转基因产品检测基因芯片检测方法

转基因产品检测基因芯片检测方法

国家标准 GB/T19495.6一2004 转基因产品检测基因芯片检测方法 Deteetionofgeneticallym0difiedorganismsandderivedproducts Gene-chipdetectionm 2004-04-13发布 2004-04-13实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19495.6一2004 前 言 GB/T19495(《转基因产品检测》为系列标准: GB/T19495.1一2004转基因产品检测通用要求和定义 2 GB/T19495. 2004转基因产品检测实验室技术要求; GB/T19495.3一2004转基因产品检测核酸提取纯化方法; GB/T19495.4一2004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法; GB/T19495.52004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法; 基因芯片检测方法; GB/T19495.62004转基因产品检测 GB/T19495.7一2004转基因产品检测抽样和制样方法; GB/T19495.8一2004转基因产品检测蛋白质检测方法 本部分的附录A、附录B,附录C和附录D为规范性附录 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本部分由质量监督检验检疫总局批准发布 本部分主要起草单位:深圳出人境检验检疫局、国家质量监督检验检疫总局动植物 检疫实验所 本部分参与起草单位;北京师范大学、广东出人境检验检疫局、辽 宁出人境检验检疫局、上海博星基因芯片有限责任公司 本部分主要起草人;章桂明,黄文胜、程英豪、翠文、曹际娟、朱水芳,李瑶、缪海珍、余道坚、陈枝楠、 孙增强、谢月华 本部分系首次发布的国家标准
GB/T19495.6一2004 转基因产品检测基因芯片检测方法 范围 GB/T19495的本部分规定了转基因产品基因芯片检测方法 本部分适用于用基因芯片对转基因产品的筛选基因、物种结构特异性基因,品系鉴定检测基因和内 源基因等的检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T19495的本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文 件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本 部分 GB/T19495.1一2004转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.22004转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.32004转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.4一2004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法 GB/T19495.5一2004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法 7 GB/T19495. 2004转基因产品检测抽样和制样方法 术语定义和缩略语 本部分采用下列术语、,定义和缩略语 3.1术语和定义 GB/T19495.1确立的以及下列术语和定义适用于GB/T19495的本部分 基片 Substrate 基因芯片中用于固定探针的基质,通常采用标准的“载玻片或其他固体载体”,经过化学修饰制备 而成 3.1.2 基因芯片探针DNAmieroarrayprobe 基因芯片中固定于基质表面,能与样本DNA互补、用于探测样本DNA信息的核酸分子,本部分采 用寡核昔酸片段作探针 3.1. 定位探针positivepositionprohe 是一段与待检基因无关的寡核苷酸,通过和标记的定位探针互补链杂交显示信号,用于点样矩阵的 位置的确定 3.1.4 阳性质控探针psitvequalityotrolprohe 用于样品抽提、PCR,杂交的反应体系的监控,一般用生物的管家基因来设计阳性质控探针
GB/T19495.6一2004 3.1.5 阴性质控探针negativequalitycontroprobe 是一段与待检基因无关的寡核苷酸,用于基因芯片非特异性杂交背景的监控 3.1.6 基因芯片空白质控点noprohemicroarrayspot 由不含核酸的点样液点制而成,用于基因芯片杂交背景的监控 3.1.7 目标基因探针pr rohefortargetgene 用于检测目标基因序列的探针 3.1.8 信噪比signalnoiseratio 是杂交信号值与杂交背景值的比值,由图像分析软件自动判读 3.2缩略语 下列缩略语适用于本标准 sy5-dcTP,eoy5deoxyeytidtinetriphosphate.,ey5标记的脱氧胞苷三磷酸 3.2. 3.2.2NsC;nosamplecontrol,空白样本对照 3.2.3NTC;notemplatecontrol,空白模板对照 NC;negativecontrol,阴性对照 4 3.2. 