牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22991一2008 牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationofirginiamyeinresidueinbovinemilkamdmilkpowder LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22991一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局,辽宁出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:宋文斌、李一尘、董振霖、隋凯、赵景红、薛大芳、张华一、李振荣、庞国芳
GB/T22991一2008 牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素Ml(irginiamyeinM1)残留量测定的液相色谱-串联 质谱测定方法 本标准适用于原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1残留量的测定 本标准的方法检出限;原料乳中维吉尼霉素M1为0.254g/L,纯奶粉中维吉尼霉素MI为2.0g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注明日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第1部分;总则与定义(GB/T6379.1 2004,ISO5725-l:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,ISo5725-2:1994,IDT GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,ISO3696;1987,MOD) 原理 试样中残留的维吉尼霉素M1在甲醇十乙肮混合提取液中涡旋提取、离心,取上清液用磷酸二氢铵 缓冲溶液稀释,于C固相萃取柱进行净化 将洗脱液中的维吉尼霉素M1用三氯甲分离萃取,去除 水层 氮吹三氯甲炕至干,用甲酸铵缓冲溶液与甲醇混合液溶解并定容,供液相色谱-串联质谱仪测定 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 乙酸 甲酸,色谱纯 4.3甲醇色谱纯 乙睛色谱纯 4.4 4.5三氯甲炕色谱纯 4.6磷酸二氢铵优级纯 甲酸铵;优级纯 4.8磷酸二氢铵溶液:0.1mol/L,称取l1.50g磷酸二氢铵(4.6),用水溶解定容至1000ml 4.9磷酸二氢铵溶液;0.01mol/L,量取0.1mol/L磷酸二氢铵溶液(4.8)100ml,用水稀释定容至 1000mL 4.10甲酸铵缓冲液;0.12mol/儿L,pH=3.2,称取7.56g甲酸铵(4.7),用水溶解,用甲酸(4.2)调节 pH到3.2,定容至1000nl 4.11甲酸铵缓冲液0.003mol/LpH=3.2,量取25.0mL的甲酸钱缓冲液(4.10),用水稀释定容至
GB/T22991一2008 1000mL 4.12甲醇十乙睛溶液(1+1) 4.13水十乙睛溶液(4+1) 4.14水十甲醇溶液(13十7) 4.15水十甲醇溶液(9+11) 4.16流动相A.0.o08mol/L甲般钱缓冲液(.1)用0.2pm谴膜过滤 流动相B.甲脾+乙腊溶液(I+1)(.12)用0.2pm谜膜过滤 4.17标准物质;维吉尼霉素M1(CAS;21411-53-0),纯度95% 4.18标准储备溶液:0.1nmg/ml 准确称取适量的维吉尼霉素M1标准物质,用甲醉配成0.lng/ml. 的标准储备溶液 该溶液在4C保存 注:称取标准物的质量是按纯度修正过的质量 4.19标准工作溶液;根据维吉尼霉素M1的灵敏度和仪器线性范围,用空白样品提取液配成不同浓度 的标准工作溶液 标准工作溶液在4C保存 仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪,配有电喷雾离子源 5.2离心机:最大转速为10000r/nmin 5.3离心管:锥形底玻璃离心管40mL、15mL和10mL,具塞;锥形底聚丙烯离心管50mL具螺旋盖 5.4电子天平:感量0.lmg和0.1g 5.5过滤器;聚四氟乙烯膜过滤器.0.22amx13nmm;尼龙膜过滤器.0.22pmx47mm. 5.日移液器;量程为lml一10mL和5ml一50 ml 5.7 微量加液器;量程为l0AL100L,l00 nL1000L 5.8流动相过滤装置 5. g 氮气浓缩仪 55 10高速涡流混合器 振荡器 55 11 5 .12酸度计:精确度为土0.02. 55 13 超声波仪 55 14 -次性注射器lml 15固相萃取柱;BondElutCw,500mg,柱长为6mL 16鸡心瓶,150mL 5 17 5 贮液器;100ml 5. 18试样瓶;2ml 5. 19一次性移液管 5.20滤纸 试样的制备与保存 6 试样的制备 将原料乳和纯奶粉样品分别混合均匀 各自分出0.5kg作为试样,将分出的试样密封,并作上 标记 6 试样保存 将试样置于4C条件下贮存
