国家标准 GB/T36810一2018 草莓枯萎病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofFusariunoxysporwmSchleeht.r.sp F'ragariaeWinks&wiliams 2018-09-17发布 2019-04-01实施国家市场监督管理总局发布币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36810一2018 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位:天津出人境检验检疫局本标准主要起草人:刘跃庭、罗加凤、牛春敬、崔铁军、廖芳
GB/36810?2018 ??? Χ ?涨???? ???мЯв???? ???? ?? ?:F4sar rium0rysporum(Schlecht.f. ..sp.frugariaewinks&.wiliams ?:fn usariumwiltofstrawberry λ;??(Fungi),?(Ascomycota),?(Pezizomycotina). ?(Sordariomycetes),?(Hypoereales),??(Ne ,(F4sarium). ectriaceae ?;?? ???μ?A ? ????,??PCR?????? ? ???? 4.1? ?,?,??(?20C)PCR,? ?????? m????,?? 4.2?? ?(EDTA)??(SDs),TrisHCl,??70% ????KFofraF/FofraRTa??????? ???DNA,,?ù,ù,0.5%NaCIO). (PSA)(PDA)?μ?B ? 5.1?? ??,??С???,???????,??
GB/T36810一2018 变黄绿或黄色,纵切叶柄,果梗和根部,检查维管束是否变色(参见附录A中图A.l),对变色的可疑材料进行分离培养检查植株有无附着土壤,若发现土壤,对土壤进行分离培养 5.2病原菌的分离培养 5.2.1种苗中病原菌的分离培养 nmm5mm 变色的可疑材料用0,5%次氯酸钠表面消毒5min,再用灭菌水冲洗30min,剪成约3 小段置sA或PDA平板上,，25C,金光照下培养,培养48h后开始观泰饿落形态,大分生泄子,小分生袍子及厚垣抱子着生情况和形态特征 5.2.2土壤中病原菌的分离培养取2g土壤放人200mL灭菌水中,用磁力棒搅拌30min,使其充分混匀,悬浮液稀释10倍,取 0.5mL土壤稀释液涂抹于PSA或PDA平板上,每处理涂抹5个培养皿,25C,全光照下培养,培养 48h后开始观察菌落形态,大分生抱子、小分生弛子及厚垣袍子着生情况和形态特征 5.3分子生物学鉴定 5.3.1引物采用特异性引物FofraF/FofraR进行扩增,目标片段为239bp FofraF:5'-CAGACTGGGGTGCTTAAAGTT-3 FofraR:5'-AACCGCTAGGGTCGTAACAAA-3 5.3.2DNA提取可疑菌株在PsA或PDA上生长7d左有,取菌丝提取DNA(参见附录c) ),也可用植物组织及真菌基因组提取试剂盒提取DNA,提取步骤详见使用说明 5.3.3PCR反应 PCR反应体系总体积25AL,包含;EmeraldAmpMaxPCRMasterMix2×PremixCode RR320)12.5AL;ddH,O9.0L;引物各1.04L;DNA模板1.54L30ng/AL) PCR反应程序;94C 预变性2min;94C变性1min,63复性1min,72C延伸1min,30个循环;727" ,保存于4C 7min 扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中电泳,EB染色后凝胶成像,分析是否出现目标片段大小的单带 o 鉴定特征 6.1培养性状在PsA培养基平板上菌落突起,白色致密呈絮状,高3mm~5mm,菌落正面有同心轮纹,背面菌落呈紫色在PDA培养基上,2d后出现白色菌丝,3d后开始产抱,7d后菌落呈圆形,边缘白色,向内逐渐变成粉红色,菌丝细绒状,蓬松,背面菌落呈紫色(参见附录D中图D.1) 6.2形态特征菌丝有隔,小型分生抱子居多,着生于单生瓶梗上,常在瓶梗顶端处聚成假头状,无色,单抱,长椭圆形,椭圆形或卵形,无或有1个分隔,大小为(3.9m13.0m)x(2.6m5.24m);大型分生袍子较少,镰刀形或新月形,有脚胞，1个~4个分隔,多为3隔,大小为(13.04m36.4m)×2.64m~