3.2.5C;positivecontrol,阳性对照 防污染措施 按照GB/T19495.2一2004的规定执行 抽样与制样 按照GB/！19495.7一2004的规定执行 原理 基因芯片技术是将探针DNA有序地固定于玻片或其他固相载体上,测试样品的核酸分子经过标 记,与固定在载体上的DNA阵列中的探针按碱基配对原理同时进行杂交,洗去未互补结合的片段 然 后通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描,检测杂交信号强度,用计算机软件进行数据的比较 和分析,从而获取样品分子的数量和序列信息 基因芯片技术的操作原理分为两部分;芯片的制备,样本的检测 基因芯片的制备;根据需要检测的外源目标基因设计寡核苷酸探针,用于制备基因芯片 在制备寡 核苷酸探针时,一般在其5',或3'端进行氨基修饰,以利于其在玻片表面的固定 另外,对玻片表面进 行氨基修饰,然后在氨基修饰后的玻片表面上连接双功能偶联剂,如戊二醛(G.A)或对苯异硫氰酸酯 PDC),制备成基片 探针合成好后,利用(通过)点样仪点在基片上,寡核苷酸的修饰氨基将与基片上 的戊二醛的另一个醛基发生化学反应,或与PDC分子的另一个异硫基发生类似的反应,从而达到寡 核苷酸交联固定的目的 为了有利于寡核苷酸探针分子和目标基因片段之间的杂交,通常在所设计的 寡核苷酸探针序列的5'端或3'端通常要加人一段不直接参与杂交的重复序列,称为手臂分子 采用 poly(dT)10作为手臂分子 点样完成后要对芯片进行后处理,后处理的目的主要是为了使探针能与载 体表面牢固结合,同时,还对载体上未与探针结合的游离活性基团进行封闭以避免在杂交过程中非特异 性的吸附对实验结果(特别是背景)造成影响 样本的检测;包括目标DNA的标记,杂交和结果判断等部分 测试样本(目标DNA)在酶促反应
GB/T19495.6一2004 中通过掺人法或引物修饰等方法进行标记 利用核酸碱基配对的性质,将标记的测试样本变性后与点 在芯片上的寡核苷酸探针特异性杂交,这样芯片上与标记测试样本特异性结合的点就会显示信号,通过 基因芯片扫描仪检测发出的信号及其强度,根据信号值判断测试样本中是否存在特定的基因 试剂 除另有规定外,所有试剂的等级和要求应符合GB/T19495.22004中的规定 如未明确规定的、 试剂应是分子生物学级的 所有试剂的储存和使用应符合供应商和实验室的要求 7.1cey5-dCTP .2点样液(o.2 mol/L碳酸钠 7.3基因芯片洗脱液(0.2%SDs). 基因芯片杂交液(1%SDS,l0XSSPE) 阴性标准物质 7.6阳性标准物质 琥珀酸酥溶液(0.5%琥珀酸酥,溶剂为毗咯婉酮,pH8.0) 棚氢化钠溶液(0.2%NaBH,溶剂为PBS). 7.g 标记的定位探针的互补链 主要仪器设备 8.1基因芯片点样仪 8.2紫外交联仪 8.3基因扩增仪 8.4基因芯片扫描仪;要配备具有分析信噪比的软件 8.5杂交仪 8. 清洗槽 暗室 检测 -般性要求 9.1 附录A至附录C规定了转基因产品筛选检测、物种结构特异性检测和品系鉴定检测的基因芯片检 渊方法以及各自的适用范围 测试样品中DNA的提取,应按照GB/T19495.32004中的规定执行 每个测试样品提取时应做 两个提取重复 每批测试实验需设置对照 对照的设置应符合GB/T19495.2一2004中的规定 所有对照的结果 中若有一项不符合者,测试结果应放弃并重做 9.2基因芯片检测的种类 根据测试样品的类型和(或)分析检测的要求,转基因产品的基因芯片检测分为;筛选检测、物种结 构特异性基因检测和品系特异性基因检测等 10结果表述 未检出×××转基因成分,检测低限为×% 检出×××转基因成分,检测低限为×% 如果进行了品系检测,则进一步报告该检测样品是 ×××转基因品系
GB/T19495.6一2004 11测试报告 测试报告应符合GB/T19495.1一2004中的规定和GB/T19495.4中规定的内容,并且至少还应 包括以下的附加信息 -采用基因芯片检测方法的依据; -核酸提取方法的依据; -本标准第10章中的内容
GB/T19495.6一2004 附 录 A 规范性附录 转基因植物及其产品筛选检测的基因芯片检测方法 范围 A.1 本附录规定了转基因植物及其产品筛选检测的基因芯片检测方法 本附录适用于转基因大豆、转基因玉米、转基因油菜、转基因番茄和转基因棉花及其加工产品中转 基因成分的定性筛选检测 A.2原理 通过多重PCR扩增和基因芯片技术,可以定性筛选检测转基因大豆、转基因玉米、转基因油菜、转 基因番茄和转基因棉花及其加工产品中转基因成分 A.3检测 A.3.1检测基因 本方法检测转基因植物及其产品中的CaMAV35S启动子、NOS终止子、NOSs启动子CaMV35S 终止子、,FMV35S启动子,Bar,PAT,NPTI,CaMV-CP基因和18srRNA 其中,CaMV-CP是用于判 断CaMV35S启动子阳性是否是由于待检样品受到了花椰菜花叶病毒污染所致,以防假阳性的出现， 8srRNA作为阳性对照 A.3.2检测灵敏度 本方法的检测灵敏度为0.5% A.3.3主要试剂 A.3.3.1引物和探针 筛选基因检测所用引物序列和探针序列以及阳性对照引物序列和探针序列分别见表A.1和 表A.2 表A.1筛选检测基因的引物序列和探针序列 