瓜类果斑病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36822一2018 瓜类果斑病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofAeidovoraxeitrwli 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36822一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院、深圳市检验检疫科学研究院、南京农业大学、中华人民 共和国新疆出人境检验检疫局、农业科学院植物保护研究所、国家瓜类工程技术研究中心、江苏省 植物保护植物检疫站 本标准主要起草人;赵文军、冯建军、田茜、田艳丽、张祥林、赵廷昌、胡白石、龚伟荣
GB/36822一2018 瓜类果斑病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了瓜类果斑病菌的症状观察、分离培养,免疫学及分子生物学检测方法 本标准适用于可能带有瓜类果斑病菌的西瓜、甜瓜等葫芦科作物植株及种子的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/Tl465西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法 瓜类果斑病菌基本信息 citrulli(Schaadetal.Schaadetal.,2008 学名:Acidoora.r subsp.citrulli(Sehaadetal.,1978)Willemsetal.,1992 异名;Aeidoorar Pseudlomonasaenasubsp,citrulli(Schaadetal.,l978Huetal.,1991 Peudomnaspeudoalaligenes subsp.citruliSchaadetal.,1978 传播途径:主要通过带菌种子进行远距离传播,田间扩散主要依靠雨水、农事操作和昆虫传播 瓜类果斑病菌的其他信息参见附录A 方法原理 根据瓜类果斑病菌的培养性状、生物学特性、寄主范围及危害症状等对病原菌进行分离培养;根据 瓜类果斑病菌与抗体之间的特异性反应进行免疫学检测;根据瓜类果斑病菌的特异性DNA序列进行 分子生物学检测 仪器设备 5.1PCR仪;温度范围4C99C,控温精度士0,25C 5.2实时荧光PCR仪;温度范围4C一99C,控温精度士0.25C 5.3电泳仪;输出电压5V~600V,输出电流2mA200mA 5.4杂交炉:温度范围室温至99.9C,控温精度士0.1 5.5凝胶成像分析仪;光强连续可调302nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV干涉滤光 片,机载头像捕捉软件、图像分析软件 5.6显微镜:目镜放大倍数10,物镜放大倍数100. 5.7高速冷冻离心机:最大转速150001 r/min 5.8恒温培养箱:温度范围5C65,波动度士0.5 5.9超净工作台;高效滤膜可除去99.99%以上的0.3AL粒子
GB/T36822一2018 5.10灭菌锅;最大压力为0.235MPa,可调控温度范围为l05C135C 5.11台式小型离心机:最大转速70001 r/min 5.12超低温冰箱:一80C 5.13常规冰箱;4C. 5.14小型电动粉碎机:电机转速200001 min 5.15全钢大号指甲钳:10cmX1.5cm 5.16旋涡振荡器;最大转速为2800r/min 5.17微量进样器;2.5AL,10AL,20AL,l00AL,200AL.l000AL 6 主要试剂 6.175%乙醇 6.21%次氧酸钠 6.3生理盐水 6.40.01nmol/L磷酸缓冲液;氧化钠(NaCl)7.9g氯化钾(KCI)0.2g,磷酸氢二钠(Na,HPO,)1.44g" 磷酸二氢钾(KH,PO,)0.24g,溶于800mL蒸水中,用盐酸(HCI)或氢氧化钠(Na(OH)调节溶液的 pH至7.0,最后加蒸憎水定容至1L 6.5PCR凝胶电泳检测试剂见附录B 6.6实时荧光PCR检测试剂见附录C 6.7锁式探针检测试剂见附录D 6.8NA、,KB,EBBA及TwZ培养基配方见附录E 田间观察检测 7.1症状观察 对于植株样品,参照附录A中的症状描述观察有无瓜类果斑病的典型症状,对出现典型症状或可 