胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法

胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T29581一2013 胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofXanthomonasaxonopodispv.betlieola Pateletal.Vauterineal. 2013-07-19发布 2013-12-06实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T29581一2013 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标淮起草单位海南出人境检验检疫局、深圳出人境检验检疫 局、广东出人境检验检疫局 本标淮主要起草人;刘福秀,冯黎霞,龙海、李伟东、波杏园、韩玉春、周先超
GB/T29581一2013 胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了胡椒叶斑病菌(Xanthomonasa.romopodispwv.betlicola)的检疫和鉴定方法 本标准适用于植物苗木等繁殖材料及组织中胡椒叶斑病菌的检疫和鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 胡椒叶斑病菌基本信息 中文名;胡椒叶斑病菌胡椒细菌性叶斑病菌;地毯草黄单胞杆菌萎叶致病变种 学名:Xanthomonasaronopodispv.betlicola(Patel，Kulkarni&.Dhande1951Vauterin，Hoste. Kersters Swings1995 异名:Xanthomonascumestrispv.bellicola(Patel，Kulkarmi&Dhande1951)Dye1978 病害英文名;bacterialleafspotofpepper、pepperbacterialleafspot 属原核生物界Proca1 变形细菌门Proteobacteria、7-变形细菌纲Gammaproteobacteria,黄单 ryoteS、 胞菌目Xanthomonadales、黄单胞菌科Xanthommonadaceae、黄单胞菌属Xanthoonas、地毯草黄单胞杆 polis 菌Xanthoonasa.zonof 胡椒叶斑病菌的其他信息参见附录A 方法原理 根据胡椒叶斑病菌的寄主范围、培养性状、生理生化特性和所致病害的症状特点,采用病原菌的分 离、病菌培养性状观察,生理生化特性检测以及致病性测定等方法进行检测和鉴定 试剂与培养基 5.1试剂 无菌水,琼脂、酵母提取物、蛋白陈、葡萄糖、营养琼脂,牛肉膏,氯化钠纳、氢氧化钠 果糖、木糖、半乳糖、乳糖,麦芽糖、甘露醇,海藻糖、甘油、水杨苷,蔗糖、山梨糖,鼠李糖、棉子糖、肌 醉、草酸钠,8-羚基丁酸钠,琥珀酸纳,苹果酸、乳酸销、柠檬酸纳,酒石酸钠,DL-精氨酸明胶、石葛牛奶 5.2培养基 病菌分离采用NGA培养基(见附录B),病菌增殖采用营养琼脂培养基见附录B)
GB/T29581一2013 仪器和用具 天平,搅拌器、冰箱(4C士2C;一80),无菌(新)塑料封口袋、脱脂棉、石棉铁丝网、高压灭菌锅、 培养箱(29C士1C;或其他可以控制温度的暗室,无菌昆虫针,紫外灯,小型离心机、酸度计(或精密 pH试纸)、超净工作台等 检测与鉴定 7.1 现场检疫 7.1.1感官检查 仔细检查,观察典型症状或可疑症状(参见附录A) 感病组织表面可能有菌脓 7.1.2样品抽取 发现可疑植株,切取受害部位或将整棵植株取回实验室检验 7.2室内检测与鉴定 7.2.1病原菌分离 取小块病组织用无菌水冲洗后放人0.5ml一2.0ml无菌水中,观察是否有细菌溢出 如果有喷 菌现象,则用接种环挑取喷出的菌液,在NGA培养基(参见附录B)上划线分离 如没有喷菌现象,则 用灭菌玻棒将病组织研碎,在室温下浸泡15min一20min,用接种环挑取组织液在NGA培养基上划线 分离 看不到症状的情况下,用无菌水洗涤病组织(病组织为叶片时,洗涤量应在10片以上),洗涤液离 心浓缩后做适当稀释,在NGA培养基上划线分离 划线细菌在28C30C下黑暗培养 至少设2个 重复 3d后即可观察所产生的菌落 如果发现可疑的菌落应该及时使用NGA培养基进一步纯化培 养观察,并进行后续试验 7.2.2菌落形态观察 配制表1所列9种培养基,并按表1所列培养条件培养待检菌株,其中1是必需的,29可选 表1胡椒叶斑病菌在不同培养基上的培养性状 序号 培养基 培养条件 典型培养性状 营养琼脂 28C一30C下培养7d 菌落圆形,黄色,有光泽,全缘,稍隆起,粘稠 下振荡塔 28C一30 牛肉膏膝培养液 培养液轻度浑浊,无液面生长,沉淀物不明显 养24h或静止培养7d 菌落圆形,直径1mm-2mm,表面光滑,闪光,边缘 牛肉膏琼脂平面 28C30C下培养7d完整,乳骼状,低度凸起，半透明或不透明,乳白带浅 黄色 28"30C下振荡培 酵母膏陈培养液 培养液轻度浑浊,无液面生长,沉淀物不明显 养24h或静止培养7d 28C30C下振荡培 牛肉膏陈酵母葡萄 培养液中度浑浊,液面生长环状,沉淀物少量 糖培养液 作 24h或静止培养7d