扩增片段 基因 名称 序 列 长度/bp 正向引物 5’-AGACTGGCGAACAGTTCATACAGA-3” CaMV35S 5'-GCAATGGAATCcGAGGAGGT-3" 反向引物 188 启动子 探针 5’-NHg-polydT)n-T(GCTCCACCATGTTGACGAAG3” 正向引物 5'-CCCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3” CaMV35S 反向引物 5”-CCCTGGATTTTGGTTTTAGGAAT3" 134 终止子 探针 5'-NHpoly(dT)-GAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAA-3” 正向引物 5 -GAAccGCAAcGATTGAAGGA-3” NOS 反向引物 5'-TGGATACCGAG;GGGAATTTATG3” 177 启动子 探针 5'-NH-poly(dlT)-GAccTTAGGcGAcTTTTGAAcG-3"
GB/T19495.6一2004 表A.1(续 扩增片段 序 基因 名称 列 长度/bp 正间引物5”-TGAATcTGTTGcCGGTcTT3" NOS 138 反向引物5'-AAATGTATAATTGcGGGAcTcTAATC-3" 终止子 探针 5'-NH， 1pydT) -GATGATTATCATATAATT-3” 正向引物5'-CAGCATTCAGATTGGGTTCA-3’ FMV35S 反向引物 5'-CTTTTGGCTAATGGTTTGGAGAC3” 172 启动子 5'-NH-polydT)0-AAAACCAAGAAGGAAC'TcCCATC-3" 探针 正向引物5'GGAAGGGAcTGGcTGcTATTG3" 5'-G;ATG;TTTcG;cTTGG;TGGT 反向引物 157 NPT 探针 5'-NH GccGAGAAAGTATCc3” ！-poly(dT)0-GCT 正向引物 5'-(GCTcCAcGCTCTACAcccAC-3 Bar 反向引物5’-AAAcCcAcGTCATGcCAGTT-3’ 181 探针 5'-NH-poly(dT)n-CTG;TGCCTcCAGGGACTTCA-3” 正向引物 5'-GACAGAGCCACAAACACCACAA-3” 反向引物 PAT 5'-CAA'TCGTAAGCGTTCCTAGCCT-3” 144 cccTcAAccTcA-3 探针 5'-NHH-poly(dT)0-GCC 5'-GGG;AccAAATTATTG;ATcTAAccTcT-3" 正向引物 CaMV-CP 反向引物 5’-TcTcCTGAATcGcCTTTcGTCTT-3" 148 探针 5’-NHg=polydT)-TATGACAACTACCGACG,ACTC'GA-3' 表A.2阳性对照(18srRNA)引物序列和探针序列 扩增片段 列 基因 名称 长度/bp 正向引物 5'-GAGAAACGGCTACCACATCCA-3’ 18srRNA 反向引物5'cG;TGccATcccAAAGTcCcAA3" 254 探针 5'-NH y(dT)-cGCGCAAATTAccCAATcc'TGACAC-3” l！-poly A.3.3.2多重CR反应体系 多重PCR反应体系见表A.3， 表A.3多重CR反应体系 试剂名称 PCR反应体系终浓度 10×PCR缓冲液(不含Mg 1×PCR缓冲液 氯化镁溶液 1.5rmmol/I d(AGU)TP 0.2mmol/1 dCTP 0.02mnmol/1 -dcTP 0.002mol/ Cy5 备正向和反向引物 各0.3 3pmaln
GB/T19495.6一2004 表A.3(续) 试剂名称 PCR反应体系终浓度 Taq酶 0.11U/l UNG酶 0.02U/山 DA模板 100ng 补足反应总体积到部L 双蒸水 注:反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整 A.3.4多重PCR扩增 A.3.4.1多重CR反应参数 多重PCR反应参数为50C5nmin;94C5min;94C10s,55C10s,72C30s,35个循环;72C 0min;4C保存 注:不同的基因扩增仪可根据仪器的要求将反应参数做适当的调整 A.3.4.2筛选检测多重PCR 将表A.1和A.2所列的扩增筛选检测基因和阳性对照的引物同时加人多重PCR反应体系中(见 表A.3),按A.3.4.1多重PCR的反应参数进行反应 A.3.5CR产物的沉淀 将多重PCR反应产物加2倍体积的无水乙醇,1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2),置于一20c 避光沉淀30min以上,供基因芯片杂交检测用 A.3.6杂交 A.3.6.1杂交反应 沉淀后PCR产物经13000r/min15min离心,弃上清,避光晾干,加经55C预热的杂交液6L,混 匀后95C3min,0c5min后全部转移到芯片的点样区域,加盖玻片 在杂交舱里加几滴水,以保持湿 度 将芯片放人杂交舱,密封杂交舱,然后放进50C水浴内保温1h A.3.6.2洗片 打开杂交舱,取出芯片,用0.2%SDS冲掉盖玻片,然后把芯片放人盛有0.2%SDS的染色缸,放 置5min,用双蒸水冲洗二遍 