疑症状的植株进行拍照记录,并采集表现症状的植株送实验室进行检测鉴定,田间无症状植株可随机 采样 7.2现场检测 利用商品化免疫胶体金试纸条进行现场检测,按照说明书进行操作及结果判定 实验室检测鉴定 8 8.1样品制备 8.1.1植株样品 对于有症状植株,低倍显微镜下观察病健交界处组织有无溢菌现象,若有溢菌现象,选取新鲜的病 健交界处组织(对于无症状样品,随机选取植物组织),切成0.5emX0.5em左右的小块,用75%的乙醉 或1%的次氯酸钠)进行表面消毒,晾干,放人装有1mL无菌水的2mL离心管中,用灭菌玻棒捣碎 制成悬浮液，1000r/min离心1min,弃去沉淀,上清液转人另一干净的2mL离心管中 可将2份~ 3份同一样品的悬浮液合并成一管,最终制成1ml一2ml悬浮液,用于分离培养、免疫学检测及分子 生物学检测
GB/36822一2018 8.1.2种子样品 对于种子样品,根据实验室条件,可利用种植观察法,亦可直接进行免疫学或分子生物学检测 种子样品制备;随机抽取待检瓜种300g左右,平均分成3份5份,将种子剥开(如利用灭菌的大 号指甲钳刀),或用微型粉碎机轻微破碎(至2/3以上种子破碎),加人适量pH7.0的0.01mol/儿磷酸 缓冲液或生理盐水,使种子完全浸设,室温振荡4h(100r/min左右),4C浸泡过夜 将浸泡液 1000 r/min离心1min,去沉淀,上清液10000r/min离心10min,弃上清液,取沉淀 用无菌水悬浮 制成1ml~2mL样品悬浮液,用于分离培养,免疫学检测以及分子生物学检测 8.2种植观察 种植观察法;取30000粒50000粒种子,或根据实际情况取适量种子,于2435最适 229),相对湿度70%以上,种植18d,观察症状 若观察到疑似症状,初步判定为阳性,再用免疫学、 分子生物学方法或分离培养方法检测 8.3免疫学检测 利用商品化ELISA检测试剂盒进行检测,按照说明书进行操作及结果判定 8.4分子生物学检测 8.4.1模板制备 植物样品及种子样品制备的悬浮液提取DNA后可按CTAB方法提取,也可使用商品化的DNA 提取试剂盒提取,提取核酸一20C保存)用于分子生物学检测 8.4.2PCR凝胶电泳检测 对于种子,以健康的瓜种子和带果斑病菌的瓜种子洗涤液作为阴性对照和阳性对照 对于植株样 品,以已知感染瓜类果斑病的植物病组织或标准菌株做阳性对照,用健康植物组织做阴性对照,用双蒸 水代替模板作为空白对照进行PCR凝胶电泳检测,具体检测步骤见附录B 8.4.3实时荧光PCR检测 检测步骤见附录C,对照设置见8.4.2 8.4.4锁式探针技术检测 检测步骤见附录D,对照设置见8.4.2. 8.5分离培养鉴定 用灭菌接种环蘸取8.1方法制备的样品悬浮液在半选择性培养基EBBA或TwZ上划线分离,同 时,将悬浮液进行10×梯度稀释3次,各取100L稀释液涂布培养皿,重复3次,28C恒温培养48h 挑取疑似菌落进行转接纯化,菌落形态特征参见附录A,再采用8.3或8.4方法进一步鉴定 结果判定 g.1植株样品 对于有典型症状植株样品,免疫学或分子生物学检测结果为阳性,即判定为检出瓜类果斑病菌 无
GB/T36822一2018 症状植株样品,免疫学或分子生物学检测结果阳性,分离培养鉴定为阳性,判定检出瓜类果斑病菌 其 中,分子生物学检测可根据实验室条件,选择8.4.2,8.4.3或8.4.4中的任意一种进行检测,任意一种检 测方法的结果为阳性则判定分子生物学检测结果为阳性 9.2种子样品 种子经种植观察有症状,且免疫学或分子生物学结果为阳性,即可判定该种子样品检出具有活性的 瓜类果斑病菌 对于种子样品的直接检测,免疫学或分子生物学检测为阳性,初步判定为检出瓜类果斑病菌,若分 离培养鉴定为阳性,确定种子样品检出具有活性的瓜类果斑病菌 其中,分子生物学检测可根据实验室条件,选择8.4.2,8.4.3或8.4.4中的任意一种进行检测,任意 -种检测方法的结果为阳性则判定分子生物学检测结果为阳性 10样品及检测结果保存 10.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存 对检出瓜类果斑病菌的样品应妥善保存,以备复核 该类 样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理 10.2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为瓜类果斑病菌的菌株,应妥善保存 可采用甘油保存或冻干保存 对 不需要长期保存的菌株应及时灭菌处理 10.3结果记录与资料保存 完整的实验记录应包括;样品来源、种类,时间,检测时间,地点、方法和结果等,并要有实验人员和 审核人员的签字 现场检疫发现的可疑症状等应及时拍照保存,PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照 片,分子生物学检测方法需有原始实验数据及相关结果图片
