ml分液漏斗中,用20ml乙 晴重复提取残渣一次,合并上清液 于分液漏斗中加人30mL二氯甲炕,35mL.水,振摇2min,静置分 层,收集下层有机层于150mL梨形瓶中,再用20mL二氧甲烧萃取一次,合并二氯甲烧层,45C旋转蒸 发近干 4.2.2净化 2. 将中性氧化铝柱(2.2.14)串接在阳离子交换柱(2.2.13)上方 用6ml乙睛分三次(每次2mL). 用旋涡震荡器涡旋溶解上述提取物,并依次过柱,控制阳离子交换柱流速不超过0.6mL/min,再用 2 m.乙睛淋洗中性氧化铝柱后,弃去中性氧化铝柱 依次用3mL体积分数为2%的甲酸溶液、3mL乙 猜淋洗阳离子交换柱,弃去流出液 用4mL体积分数为5%的乙酸铵甲醇溶液(2.2.12)洗脱,洗脱流 速为1 nmL/min,用10mL刻度试管收集洗脱液,用水定容至10.0mL,样液经0.2Am滤膜过滤后供液
GB/T19857一2005 相色谱-串联质谱测定 2.5测定 2.5.1液相色谱-串联质谱条件 色谱柱:C柱,50mm×2.1mm(内径),粒度3pm; a b)流动相;乙晴十5mmol/L.乙酸铵=75十25(体积比); 流速:0.2mL/min 柱温:35C; 进样量;10L 离子源;电喷雾EsI,正离子 扫描方式;多反应监测MRM: g 雾化气、窗帘气、辅助加热气,碰撞气均为高纯氮气,使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏 h 度达到检测要求 喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度; 监测离子对;孔雀石绿m/z329/313(定量离子),329/208;隐色孔雀石绿m/z331/316(定量离 子,331/239;结晶紫m/z372/356(定量离子、372/251;隐色结晶紫m/z374/359定量离 子),374/238;爪代孔雀石绿m/z334/318(定量离子);爪代隐色孔雀石绿m/z337/322(定量 离子 2.5.2液相色谱-串联质谱测定 按照2.5.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和混合标准工作溶液(2.2.20),以色谱峰面积按内标 法定量,孔雀石绿和结晶紫以冗代孔雀石绿为内标物计算,隐色孔雀石绿和隐色结晶紫以尔代隐色孔雀 石绿为内标物计算 在上述色谱条件下孔雀石绿,爪代孔雀石绿、结晶紫,尔代隐色孔雀石绿、隐色孔雀 石绿和隐色结晶紫的参考保留时间分别为2.27nmin、2.30nmin、2.88min、5.21nmin、5.31nmin、 61 5. nmin,标准溶液的离子流图参见附录A中图A.1 2.5.3液相色谱-串联质谱确证 按照2.5.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液,分别计算样品和标准工作溶液中非 定量离子对与定量离子对色谱峰面积的比值,仅当两者数值的相对偏差小于25%时方可确定两者为同 -物质 2.6空白试验 除不加试样外,均按2.4,2.5步骤进行 2.7结果计算和表述 按式(1)计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量 计算结果需扣除空 白值 x=xxA~A c×A×A.×m 式中 样品中待渊组分残留量,单位为微克每千克(/g/ke) -孔雀石绿,隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫标准工作帝液的浓度,单位为微克每升(as/" I); -标准工作游液中内标物的浓度,单位为做克每升(gg/L) 样液中内标物的浓度,单位为微克每升(ag g/L); 孔雀石绿、隐色孔雀石绿,结晶紫或隐色结晶紫标淮工作溶液的峰面积 样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结品紫或隐色结晶紫的蜂面积 标准工作溶液中内标物的峰面积; A
GB/T19857一2005 样液中内标物的峰面积; V样品定容体积,单位为毫升(mL); -样品称样量,单位为克(g). M 本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量之和,以孔雀 石绿表示 本方法结晶紫的残留量测定结果系指结晶紫和它的代谢物隐色结晶紫残留量之和,以结晶紫表示 2.8方法检测限 本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为0.54g/kg 高效液相色谐法 3.1原理 试样中的残留物用乙睛-乙酸盐缓冲混合液提取.乙睛再次提取后,液液分配到二氧甲烧层并浓缩 经酸性氧化铝柱净化后,高效液相色谱-二氧化铅柱后衍生测定,外标法定量 3.2试剂和材料 除另有规定外,试剂均为分析纯,水为重蒸水 .2.1乙朋.液相色请纯 3.2.2二策甲炕 3.2.3甲醉;液相色谐纯 乙酸盐缓冲液;溶解去.95g无水乙酸钠及0.95【对-甲苯碱酸于950ml.水中,用冰乙酸调节 3.2.4 溶液p到4.5，最后用水稀释到1L 3.2.520%盐酸羚胺溶液 1.0molL对甲苯碱酸.称取17.2【对-甲苯碱酸,并用水稀释至100ml 3.2.6 3.2.750mmol/L.乙酸铵缓冲溶液;称取3.85g无水乙酸铵溶解于1000nml水中,冰乙酸调pH到 4.5 3.2.8二甘醇 3.2.9酸性氧化铝:80目120目 3.2. 0 二氧化铅 3.2. 