室温避光干燥 A.3.7扫描检测 将杂交后的基因芯片放人扫描仪内扫描,并分析结果,控制扫描仪的软件应具有信噪比分析功能 A.3.8扫描结果的判定 首先阴性质控探针杂交信噪比均值等于小于3.5,基因芯片空白质控点杂交信噪比均值等于小于 3.5,阳性质控探针杂交信噪比大于5.0判定为杂交合格,在此基础上,目标基因探针杂交信噪比均值大 于等于5.0判定为阳性信号,在3.5与5.0之间判定为可疑阳性,小于等于3.5判定为阴性 A.3.9可疑数据的确证 对于可疑的数据,确证实验按照GB/T19495.5一2004中规定的方法执行 结果报告 A，4 检出×××基因,定位探针杂交点、芯片空白质控点阴性质控探针杂交点阳性质控探针杂交点的 检测结果正常 未检出×××基因,定位探针杂交点、芯片空白质控点、阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点 的检测结果正常 如果DNA样本没有检测出阳性质控探针杂交信号,应重复一次,若结果相同,则判定实验不成功
GB/T19495.6一2004 附 录 B 规范性附录 转基因植物及其产品物种结构特异性基因的基因芯片检测方法 B.1范围 本附录规定了转基因植物及其产品的物种结构特异性基因的基因芯片检测方法 本附录适用于转基因大豆(GTs40-3-2)、转基因玉米(Bt176,Btl1、MON810,GA21,CBH351、 T25)、转基因油菜(抗草甘麟、抗草丁瞬和雄性不育抗草丁麟)和转基因棉花(MON531)及其加工产品 由单一作物种类组成的物种结构特异性基因的定性检测 B.2原理 通过多重PCR扩增和基因芯片技术,可以检测转基因大豆(GTS40-3-2)、转基因玉米(Btl76、 Btl1,MON810,GA21,CBH351、T25)、转基因油菜(抗草甘腾、抗草丁脚和雄性不育抗草丁腾)和转基 因棉花(MON531)及其加工产品中由单一作物种类组成的物种结构特异性基因 B.3检测 B.3.1检测基因 本方法检测转基因大豆(GTs40-3-2)及其产品中的Leetin,CaMV35S启动子、NOs终止子和 CP4-EPSPS基因;转基因玉米Btl76、Btl1、MON810,GA21、CBH351、T25)及其产品中的Zein、 CaMV35S启动子.CaMV35S终止子、NOS终止子、Bar、Cry9C、PAT和CryIAb)基因;转基因油菜 (抗草甘腾、抗草丁磷和雄性不育抗草丁磷及其产品中的Fbp、CaMV35S启动子、NOS终止子、 FMV35S启动子,GOX、EPSPs,PAT,Bar,Bar rnase和Barstar基因;转基因棉花(MONN531)及其产品 中的CaMV35S启动子,NOS终止子,NPT和CryIA(c)基因 B.3.2检测灵敏度 本方法的检测灵敏度为0.5% B.3.3主要试剂 B.3.3.1 引物和探针 转基因大豆物种结构特异性基因检测所用引物序列和探针序列见表B.1 转基因玉米物种结构特异性基因检测所用引物序列和探针序列见表B.2 转基因油菜物种结构特异性基因检测所用引物序列和探针序列见表B.3 转基因棉花物种结构特异性基因检测所用引物序列和探针序列见表B.4 阳性对照的引物和探针见表B.5 表B.1转基因大豆物种结构特异性基因检测的引物序列和探针序列 扩增片段 基因 名称 序 列 长度/bp 正向引物 5'-CAAGTCGTCGCTGTTGAGTTTG3” 反向引物 5'GcTGGTGGAGGcATcATAGGT-3" 165 Lectin 5'-NH=polydT)n-TCTATcAGATCCATcAAAACGACG3” 探针
GB/T19495.6一2004 表B.1(续 扩增片段 序 列 基因 名称 长度/bp -AGACTGGGANCNGTTCATXCAGA了" 正向引物 CaMIV35S 188 反向引物5'-GcAATGGAATccGAGGAGGTT-3” 启动子 探针 5'-NH pwlydIT )-TGCTCCACCATGTTGACGAAG3” 正向引物5’-TGAATcCTGTTGCCGGTCTT-3’ NOS 反向引物 5'-AAATGTATAATTG;CGGGACTCTAATC-3” 138 终止子 5 NH-poly(dT)0-GATGATTATCATATAATT-3” 探针 正向引物 5'-AGAGCCGTGGATAGATTAAGGAAG3” 5’ CP4-EPSPS 反向引物 -AGAccG CCGAACATGAAGGA-3’ 149 探针 5'-NH -GGAAAGGccAG,AGGATTTGC3” g-poly 表B.2转基因玉米物种结构特异性基因检测的引物序列和探针序列 扩增片段 基因 名称 列 序 长度八 o 正向引物5'*-CCAAGAACTGGATGAACGGTTAG3’ Zein 反向引物 5'-GAGAAGCCGGTCGAGGTAGATAG3’ 184 探针 5'-NH-poly(dT)10-TTCTGGCTCTAACTTGGTTCCG3" 5’-AGACTG;GcG;AAcAGTTcATAcAGA-3” 正向引物 CaMV35S 5'-GcAATGGAATccGAGGAGGT-3" 188 反向引物 启动子 探针 5'-NHpoly(dT)-TGcTcCACcATGTTGAcGAAG3" 正向引物 5'-CCCAGATAAGG(GAATTAGGGTTC-3’ CaMV35s 反向引物 5'-CCCTGGATTTTGGTTTTAGGAAT-3’ 134 终止子 探针 5'-NH-polydT)0-GAAACCCTTAGTATGTAT'TGTAT'TGTAA-3” 正向引物 5'-TGAATCCTGTTGCCGGTCTT-3 NOS 5'-AAATGTATAATTGcG 反向引物 GGAcTcTAATc-3 138 终止子 探针 5'-NH y(dT)n-(G;ATG;ATTATCATATAATT-3” l！