GB/36810一2018 5.2 113.00 2Mm) 厚垣抱子间生或顶生,球形,大小为(5.2Mm Mm)×(5.2Mm13.0 0Am)(参见附录D 中图D.2) 草莓枯萎病菌与其近似种的区别参见附录E 6.3CR特异性产物引物FofraF/FofraR特异性PCR扩增片段为239bp 结果判定病原菌培养性状符合6.1中描述,形态特征符合6.2中描述,PCR特异性扩增片段符合6.3中描述可鉴定为草莓枯萎病菌样品保存 8.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存对检出草莓枯萎病菌的样品应保存于4C冰箱中,以备复核该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 8.2菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为草莓枯萎病菌的菌株,应妥善保存将菌株接种于PSA培养基斜面上,存活后置于4C8C黑暗条件下保存,定期(3个月)转接,以防止病菌死亡,至少保存6个月,必要时用病菌分生袍子作冻干菌种保存保存期满后高压灭活处理 8.3结果记录与资料保存实验记录包括样品的来源、种类,时间,实验的时间,地点、方法和结果等,并有实验人员和审核人员签字
GB/T36810一2018 附录 A 资料性附录) 草莓枯萎病菌的其他信息寄主范围 A.1 草莓属FragariaL A.2地理分布欧洲波兰、西班牙美洲:美国非洲:埃及亚洲:日本,韩国,的四川河北,东北三省、上海; 大洋洲:澳大利亚症状特征草莓枯萎病菌主要侵害根部,表现在地上部分,从开花及收获期发生,心叶变黄绿或黄色卷曲,小叶变狭小或呈船形,多数变硬叶色变黄,表面粗糙无光泽,随后叶缘变褐,向内萎蔫,直至枯死病菌引起系统症状,导致病株根系坏死,生长不良,矮小衰弱,叶无光泽,下部叶片变紫红色萎蔼,叶柄和果梗的维管束变褐色或黑褐色,不长新根,潮湿时近地面基部长出紫红色的分生袍子,最后全株枯死,轻病株则结果减少,果实不能正常膨大,品质低劣草莓枯萎病菌症状如图A.1所示注;引自HoseeinGolar,Austalhia 图A.1草莓枯萎病菌症状
GB/36810一2018 A.4传播途径草莓枯萎病菌是尖袍镰刀菌草莓专化型,不能侵害其他作物,只能通过带病种苗和病土传播病害 -旦传人,便在采苗床、假植床和大田循环侵染,扩大蔓延,难以除治土壤传染主要以厚垣抱子作传染源,而且病菌无论在旱地或水田都能长期生存,并且在20cm的土层内密度最高如果翌年在带有病菌的地里育苗,病菌先侵染母株,然后通过旬匐茎、导管再传给子苗,因为苗期症状不明显,而被当作健苗来移栽一般靠近母株的苗子发病早,带病率高,发病也严重病原菌主要靠病根,病叶通过土壤和水进行扩散传播酸性潮湿的土壤、夏季持续高温多雨和偏酸的灌溉水均能导致草莓枯萎病菌的严重发生,冬春季低温干燥时该病发生较轻
GB/T36810一2018 附录 B 资料性附录) 培养基的制备 B.1马铃薯蔗糖培养基(sA) 马铃薯去皮后洗净,切成小块,称取200g,蒸馏水中煮30min,用4层纱布过滤,加人10g一20g 蔗糖、17g20其琼脂加热使之完全溶解,蒸僧水定容至1000mL,121C高压灭菌15nmin 为抑制细菌生长,高压灭菌后在50C一60C时,每100mL培养基加人青霉素5mg,链霉素3mg B.2马铃薯葡萄糖培养基(PDA 马铃薯去皮后洗净,切成小块,称取200g,蒸馏水中煮30min,用4层纱布过滤,加人10g一20g 葡萄糖、17g一20g琼脂,加热使之完全溶解,蒸僧水定容至1000mL,121C高压灭菌15min 为抑制细菌生长,高压灭菌后在50C60C时,每100mL培养基加人青霉素5mg,链霉素3mg
GB/36810一2018 录附 C 资料性附录 DNA提取方法 DNA提取步骤如下挑取菌丝约0.1g,用灭菌滤纸吸干水分,放人1.5mL离心管中,加液氮冷冻,用塑料杵磨碎菌 a 丝,待用 b 离心管中加人400l500LCTAB缓冲液和0.1lg蛋白酶K,混匀,65C水浴1h,l4000片离心5min,保留上清液取上清液,加500AL的Tris饱和盼;三氯甲烧:异戊醇(25:24:1)混匀,14000片离心 min 取上清液于1.5m离心管中,加500L三氯甲烧:异戊醇(24:1),轻摇混匀,14000尽离心 5min 取上清液,加人1mL异丙醇混匀,一70C下放置1h,或一20过夜;13000片离心101 min，可见DNA沉淀弃去上清液,冷70%乙醇洗DNA沉淀2次,室温干燥;用30L50LTris-EDTA缓冲液溶 fD 解DNA
GB/T36810一2018 附录 D 资料性附录) 草莓枯萎病菌的培养性状和形态特征 PDA培养基上草莓枯萎病菌菌落形态如图D.1所示说明 PDA上菌落正面观; 培养基底部菌落产生紫色色素图D.1PDA培养基上草莓枯萎病菌菌落形态病菌形态特征如图D.2所示 10m 说明: 单出瓶状分生弛子梗(标尺=254m,引自HosseinGiolzar,Australia); A B 小型分生袍子; 厚垣袍子; 大型分生袍子 D 图D.2病菌形态特征