GB/T22991一2008 测定步骤 提取 原料乳样品 称取原料乳5.00mL.精确到0.01ml,放人50mL聚丙烯离心管中,加人10mL的甲醇十乙睛溶 液(1十1)涡旋1min,高速振荡10min,离心15min(5000r/min),将上清液转移至40m离心管中 再向残渣中加人2ml甲醉醇十乙晴溶液(1十1)涡旋5s,高速振荡5min,在5000r/min下离心l0min. 合并两次上清液与40mL离心管中 加人15mL的0.ml几磷酸二氢较游液(4.9),高速振荡 5min,以5000r/min离心10min,用滤纸过滤至150mL的鸡心瓶中,加人80mL磷酸二氢铵缓冲液 (4.9)混匀待净化 7.1.2纯奶粉样品 称取纯奶粉0.625g,精确到0.001g,放人50ml聚丙烯离心管中加水4.375g,超声溶解得到复 原乳 加人10mL的甲醇十乙腊溶液(1十1)涡旋1min,以下步骤同原料乳样品 7.2净化 依次用5ml乙睛、5mL水和5ml的磷酸二氢铵(4.9)洗涤活化固相萃取柱(5.15) 在柱上装上 贮液器(5.17),将样液(7.l)过柱,移去贮液器(5.17) 依次用2mL水,l0ml水十乙睛溶液(4十l). 2ml.水和10ml水十甲醇溶液(13十7)洗柱,弃去全部流出液 最后用5nmL水十甲醇溶液(9十11)洗 涤维吉尼霉素M1,收集洗脱液到15mL的玻璃离心管中 将10ml三氯甲烧(4.5)加人洗脱液中,振 荡5min,离心10min(5000r/min) 用一次性移液管定量收集三氯甲烧层到10mlL离心管中,在 0C条件下氮吹至干 再向离心管中加人500L 甲醇，超声5 1,加人500L 甲酸铵缓冲液 min pm的滤膜过滤到样品瓶中,供液相色谐-串联质谱仪测定 4.l1),高速涡旋5s 样液用0.2 7.3色谱测定 7 .3.1液相色谱条件 液相色谱条件如下 色谱柱:SumFireCa,5m,150mmX2.1mm(内径)或相当者; a) b) 柱温:40C; e)进样量:30L d 色谱柱总流量:300 L min 流动相及梯度见表1 表1流动相及梯度 时间/minm 流动相A/% 流动相B/% 0,00 93 20.00 40 60 60 26,00 40 28.00 93 35.00 93 7.3.2质谱条件 质谱条件如下: a)离子源:电喷雾离子源; b) 扫描方式:正离子扫描; e)检测方式;多反应检测 d) 电喷雾电压(IS);5000V; e)雾化气压力(CAS1):517.1kPa;
GB/T22991一2008 f 气帘气压力(CUR):103.4kPa; g 辅助气压力(CAS2):620.5kPa; h)离子源温度(TEM):700C; 定性离子对将定量离子对,采集时间(Dwell),去簇电压(DP)、碰撞气能量(CE)、人口电压 i EP),及碰撞室出口电压(CXP)见表2 表2维吉尼霉素M1的质谱参数 定性离子对(n 定量离子对(m/e)采集时间/ms 去簇电压/v碰撞气能量/V人口电压/V出口电压/N 71/之 526,3/336,9 8G 20 15 526.3/355.1 526,3/336,9 200 l1 526.3/508.4 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 7.3.3.1定性测定 按照液相色谱-串联质谱测定条件进行样品溶液测定 如果检出的色谱峰的保留时间与基质标准 中物质相一致,并且所选择的离子均出现,选择1个母离子和2个以上子离子,样品谱图中组分定性离 子的相对丰度与浓度接近的基质标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较,偏差不超过 表3规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 K50 相对离子丰度K 20GB/T22991一2008 值是以95%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,原料乳和纯奶粉中维吉 尼霉素Ml的添加浓度范围及重复性方程见表4. 表4添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 样品基质 添加浓度范围 重复性限" 再现性限R =0.894 -0,666 0.273 原料乳 R=2.268gm十0 0.25一2.00 lgr一 lgm一 g 2. =0.532l 十0.111 R=0.685 +0.086 纯奶粉 0一8.0 lgr g川十 g lgm 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 再现性 在线性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,原料乳和纯奶粉中维吉尼 霉素MI的添加浓度范围及再现性方程见表4
GB/T22991一2008 附 录A 资料性附录 标准物质总离子流图 维吉尼霉素M1标准物质总离子流图,见图A.1 4.8e4 24.28 4.6e4 生.4e4 4.2ef 4.0e4 3.c4 3.6et 3.4e4 3.2c4 3.0e4 2.8ce4 2.6e4 2.2e4 2.0e4 1.8c4 1.6e4 1.4e4 1.2e4 1.0et 8000.0 6000.0 4000.0 2000.0 10 16 20 26 28 30 32 34 t/min 图A.1维吉尼霉素M1标准物质总离子流图
GB/T22991一2008 附 录 B 资料性附录 回 收 率 维吉尼霉素M添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1维吉尼霉素1添加浓度及其平均回收率的试验数据 样品基质 加浓度/4g/kg 平均回收率/% 0,25 87.95 0.50 88.44 原料乳 l.00 92.92 2.00 93.64 89.41 2.0 4.0 91.15 纯奶粉 6.0 95.75 8.0 99.87