-poly 正向引物 5'-GCTccAcGCTCTACAcCCAC3’ Bar 反向引物5’-AAACcCACGTCATGCCAGTT-3’ 181 5'-NHpoly(dT)n-CTGTGCCTcCAGGGACTTCA-3” 探针 正向引物 5'-G,ACAGAGCCACAAACACCACAA-3” 反向引物 PAT 5'-CAATCG;TAAGCGTTCCTAGCCT-3’” 144 5 探针 -NH-poly(dT)m-GccACAACAcccTCAAccTcA3" 5’-T(GTTc(cCCAAcTACGACTcCA-3 正向引物 CryIA(b反向引物5'-AGG;TGcGG(GcTccTGATGcT-3’ 151 探针 5'-NHpoly(dT)n-CAGCAcGGGGTTGGTGTAGAT-3”
GB/T19495.6一2004 表B.2(续 扩增片段 序 基因 名称 列 长度/bp 5CTGTGcTrGCTGAAGGATGC了" 正向引物 Cry9c 5'-cccTGcGGAAcTGG;TGGTAG3" 99 反向引物 探针 5'-NH 打plydT) -CAAGTACACCAACTACTGCGAGACC-3” 表B.3转基因油菜物种结构特异性基因检测的引物序列和探针序列 扩增片段 基因 名称 长度/Dp 5-CCT GAATC-3 正向引物 反向引物 TACCCA-3" -GTC Fbp 169 探针 5'-NH-poly(dT)m-TGcTAcTcGTTTcccGcTcA3” 5’-AG;AcCTGGcG AGTTcATAcAGA-3” 正向引物 CaMv35s 反向引物 5'-GCAATGGAATCCGAGGAGGT-3’” 188 启动子 5'-NHpolydT)n-TGCTCCACCATGTTGACGAAG3” 探针 正向引物5'-CAGCATTCCAGATTGGGTTCA-3 FMV35s 反向引物 5'-CTTTTGGC'TAATGGTTTGGAGAC-3” 172 启动子 探针 5'-NH-polydT)0-AAA AAGAAGGAACTCCCATC-3” 5-TGAATcCTG;TTGccGGTcTT-3" 正向引物 NOS 5'-AAATGTATAATTGcGGGAcTcTAATc3’ 138 反向引物 终止子 探针 5'-NHpoly(dT)-GATGATTATcATATAATT3 正向引物 5'-GCTCCACGCTCTACACcCAC-3’ Bar 反向引物 5’-AAACCCACGTCATGCCAGTT-3’ 181 探针 5'-NHH-poly(dT)0-CTGTGCCTCCAGGGACTTCA-3” 正向引物 5'-(GACAGAGCCACAAACACCACAA-3” PAT GccT-3” 反向引物 5'CAATcGTAAGcGTTccTA 144 探针 5'-NH -polyaT)wGccAAACAccCTcAACcTCA3 正向引物5’-AGTTcGCTGGTCTCACTGcTG3’ GOX 反向引物5'-GGACGGAAACcCATCCACTT-3’ 133 5 -NH-poly(dT)-GCTCCTGcCAGTTCTGAAGAAC3 探针 正向引物 5'-GGGTCTTGTTGG;TGTTTACG.ATT-3” 反向引物 EPSPS 5'-TGTAGGTGATTGGCGTTGGAG3” 182 探针 5'\NH-poly(dT)-GAGAGAAGcGTcAccA3 5’-TCcGTTT(GTTTAcT(G(GT(GcTT(G3'" 正向引物 反向引物5'-(GAGGGcTTGTGcTTcTGATTTT-3'" 192 Barnase 探针 5'-NHpolydT)n-(GTCTGAAGATAATCCGCAACcC-3” 10
GB/T19495.6一2004 表B.3(续 扩增片段 序 基因 名称 列 长度/bp GTATcAGcGACcT-3” G 正向引物 5'-AACAAATcA" 5'-AAcTGccTccATTccAAAAcG3" 145 Barstar 反向引物 探针 5'-NH wyir )-ACCTGGAcGCTTTATGGGATT-3’ 表B.4 转基因棉花物种结构特异性基因检测的引物序列和探针序列 扩增片段 基因 名称 长度/Dp 正向引物 5'’-AGACTGGCG TACAGA-3” CaMV35S 反向引物 188 -GCAATGGAA GAGGAGGT-3” 启动子 5’ ACcATG;TrG;AcG;AAG;3" 探针 -NH-poly(dT)io-TGC 5’-TGAATcCTGTTGCcGGTcTT-3’ 正向引物 NO)s 反向引物 5’-AAATGTATAATTGCGGGACTCTAATC-3’ 138 终止子 5'-NHpolydT)n-(GATGATTATCATATAATT-3” 