GB/36810一2018 附录 E 资料性附录草莓枯萎病菌与草莓上其近似种的区别草莓枯萎病菌与草莓上其近似种的区别见表E.1 表E.1草莓枯萎病菌与草莓上其近似种的区别病原菌 Fusariumo.rysporumf.sp.frugariae Fusariumegiseti Fusariumsambciumu 主要侵害根部心叶变黄绿或黄色卷曲,小叶变狭小或呈船形,多数变硬叶色变黄,表面粗糙无光泽,随后叶缘变褐,向内萎蔫,直至枯死病菌引起系统症状,导致病株根系坏死,生长不草莓根腐,病株新出叶变小,深症状特征良,矮小衰弱,叶无光泽，为害果实,引起烂果绿色,根部变褐腐败,不长新根紫红色萎,叶柄和果梗的维管束变褐色或黑褐色,潮湿时近地面基部长出紫红色的分生袍子,最后全株枯死轻病株则结果减少,果实不能正常膨大,品质低劣 SA塔养基平板上气生菌丝百 PSA培养基平板上菌落突起,白色致色至炒米黄色,间有椰壳棕色的密呈絮状,高一5mm,菌落正面PpsA培养基平板上菌丝绒状，粘抱团,基物表面略显棕色，基 3mm 有同心轮纹,背面菌落呈紫色白色至浅驼色基物表面淡粉至物不变色培养性状 PDA培养基上,2d后出现白色菌丝褐色,基物不变色 PDA培养基平板上菌丝稀疏， 3d后开始产抱,7d后菌落呈圆形，PDA培养基平板上,气生菌丝颜色为谈橘红色,菌落中央产生边缘白色,向内逐渐变成粉红色,菌丝米黄色,比较疏松,棉絮状大量的橘红色分生抱子座,随着细绒状,蓬松,背面菌落呈紫色菌落的扩展,PDA培养基颜色逐渐变为淡橘红色纺锤形或镰刀形,顶端细胞逐通常3个~5个隔膜,多为3个较少,镰刀形或新月形,有脚胞,1个渐的均匀狭细,袍子较弯曲， ,中隔膜,顶细胞乳突状非常明显 4个隔膜，多为3个隔膜，大小为部显著膨大,基部有明显的脚鸟嘴状或渐尖,大小为(16.6mn~ 大分生袍子 ×2.6 m胞,2个一6个隔膜,多为3个- 13.0闪m一36.4m) 42.6Hm)×(2.5m一4.00HAm). 5.2Hm 4个隔膜,大小为25.64m 分生袍子座的产抱梗分支或不 37.24m)×(3.64m5.0m 分支,单瓶梗多,着生于单生瓶梗上,常在瓶梗顶端处聚成假头状,无色,单袍,长椭圆形，少,椭圆形或长矩圆形,分生袍偶尔产生，椭圆形,0个~1个小分生袍子椭圆形或卵形,0个1个隔膜,大小为子梗短梗形隔膜 3.94m~13.01Am)X(2.64m一5,2m 无,也有文献报道培养6周间生或顶生,球形,大小为(5.2m 球形,表面不光滑,多个在菌丝厚垣袍子 7周后产生,表面光滑,近无色，中串生 3.0pm) )×(5.2m~13,0从m 串生或聚生
GB/T36810一2018 考文献参 [1]郝保春.草莓病虫害防治彩色图谱.北京:农业出版社,1999. [2]郝保春草莓生产技术大全.北京;农业出版社,2000. [3]马宝红,甄文超,曹克强,等VAM真菌对草莓促生,防草莓黄萎病效应初探.河北农业大学学报,2004,27(4):71-73. [[4]曾富春,黄云,赵艳琴,等.草莓枯萎病菌的生物学特性.四川农业大学学报.2006,26(4) 156-160. [5]曾富春.草莓枯萎病菌病原鉴定、生物学特性、病害循环及防治研究.四川农业大学硕士学位论文.2006. [[6]吴宝荣.草莓枯萎病菌的识别与防洽技术.现代园艺.2006,4:28-29. [7]叶琪明,李振,包环玉,等草莓病害调查初报江西果树.1998.(3):29-32. [8]邱强,胡森，王志田.原色西瓜、甜瓜、草莓病虫与营养诊断图谱.北京:科学技术出版社， 1996:89-90. [9]肖杰文再俊祥,杨占臣,等.美国大豆中镰刀菌的分离鉴定.植物检疫.2011,25(1):2932 [10]李金花，王蒂,柴兆祥,等.甘肃省马铃薯镰刀菌干腐病优势病原的分离鉴定植物病理学报 201l,41(5);456-463. 11]张建树,程子林保护地草莓主要病害与防治.天津农林科技.1995(4):15-18 [[12]CABlInternational.CropProtectionCompendium,2007Edition.,walingford,UK [13]Helgard,I1.,Nirenberg.MorphologicaldifferentiationofFusariumsambuciumuFuchelsen .& sustricto,F.torulosuBerk. Curt.)Nirenbergcomb.nov.andF.zenenatumNirenbergsp.nov.My copathology,1995(129):131-141 [14]Dekmann,M.,Frison,E.A.,Putter,T.1994.FAo/IPGRItechnicalguideinesforthesafe nmovementofsmalfruitgerplasm.FoodandAgrieultureOrganizationoftheUnitedNations,Rome nternationalPlantGeneticResourcesInstitute,Rome. [15]Suga，H.，Hirayama. Morishima，M.，etal.2013，DevelopmentofPCRprimersto identifyFusariuorysporumf.sp.fragariae.PlantDis 97619-625 0