GB/36822一2018 附 录 A 资料性附录 瓜类果斑病菌其他信息 A.1名称与分类地位 中文名称;瓜类果斑病菌、西瓜细菌性果斑病菌,西瓜细菌性果腐病菌 英文名称:bacterialfruitblotech 英文缩写;BFB 分类地位;细菌城Bacteria,变形菌门Proteobacteria,p-变形菌纲Betaproteobacteria,伯克氏菌目 Burkholderiales,丛毛单胞菌科Comamonadaceae,嗜酸菌属Aeidoorar,西瓜种Acidoora.rcitrul 植株症状 A.2 西瓜、甜瓜在整个生育期均可被瓜类果斑病菌侵染,主要在子叶、真叶和果实上显症 子叶张开时 病叶背面出现水浸状,沿叶脉逐渐发展成黑褐色坏死斑,随后侵染真叶,水浸状斑周围逐渐形成黄色晕 圈,病斑沿叶脉发展成暗棕色角斑或不规则大斑 植株生长中期,田间湿度大,叶背面病斑处可见水浸 状,严重时叶正面也会出现不明显的褐色小病斑,对整株直接影响不大 苗期、生长期发病症状参见 图A.1及图A.2 图A.1苗期发病症状
GB/T36822一2018 图A.2田间植株发病症状 A.3果实症状 果实感病后,最初果皮上出现直径仅几毫米的水浸状斑点,随后迅速扩展呈暗绿色或褐色不规则边 缘的病斑 病原菌可透过果皮进人果肉,有时呈孔洞状,果实腐烂,有的病斑表皮龟裂,常溢出黏稠,透 明、琥珀色菌脓,严重时果实很快腐烂,并使种子带菌 西瓜果实发病症状参见图A.3,甜瓜果实参见 图A.4,籽瓜果实症状参见图A.5 图A.3西瓜果实发病症状
GB/36822?2018 ? ???? A.4 ?A.5????? A.4Χ ?Σ(Citrullu4slanatus)(Cucumismelo)??(Cucumissativws)?(Cucur ebo)???? bitamnoschata?(Cucurbita
GB/T36822一2018 A.5分布 亚洲:(河北、内蒙古、辽宁、上海、江苏,浙江、安徽,福建、江西,山东,湖南、广西、甘肃、宁夏、新 疆、台湾,印度尼西亚、伊朗、以色列、日本(本州、韩国、马来西亚(沙捞越),泰国、土耳其 北美洲:加拿大(安大略省,美国阿拉巴马州、阿肯色州,加利福尼亚州、特拉华州、佛罗里达州、佐 洽亚州伊利诺斯州印第安那州,爱荷华州、马里兰州、密西西比州、密苏里州、北卡罗来那州、俄克拉荷 马州、俄勒冈州、南卡罗来那州、德克萨斯州 中美洲及加勒比海地区;哥斯达黎加、尼加拉瓜 南美洲巴西(塞阿拉州,米纳斯吉拉斯、伯南布哥州、北里奥格兰德州、南里奥格兰德州罗赖马州 欧洲;希腊、匈牙利、意大利荷兰 大洋洲:澳大利亚(昆士兰州,北马里亚纳群岛、关岛 A.6病原菌形态及培养性状 瓜类果斑病菌为革兰氏阴性菌,菌体短杆状,大小(0.24m~0.84m)×(l.0um一5.0um),严格好 氧,极生单根鞭毛 在KB培养基上形成不透明,圆形,光滑、略有扇形扩展的边缘和突起的菌落,28C培养2d一3d 菌落直径可达1mm一2mm不产生荧光 在YTC培养基上菌落呈黄褐色凸起并边缘扩展为圆形的 菌落,28C培养5d直径可达2mm一3mm 在EBBA培养基中37C黑暗培养5d,其菌落直径约为 1.5mm2.0mm,微凸起、带有透明边缘的轻微扩展,菌落颜色呈绿色至蓝绿色 在TwZ培养基 228培养24h以上产生深红色、光滑、球形凸起的菌落