11 硅藻土545;色谱层析级 3.2. 12 标准品:孔雀石绿(MG)、隐色孔雀石绿(LMG)、结晶紫(cV)、隐色结晶紫(ICV),纯度大 于98% 3.2.13标准溶液:准确称取适量的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫,用乙睛分别配制成 100ug/mL的标准储备液,再用乙晴稀释配制14g/m的标准溶液 一18C避光保存 3.2. 14 混合标准工作溶液;用乙晴稀释标准溶液(3.2.13),配制成每毫升含孔雀石绿、隐色孔雀石绿、 结品紫、隐色结晶紫均为20ng的混合标准溶液 一18C避光保存 3.3仪器和设备 3.3.1高效液相色谱仪;配有紫外-可见光检测器 3.3.2匀浆机 3.3.3离心机:4000r/min. 3. .3.4固相萃取装置 3.3. 25%二氧化铅氧化柱;不锈钢预柱管[5cmX4mm(内径],两端附2Am过滤板,抽真空下,填 装含有25%二氧化铅的硅藻土,添加数滴甲醇压实,旋紧 临用前用甲醇冲洗 并将二氧化铅氧化柱 连接在紫外-可见光检测器与液相色谱柱之间 3.3.6酸性氧化铝柱lg/3mL,使用前用5mL乙睛活化
GB/T19857一2005 3.4样品制备 3.4.1提取 称取5.00g样品于50ml离心管内,加人1.5ml20%的盐酸痉胺溶液、2.5ml.1.0mol/L.的对 甲苯碱酸溶液、5.0mL乙酸盐缓冲溶液,用匀浆机以10000r/min的速度均质30s,加人10mL乙晴 3000r/min离心10min 把上清液转移至装有 刚烈震摇.30 加人5区酸性氧化钳,再次震荡30， 0ml 水和2ml二甘醇的100ml离心管中 然后在50ml离心管中加人10ml乙晴,重复上述操 作,合并乙睛层 3.4.2净化 在离心管中加人15ml二氯甲婉,振荡10s，3000r/min离心10min，将二氯甲婉层转移至 00mL的梨形瓶中,再用5mL乙晴、10 二氧甲烧重复上述操作一次,合并二氯甲婉层于100mL m 梨形瓶中 45C旋转蒸发至约1 ,用2.5nml乙晴溶解残渣 ml 将酸性氧化铝柱(3.3.6)安装在固相萃取装置上,将梨形瓶中的溶液转移到柱上,再用乙睛洗涤瓶 两次,每次2.5mL，把洗涤液依次通过柱,控制流速不超过0.6mL/nmin n,收集全部流出液,45C旋转燕 发至近干,残液准确用0.5mL乙睛溶解,过0.45pm滤膜,滤液供液相色谱测定 3.5测定 3.5.1液相色谱条件 色谱柱:C柱,250mm×4.6mm(内径)，粒度5m,在C色谱柱和检测器之间连接25%二 a 氧化铅氧化柱 b) 流动相;乙晴和乙酸铵缓冲溶液(3.2.7),梯度洗脱参数见表1; 流速:l.0mL/min ce 柱温:室温; 检测波长;618nm(孔雀石绿),588nm(结晶紫); e 进样量:50l 表1流动相梯度表 时间/min 乙睛(% 乙酸铵缓冲溶液/(% 60 0 80 20 15 80 20 95 15.1 17 95 17. 60 40 20 60 0 3.5.2液相色谱测定 根据样液中被测孔雀石绿,隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫含量情况,选定峰高相近的标准工 作溶液 标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫响应值均应在仪器检测 线性范围内 对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定 在上述色谱条件下,孔雀石绿,结晶紫、,脸 色孔雀石绿和隐色结晶紫的保留时间约为6.10min、7.88min、17.77min,18.22min,标准品色谐图参 见附录A中图A.2 3.6空白试验 除不加试样外,均按3.4,3.5步骤进行 3. 结果计算和表述 按式(2)计算样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量 计算结果需扣除空
GB/T19857一2005 白值 x=Y4x" A×mn 式中 样品中待测组分残留量,单位为毫克每千克(mg/kp); 待测组分标准工作液的浓度,单位为微克每毫升(ug/mL) 样品中待测组分的峰面积; 待测组分标准工作液的峰面积; 样液最终定容体积,单位为毫升(mL); 最终样液所代表的试样量,单位为克(g) 本方法孔雀石绿的残留量测定结果系指孔雀石绿和它的代谢物隐色孔雀石绿残留量之和,以孔雀 石绿表示 本方法结晶紫的残留量测定结果系指结晶紫和它的代谢物隐色结晶紫残留量之和,以结晶紫表示 3.8方法检测限 本方法孔雀石绿,隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为2.04g/lkg
GB/T19857?2005 ? A ?? ????г? m/z331/316 5.31 ??? 100- % 2.29 m/z374/359 ?? 1003 % m/z329/313 ?? 100 2.88 m/z372/356 100? mm/z337/322 100 ???? m/z334/318 ?? 00 Time 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6,50 7.00 ?A.1??????????????? ?????? ? ?? AU ?? ??? /min 0.00 5.00 10.00 15.00 ?A.2????????,???????