探针 正向引物5'-GGAAGGGACTGGCTGCTATTG3’ NPTI 反向引物 5'-GATGTTTCGCTTGGTGGTCG3" 157 探针 5'-NH-poly(dT)10-GCT GCCGAGAAAGTATCC-3” 5’-AGACTcAAcAGcAGTG;GAAATAAcA-3” 正向引物 5'-G;TG;AATAGGG;GTCACAGAAGcATA-3” 123 反向引物 cryIA c 探针 5'-NHpoly(dT)-TcTGGTAGATGTGGATGGGAAGT3” 表B.5阳性对照(18srlRNA)引物序列和探针序列 扩增片段 基因 名称 长度/bp 正向引物 5'-GAGAAACGGC'TACCACATCCA-3” 反向引物 254 18srRNA 5'-CGTGCCATCCCAAAGTCCAA-3" AATTAcCCAATcCTGACAC" 探针 5'-NH-poly(dT)w-cGcGcA B.3.3.2多重CR反应体系 多重PCR反应体系见表B.6 表B.6多重PCR反应体系 试剂名称 PCR反应体系终浓度 10×PCR缓冲液(不含Mg十 1×PCR缓冲液 氯化镁溶液 1.5mmol/1 d(AGU)TP 0.2mmol/I dCTP 0.02mmol/1 Cy5-dCTP 0,002mmol/L 各正向和反向引物 各0.3mol儿 ll
GB/T19495.6一2004 表B.6(续 试剂名称 PCR反应体系终浓度 Taq酶 0.1IU/l UNG酶 0.02IU/al DNA VA模板 100ng 双燕水 补足反应总体积到50山 注:反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整 B.3.4多重PCR扩增 B.3.4.1多重PCR反应参数 多重PCR反应参数为:50C5min;94C5min;94Cl0s,55C10s,72C30s,35个循环;72C 10n min;4C保存 注:不同的基因扩增仪可根据仪器的要求将反应参数做适当的调整 B.3.4.2物种结构特异性基因检测多重PCR 将各物种结构特异性基因检测芯片的引物和阳性对照引物分别同时加人多重PCR反应体系中(见 表B.6),按B.3.4.1多重PCR的反应参数进行反应 针对转基因大豆物种检测,同时加人表B.1和B.5所列的扩增L.eetin、CaMV35S启动子,NOS终 止子,CP4-EPsPs和18srRNA的引物 针对转基因玉米物种检测,同时加人表B.2和B.5所列的扩增Zein.CaM35S启动子、CaM 35S终止子、NOs终止子,Bar,Cry9c,PAT.,CryIA(b)和18srRNA的引物 针对转基因油菜物种检测,同时加人表B.3和B.5所列的扩增Fbp.,CaMV35s启动子、NOs终止 子、,FMV35S启动子、EPsPs,GOX、,Bar、,PAT,Barnase_,Barstar和18srRNA的引物 针对转基因棉花物种检测,同时加人表B.4和B.5所列的扩增caMV35S启动子、NoOs终止子、 NPTI,CryIA(e和18srRNA的引物 B.3.5PCR产物的沉淀 将多重PCR反应产物加2倍体积的无水乙醇、1/10体积的3mol/L.NaAc(pH5.2),置于一20c 避光沉淀30min以上,供基因芯片杂交检测用 B.3.6杂交 B.3.6.1杂交反应 沉淀后CR产物经13000r/min15min离心,弃上清,避光干,加经55C预热的杂交液6L,混 匀后95C3min.0C5min后全部转移到芯片的点样区域,加盖玻片 在杂交舱里加几滴水,以保持湿 度 将芯片放人杂交舱,密封杂交舱,然后放进50C水浴内保温1h B.3.6.2洗片 打开杂交舱,取出芯片,用0.2%SDS冲掉盖玻片,然后把芯片放人盛有0.2%SDS的染色缸,放 置5nmin,用双燕水冲洗两遍 室温避光干燥 B.3.7扫描检测 将杂交后的基因芯片放人扫描仪内扫描,并分析结果,控制扫描仪的软件应具有信噪比的分析 功能 B.3.8扫描结果的判定 首先阴性质控探针杂交信噪比均值等于小于3.5,基因芯片空白质控点杂交信噪比均值等于小于 .5,阳性质控探针杂交信噪比大于5.0判定为杂交合格,在此基础上,目标基因探针杂交信嗓比均值大 于等于5.0判定为阳性信号,在3.5与5.0之间判定为可疑阳性,小于等于3.5判定为阴性 12
GB/T19495.6一2004 B.3.9可疑数据的确证 对于可疑的数据,确证实验按照GB/T19495.5一2004中规定的方法执行 B.4结果报告 检出×××基因,定位探针杂交点、芯片空白质控点、阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点的 检测结果正常 未检出×××基因,定位探针杂交点、芯片空白质控点、阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点 的检测结果正常 如果DNA样本没有检测出阳性质控探针杂交信号,应重复一次,若结果相同,则判定实验不成功 13