GB/T29581一2013 表1(续 序号 培养基 培养条件 典型培养性状 牛肉膏眸酵母葡萄 菌苔均为线状,快速生长,乳酪状,不粘稠,乳白带浅 2830下培养7d 糖琼脂斜面 黄色,培养基不变色 mm一5nmm， 菌落圆形,直径3" ,表面光滑,闪光,边缘 牛肉膏醉母葡萄 28C30 下培养7d完整,乳酪状,低度凸起,半透明或不透明,乳白带浅 糖琼脂平板 黄色 菌芹均为线状,中度生长,乳酪状,不粘稠,乳白带浅 牛肉膏琼脂斜面 28一30下培养7d 黄色,培养基不变色 菌苔均为线状,中度生长,乳骼状,不粘稠,乳白带浅 30c下培养7d 酵母膏陈琼脂斜面 28C~ 黄色,培养基不变色 发现典型菌落的结果判为阳性,同时记录可疑菌落数,并进行后续试验 如没有发现典型的菌落 结果判为阴性 7.2.3革兰氏染色 革兰氏染色按GB/T4789.28一2003中2.2的规定进行试验 观察革兰氏染色反应的试验结果和 菌体形态 胡根叶斑稍菌革兰民染色呈阴性反应 典型苗体短杆状,末端圆形,大小为(0.4pm一0.了am)x 1.0um一2.4um),单个或成双排列,有3一5个的短链 无芽抱,无荚膜,有运动性,鞭毛为单根极生 革兰氏染色呈阴性反应,且观察到菌体典型形态的结果判为阳性,并进行后续试验 如革兰氏染色 反应呈阳性,或革兰氏染色反应呈阴性但没有观察到菌体典型形态,结果判为阴性 7.2.4生理生化特性测定 将上述分离的等检细菌用微量生化反应管进行生理生化特性测定 以X.a.rooodispv.betlicola 阳性菌株做对照,每个测定项目设3个重复 生理生化特性测定结果与附录C结果一致判定为阳性， 并进行致病性测定 否则判为阴性 7.3致病性测定 7.3.1针刺接种 采用平板划线法在营养琼脂培养基平板上纯化刚分离的待测细菌,在28C30C温度下培养 2d4d,移出单个菌落后进一步扩大繁殖 取待测细菌在营养琼脂培养基上培养24h48h,用灭菌 的昆虫针蘸取菌落,在胡椒苗嫩叶背面进行刺伤接种(Pan-niyur系列品种或其他品种都行,国内主栽品 种都感病) 每个菌株接种3片叶 接种标准的阳性菌株作为阳性对照,同时接种非致病菌和无菌水作 为阴性对照 接种后的植株置放于人工气候箱,在28C30C温度下,先在100%相对湿度下保湿 24h48h,然后在80%左右的相对湿度下,每天在7000lx10000lx下光照培养16h,黑暗下培养 6 h 接种5d7d后,观察是否出现水溃状角形病斑,每天观察一次,接种后30d不表现症状的视为 不发病 试验重复3次 用喷雾法接种于胡椒或萎叶叶片上也能产能水溃状多角形病斑
GB/T29581一2013 7.3.2病菌再分离 按7.2.1的方法对7.3.1中发病的植株进行病菌再分离,能得到7.2.2描述的纯培养判为阳性,否则 判为阴性 结果评定 没有发现典型的菌落,即菌落形态观察结果为阴性,判定为未检出胡椒叶斑病菌 革兰民染色呈阳性反应,即革兰民染色结果为阴性,判定为未检出胡椒叶斑病菌 生理生化特性测定结果与附录C结果不一致,即生理生化特性测定结果为阴性,判定为未检出胡 椒叶斑病菌 致病性测定试验中,接种后没有出现典型症状,或出现了典型症状但没有从接种后发病的组织中再 分离到与原接种物相同的病原菌,即致病性测定结果为阴性,判定为未检出胡椒叶斑病菌 菌落形态观察结果、革兰氏染色结果、生理生化特性测定结果和致病性测定结果四者均为阳性,判 定为检出胡椒叶斑病菌 样品和菌种保存 9.1样品保存 样品(包括健康和发病的植株或组织)拍照后均应制成干标本,经登记和签字后置于4C冰箱或阴 凉干燥、防虫防鼠处妥善保存 对鉴定为胡椒叶斑病菌的样品至少应保存6个月,以备复检、谈判和仲 裁,样品保存期满后,需经灭菌处理 9.2菌种保存 从样品中分离并鉴定为胡椒叶斑病菌的新鲜菌种在营养琼脂培养基上28C一30C培养24h后 用灭菌的昆虫针刮取细菌,放人装有无菌水的玻璃管中,封口后经登记和签字,置于室温或4C冰箱中 保存;或用真空干燥机制成冻干粉置于一20C以下低温冰箱保存 对欲废弃的菌种应做灭菌处理