草莓枯萎病菌检疫鉴定方法GB/T36810-2018

1. 草莓枯萎病菌简介

草莓枯萎病是由真菌Verticillium dahliae Kleb.引起的，能够感染多种作物，如马铃薯、烟草等。在草莓上的感染会导致根系受损，导致植株死亡。草莓枯萎病在全球范围内都有分布，尤其在欧洲和北美地区常见。

2. GB/T36810-2018标准介绍

GB/T36810-2018标准规定了草莓枯萎病菌的检测方法，包括生物学检测和分子生物学检测两种方法。其中生物学检测主要用于初步筛查，而分子生物学检测则更为精确。

3. 生物学检测方法

生物学检测方法主要是通过接种法和分离培养法进行，具体步骤如下：

1. 采集样本：从草莓根部和茎段中采集样本。
2. 接种法：将采集的样本接种到含有枯萎病菌的培养基上，观察是否有生长。
3. 分离培养法：从感染植株的根系和茎段中取出菌丝，接种到培养基上进行培养。

4. 分子生物学检测方法

分子生物学检测方法主要是通过PCR技术进行，具体步骤如下：

1. DNA提取：从采集的样本中提取DNA。
2. PCR扩增：使用草莓枯萎病菌特异性引物进行PCR扩增。
3. 凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳检测，观察是否存在目的片段。

5. 结论

GB/T36810-2018标准规定了草莓枯萎病菌检测的方法和技术要求，对于保障草莓幼苗和种苗的质量具有重要意义。在实际操作中，应根据具体情况选择合适的检测方法，以确保检测结果的准确性。