GB/T19495.6一2004 附录 C 规范性附录 转基因植物及其产品品系特异性鉴定的基因芯片检测方法 c.1范围 本附录规定了转基因植物及其产品品系特异性鉴定的基因芯片检测方法 本附录适用于转基因大豆(GTs40-3-2)、转基因玉米(Bt176,Btl1、MON810,GA21,CBH351、 T25)和转基因番茄(华番一号)及其加工产品中转基因成分的品系鉴定检测 C.2原理 通过多重PCR扩增和基因芯片技术,可以检测转基因大豆(GTS40-3-2)、转基因玉米(Bt176、 Btl1,MON810,GA21.CBH351、T25)和转基因番茄(华番一号)及其加工产品中的品系特异性基因 c.3检测 C.3.1检测基因 本方法检测转基因植物及其产品中的转基因大豆(GTs40-3-2)的品系特异性基因,转基因玉米 Bt176的品系特异性基因,转基因玉米Btl1的品系特异性基因,转基因玉米MONN810的品系特异性基 因,转基因玉米GA21的品系特异性基因,转基因玉米CBH351的品系特异性基因,转基因玉米T25的 品系特异性基因和转基因番茄(华番一号)的品系特异性基因 C.3.2检测灵敏度 本方法的检测灵敏度为0.5% C.3.3主要试剂 C.3.3.1 引物和探针 品系特异性基因检测和阳性对照所用引物序列和探针序列分别见表C.1和C.2 表C.1品系特异性基因检测的引物序列和探针序列 扩增片段 序 列 品系 名称 长度/bp 正向引物 5'-TGTAGGAGCCACCTTCCTTTTC-3’ 大豆 177 反向引物5'-AAcccTTcAATTTAAccGATGC3" GTS40-3-2 5'-NHpolydT)n-AAAATAAACATAGGGAACCCAAATG-3 探针 正向引物 5'-CTCTCGCCGTTCATGTCCGT-3’ 玉米 反向引物5'GGTcAGGCrcAGcTGATGT-3 213 Bt176 只'NHpbyadr)mcGcGGTGTGTccATTGTTGG3" 探针 正向引物5'-GCTGAAGCcAGTTAcCTTcGG3’ 玉米 反向引物 5’-TATCATCGACT'TCCATGACCA-3" 212 Btl1 探针 5'-NHpoly(dT)wGAcGcTcAGTGGAAcGAAAAcT-3” 14
GB/T19495.6一2004 表C.1(续 扩增片段 列 品系 名称 长度/Dp 正向引物 5'’-TCGAAGGACGAAGGACTCTAACG3 玉米 170 反向引物5'-TccATcTTTGGGAccACT GTC-3’ MON81o 探针 5'NH-poly(dr)w-cGGCAATGGcAAAGGATGTT3" 正向引物 5'-ACGGTGGAAGAG;TTcAATGTATG3’ 玉米 反向引物 5’-TCTCC'TTGATGGGCTGCA-3” 270 GA21 5'-NHpoly(dT)n-GATccGGTGCATGGCCG3 探针 正向引物5'-CCTTCGCAAGACCCTTCCTC'TATA-3 玉米 反向引物 5'-GTAGCTGTCGGTGTAGTCCTCGT-3 190 CBH351 ccG;TGTTcTc-3" 探针 5'-NHH-poly(dT)0 5'-ccTTcGcAAGAcccTTccTcTATA-3" 正向引物 玉米 反向引物 5'-AGATcATCAATcCAcrcTTGTGGTG3" 2231 T25 探针 5'-NHpoly(dT)n-CTcCGGAGACATGTcGACTCTAG-3” 正向引物5’-TACGGCGAGTTCTGTTAGGTCC-3’ 番茄 反向引物 5'-CCAGGCTTTACACTTTATGCTTC3” 146 号 华番 探针 5'-NHH-poly(dT)0-CATGAGCGGAGAATTAA-3” 表c. 阳性对照(18srRNA)引物序列和探针序列 2 扩增片段 列 基因 名称 长度/p 正向引物5'GAGAAAcGGcTAccAcATccA3” 反向引物5'cGTGccATcccAAAGTcCcAA3" 18srRNA 254 ydT)n-cGCGCAAATTAccCAATccTGAcAc-3” 探针 5-\NH-poly C.3.3.2多重PCR反应体系 多重PCR反应体系见表C.3. 表C.3多重PCR反应体系 试剂名称 CR反应体系终浓度 10×PCR缓冲液(不含Mg十 1×PCR缓冲液 氯化镁溶液 1.5mmol/I d(AGU)TP 0.2mmol/1 dCTP 0.02mmol/L Cy5-dCTP 0.002mmol/I 各正向和反向引物 各0,3mol/儿 0.1IU/I Taq酶 UNG酶 0.02IU/nL 100ng DNA模板 补足反应总体积到50A 双蒸水 反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整 注 15