GB/T29581一2013 附 录A 资料性附录 胡椒叶斑病菌的其他信息 A.1地理分布 柬埔寨、马来西亚,印度,孟加拉国、新西兰、巴西 A.2寄主植物 自然寄主;胡椒(Pibe”nigrumn、假茴(Pipersarmentosumn、海南菌(Pperhainanense)、萎叶 Piperbelle),假高粱(Sorghumhaleense),柠檬(Ci/rusimonum)等 接种寄主:菜豆(Phaseolusuulgaris)等 A.3症状特点 胡椒叶斑病菌(Xa Kanthomoasa.zoopodispv.,belicola)可侵染蔓、枝、叶,花序及果穗,但主要侵害 叶片 感病的叶片初为透明状的侵染点,随后扩大成多角形病斑,数天后,病斑中间呈褐色,外缘有黄晕 叶背病健交界处呈水溃状,雨天或湿度大时,常见有细菌溢脓,成一层明胶状薄膜 高温干旱期,病斑多 在植株下层叶边缘和叶尖发生 蔓枝一般在节上或伤口感染,初为紫褐色,随后干枯脱节 花序及果穗一般先从穗的末端感病,病部呈紫黑色、易脱落 A.4传播方式 该病菌主要通过伤口和自然孔口侵人寄主,侵染来源一是带病种苗，二是病株的残枝落叶,病菌在 病组织中可存活1个月以上，三是野生杂草 病菌靠雨水、露水、风昆虫及农事操作等近距离传播,带 病的种苗和病残体可作远距离的传插
GB/T29581一2013 B 附 录 规范性附录 培养基的配制 B.1淋病奈瑟菌培养基(NGA 淋病奈瑟菌培养基的配方见表B1 表B.1淋病奈瑟菌培养基的配方 成 配方比例 酵母提取物 3,0g 蛋白陈 5,0g 葡萄糖 2.5g 琼脂 16.0 g 1.0L 蒸僧水 按培养基配方比例依次准确地称取醉母提取物,蛋白陈,葡萄糖放人烧杯中 蛋白陈很易吸潮,在 mL蒸溜水,用搅拌器搅拌,待药品完全溶解后将称好的琼 称取时动作要迅速 在烧杯中加人约800 脂放人已溶解的药品溶液中,再加热溶化,在琼脂溶化的过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底 最后补足 水分至1000ml,再分装,103.43kPa(121C)灭菌15min B.2营养琼脂培养基 营养琼脂培养基的配方见表B.2 表B.2营养琼脂培养基的配方 成 分 配方比例 营养琼脂 41g 蒸水 000nl 称取41g营养琼脂干燥粉末加人1000mL冷蒸僧水中混合放置10min隔石棉铁丝网微火煮沸 使其完全溶解,分装,103.43kPa(121C)灭菌15min B.3牛肉膏陈培养基 牛肉膏陈培养基的配方见表B.3
GB/T29581一2013 表B.3牛肉膏膝培养基的配方 配方比例 成 分 牛肉膏 3,0g 蛋白眸 10.0g 氯化钠 5.0 琼脂配制固体培养基时加人 20.0g 蒸僧水 000mL pH值;7.07.2 准确称取各种成分一些不易称量的成分如牛肉膏,可用玻璃棒取出放硫酸纸上称量,然后连同硫 酸纸一起放人烧杯中,向烧杯内加人所需的水量,将牛肉膏用水洗下后,取出硫酸纸弃去,加热搅拌全溶 后稍放冷 用酸度计或精密pH试纸测定其pH值,并用10%氢氧化钠溶液调至所需pH值,必要时用 滤纸或脱脂棉过滤，一般比要求的pH高出0.2,因为高压蒸汽灭菌后,pH常降低 分装,103.43kPa 121C)灭菌15min. B.4牛肉膏陈酵母葡萄糖培养基 牛肉膏酵母葡萄糖培养基的配方见表B4 表B.4牛肉膏陈酵母葡萄糖培养基的配方 成 配方比例 牛肉膏 1,5g 蛋白陈 5,0g 3.5 氯化钠 5g 磷酸氢二钾 3.68 磷酸二氢钾 1.32" 琼脂配制固体培养基时加人 20.0g 蒸僧水 1000ml pH值:7.0一7.2 配制方法同B.3
GB/T29581一2013 c 附 录 资料性附录 胡椒叶斑病生理生化特性 C.1生理生化特性 胡椒叶斑病菌(Xant nthomonasa.ronopodispw.betlicola)耐盐度2%,初始生长pH值为5.68.5 可以在5C一37C士1C生长,不能在41C士1C生长 触酶反应呈阳性,氧化酶阴性 产氨,产硫化 氢,不产刚嗓,水解淀粉,明胶液化,不还原硝酸盐,M.R.和v.P反应阴性,石燕牛奶产碱和脉化(详见 表C.1) 表c.1胡椒叶斑病菌(x.axonopodispw.,betlieola)生理生化特性 初始生长pH值 鉴别性生长温度 液化硝酸 耐盐 氧化 硫化 淀粉 石蕊 氨 触酶 嗓 明胶盐还M.R.V.P 氛 |度/% 酶 水解 牛奶 37士41士 平板 原 最高 最低 5C w 5.6 8.5 b.p 注b 表示产喊,p表示陈化，十表示正反应，一表示负反应,w表示弱反应 碳、氮源利用情况 该菌能利用琥珀酸盐、苹果酸、乳酸盐、柠檬酸盐作唯一碳源,并呈碱性反应 不能利用草酸盐、酒 石酸盐、月-羚基丁酸盐和精氨酸作唯一碳源(详见表C.2). 表c.2对有机酸和氨基酸作为唯一碳源的利用特性 苹果酸 乳酸钠 酒石酸钠 草酸钠p-羚基丁酸纳 琥珀酸纳 柠檬酸钠 DL-精氨酸 注:十表示生长，一表示不生长 c3碳水化合物发酵 该菌葡萄糖氧化产酸不产气,果糖、木糖、半乳糖、乳糖,麦芽糖甘露醇、海藻糖和甘油产酸不产气
GB/I29581一2013 水杨苷不产酸不产气,但能生长 蔗糖山梨糖、鼠李糖、棉子糖、肌醇不产酸不产气(详见表C.3) 表c.3碳水化合物发酵特性 葡葡糖果糖木棚平乳期乳糖麦芽棚蔗甘露棚山梨棚海*鼠李糖棉子丽肌解 甘油 水杨苷 十和 注:A表示产酸，一表示不产酸不产气,十表示生长

胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法GB/T29581-2013

一、引言

胡椒是我国重要的香料作物之一，但叶斑病菌是胡椒的主要病原微生物之一，会严重影响胡椒的产量和质量。为了及时发现和防止胡椒叶斑病菌的传播，国家制定了胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法GB/T29581-2013。

二、检疫鉴定方法

GB/T29581-2013中规定了胡椒叶斑病菌的样品采集、检验方法和鉴别依据等内容。

1. 样品采集

胡椒叶斑病菌的样品采集应在病株发病期进行，选择不同部位的叶片、茎、果实等样品进行采集。样品应该存放在通风干燥处，并妥善保管。

2. 检验方法

胡椒叶斑病菌的检验方法主要包括外部形态特征检验和生物学检验两种方法。

（1）外部形态特征检验

通过对样品的外部形态特征进行观察和测量，鉴别出是否存在胡椒叶斑病菌及其危害程度。如发现有以下现象，则判断为存在胡椒叶斑病菌：

• 叶片出现圆形或不规则形的褐色斑点；
• 病斑边缘出现红色或紫色晕圈；
• 病斑逐渐扩大融合，导致叶片枯萎死亡。

（2）生物学检验

将携带胡椒叶斑病菌的样品进行生物学检验，观察并鉴别其菌丝形态、生长特性和产孢情况等，以确定是否存在胡椒叶斑病菌。

3. 鉴别依据

GB/T29581-2013中还规定了胡椒叶斑病菌的鉴别依据，主要包括其形态特征、生物学特性和分子生物学鉴别等。

三、结语

胡椒是我国重要的香料作物之一，但胡椒叶斑病菌会对其产量和质量造成严重影响。本文介绍了胡椒叶斑病菌检疫鉴定方法GB/T29581-2013”，希望对相关工作人员有所帮助。

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