GB/T19495.6一2004 C.3.4多重PCR扩增 C.3.4.1多重PCR反应参数 94C5 多重PCR反应参数为;50C5nmin; ;94C10s,55C10s,72C30s,35个循环;72C min;9 10 min;4C保存 注:不同的基因扩增仪可根据仪器的要求将反应参数做适当的调整 c.3.4.2品系鉴定检测多重CR 将表C.1和C.2所列的品系鉴定检测的引物和阳性对照引物同时加人多重PCR反应体系中(见 表c.3),按c.3.4.1多重PCR的反应参数进行反应 c.3.5PCR产物的沉淀 将多重PCR反应产物加2倍体积的无水乙醇、1/10体积的3nmol/INaAcpHH5.2),置于一20c 避光沉淀30min以上,供基因芯片杂交检测用 C.3.6杂交 c.3.6.1杂交反应 沉淀后PCR产物经13000r/min15min离心,弃上清,避光晾干,加经55C预热的杂交液6L,混 匀后95c3min,0C5min后全部转移到芯片的点样区域,加盖玻片 在杂交舱里加几滴水,以保持湿 度 将芯片放人杂交舱,密封杂交舱,然后放进50C水浴内保温1 h C.3.6.2洗片 打开杂交舱,取出芯片,用0.2%SDS冲掉盖玻片,然后把芯片放人盛有0.2%SDs的染色缸,放 置5min,用双蒸水冲洗两遍 室温避光干燥 C.3.7扫描检测 将杂交后的基因芯片放人扫描仪内扫描,并分析结果,控制扫描仪的软件应具有信噪比分析功能 C.3.8扫描结果的判定 首先阴性质控探针杂交信噪比均值等于小于3.5,基因芯片空白质控点杂交信噪比均值等于小于 3.5,阳性质控探针杂交信噪比大于5.0判定为杂交合格,在此基础上,目标基因探针杂交信噪比均值大 于等于5.0判定为阳性信号,在3.5与5.0之间判定为可疑阳性,小于等于3.5判定为阴性 C.3.9可疑数据的确证 对于可疑的数据,确证实验按照GB/T19495.5一2004中规定的方法执行 结果报告 <基因,定位探针杂交点、芯片空白质控点、阴性质控探针杂交点.、阳性质控探针杂交点的 检出×× X 检测结果正常 未检出×××基因,定位探针杂交点、芯片空白质控点、,阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点 的检测结果正常 如果DNA样本没有检测出阳性质控探针杂交信号,应重复一次,若结果相同,则判定实验不成功 16
GB/T19495.6一2004 附 录D 规范性附录 转基因产品检测的基因芯片制备与质控方法 范围 D.1 本附录规定了转基因产品检测用基因芯片的异硫氛基法制备基片和戊二醛法制备基片制备和质控 方法 本附录适用于转基因产品检测用基因芯片的异硫基法制备基片和戊二醛法制备基片制备和 质控 D.2原理 根据需要检测的外源目标基因设计寡核苷酸探针,用于制备基因芯片 基因芯片的质控主要通过基片上的探针和质控点,包括;定位探针、阳性质控探针、,阴性质控探针、 芯片空白质控点和杂交反应结果来实现 D.3基因芯片的制备 D.3.1基片的修饰 下述方法任选一种或使用商品化产品 根据修饰基团的不同,可采用D.3.1.1和D.3.1.2中的两种方法制备基片 D.3.1.1异硫基法制备基片 将干净玻片浸于含1%3-氨丙基三甲基硅婉的95%丙酮溶液中2min,然后丙酮浸洗5nmin,重复 6次,110C烘烤45min,再将玻片浸于含0.2%1,4苯二异硫佩酸酯及10%毗/DMF(二甲基甲酰 胺)溶液中2h,然后丙酮冲洗一次,室温晾干,放于4C备用 D.3.1.2戊二醛法制备基片 将干净玻片浸于1ml/儿LNaoH溶液中煮沸10mn进行趋基化预处理 将预处理过的玻片浸于 含1%3-氨丙基三甲基硅婉的95%丙酮溶液中2min,丙酮浸洗5min,重复6次,l10C烘烤45min,再 将玻片浸于5%戊二醛水溶液中50C条件下过夜 取出玻片,用0.2%SDS洗涤5min,重复3次,室温 晾干备用 D.3.2探针合成及配制 所合成的基因芯片探针的质量应符合GB/T19495.2-2004的规定,并用点样液溶解配制成5×的 贮存液(60moL),置于一20C保存 D.3.3基因芯片的点样 基因芯片点样应包括的探针和质控点;定位探针、阳性质控探针、阴性质控探针,芯片空白质控点 和目标基因探针 将上述探针的1×贮存液按预设顺序吸人384孔或96孔板中,在基因芯片点样仪上进行点样 每 种探针应重复点样5次 D.3.4点样后处理 点样后芯片在80%湿度环境下水合,然后在紫外交联仪上65mJ/em强度下交联1min,用双蒸水 洗涤去除游离探针,脉干,用琥珀酸酥溶液或棚氢化钠溶液封闭无样品点区域的活性基团,再次双燕水 洗涤并晾干 17
GB/T19495.6一2004 D.4基因芯片的质控 D .4.1基片的质控 用2.5Amol/L.定位探针对基片进行点样,每张基片在点样区域均匀点样3行20列 并按D.3.4 进行点样后处理 随后用去离子水6L,0.1Amol/LCy5标记的定位探针的互补链2AL和2×基因 芯片杂交液8L.进行杂交 置于杂交仪内54C杂交1h,洗涤后扫描并进行数据分析,如基片杂交图 像经软件分析后计算其杂交信噪比大于5.0为合格 同时观察点的成型是否圆整,点大小是否均一 D.4.2基因芯片的质控 同一批基因芯片产品应随机抽取5%进行质检(每批检测数目不少于2片. 基因芯片的质控采用阳性标准物质杂交法 阳性标准物质杂交法;用阳性标准物质DNA对已点样的基因芯片进行杂交检测 将沉淀后的PCR产物经13000r/min离心15 min,弃上清,避光晾干,加人6L.双蒸水重悬沉淀 后,再加人6L50C预热的杂交液;最后加人lALcy5标记的定位探针互补链溶液,混匀后95C放置 ,然后全部转移到芯片的点样区域,加盖玻片;将芯片水平放置在可密封的杂交容 3 min,0C放置5min， 器内,加水保湿,然后放进55C杂交仪内保温1h 杂交结束后,取出芯片,用洗脱液冲掉盖玻片,然后把芯片放人盛有洗脱液的清洗槽中5min,用双 蒸水冲洗两遍 避光干燥 用扫描仪分析杂交结果,目标基因探针杂交信噪比均值大于5.0,阴性质控探针和基因芯片空白质 控点杂交信噪比均值小于3.5判定为合格 18