GB/36822一2018 录 附 B 规范性附录 PCR凝胶电泳检测 引物序列 B.1 BX-L1/BX-S-R2: BX-Ll5'-CAGCTGGGAGCGATCTTCAT-3' BX-S-R2:5'-GcGTCAGGAGGGTGAGTAGCA-3' SEQID4/SEQID5. sEQID4:5'-GTCATTACTGAATTTCAACA-3' SEQD55'-CCTcCACCAACCAATACGCT-3' B.2PCR反应体系 25AL 反应体系,PCRPr remiX 12.5L,H.O9.5AL,DNA模板1AL,20mol/儿引物各lAL B.3CR反应程序 Bx-L1/BX-SR2: 9C/5min;94C/30s,68.1C/30s,72C30s,35个循环;72C/8 C保存 min;4 SEQD4/SEQID5: 95/5min;95C/30s,53/30s,72C/30s,35个循环;72C/5 min;4 4C保存 不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整 B.4琼脂糖凝胶电泳 PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,凝胶成像系统观察、拍照 BX-L1/BX-S-R2引物对扩增 片段大小为279bp SEQID4/SEQID5引物对扩增片段大小为246bp B.5结果判定 阳性对照在预期大小位置产生明显条带,阴性对照及空白对照在预期大小位置未产生条带,若样品 出现与阳性对照大小一致条带,判定为阳性,否则为阴性
GB/T36822一2018 附 录 规范性附录) 实时荧光CR检测 C.1引物及探针序列 AC-FP;5'-CTGATAATcCCTcGGCTCAACAA-3' AC-RP5'-TGAGCGCATTTCTGAcGAG3' ACP;5'(FAM)-AAGAAATACGccCTcGCCAATCTCC-(BHQ1)-3' c.2实时荧光PCR反应组分及条件 5Al反应体系;荧光Rpremix12.5l,引物ACFP(I0mol/L)1l,引物ACRP(10pnol/L) lL,TaqMan探针AC-P(10nmol/L)0.5AL,模板1L,补充超纯水至25AL C3CR反应程序 第 一个循环为95C10min;随后40个循环,94C15s,58C1min. C.4结果判定 在阳性对照Ct值34,阴性对照和空白对照的C值之40前提下 如果检测样品的Ct值<35时,则判定为阳性; 如果检测样品的Ct值>40时,则判定为阴性; 如果35GB/36822一2018 附 录 D 规范性附录) 锁式探针技术检测 D.1用于检测瓜类果斑病菌的锁式探针序列 5'-CCGGCGGCACGGTGCAGTTTcCTGCTTTCTcGACCGTTAGCAGCATGACcGAGATGT ACcGCTATcGTcCTTAcGCTAGGTcGAG.AGTTCAAATTTTTGTCA-3' D.2锁式探针检测步骤 D.2.1探针的连接与外切酶处理 首先将锁式探针和待测目标DNA进行杂交,在TaqDNA连接酶的作用下,探针的两端通过与特 定的检测靶标物的DNA序列互补而结合,探针的5'末端和3'末端连成环状 采用核酸外切酶去除没 有形成环状的探针和错配的探针 连接反应液;20mmol/LTris-HCl,pH9.0,25mmol/LKAc,10mmol/LMg(Ac).,10mmol/I 9DNA连接酗lL背测DA模版,0 DTT,1mmol/LNAD,0.1%TritonX-100,2,4UTag pmol/I 探针P-a.a.c 连接反应程序;5C预变性面 min;然后进人循环,95笔变性30s,65C连接5min,反应共进行 20个循环;然后95C灭活15min ln 采用核酸外切酶切除自连和错连的探针;在连接后的产物中加人2U的核酸外切酶I和2U的核 酸外切酶川,37C反应0.5h,然后将反应后的产物95C灭活0.5h D.2.2探针的扩增 采用引物P1-F5'-ccGAGATGTACcGCTATcGT-3'和P2-R5'-TCATGCTGCTAAcG GTCGAG-3')对连接产物进行PCR扩增 扩增反应液:0.5mol/LP1-下和P2-R,4种dNTP各50mol/L,2.5AlL10×PCR反应缓冲液， 2mmol/1Mg*,2.5L.1%BSA,1.25UTaqDNA聚合酶,3.经核酸外切酶处理后的连接产物 扩增反应程序;94C预变性5min;然后进人循环,94C变性15s,60C退火60s,共40个循环;最 后72延伸7nmin 利用2.5%的琼脂糖凝胶电泳分析检测结果 D.2.3多重检测 将1L扩增产物探针点于尼龙膜上每个扩增产物重复1次,经紫外交联30、固定 将固定好的 膜放人杂交管中,加人预杂交液于杂交炉中42C预杂交1h,弃顶杂交液,将经地高辛标记的cZipeode 5'-ACTCTCGACCTAGCGTAAGG3')沸水浴中变性1min,迅速移至冰上,5min后加人预杂交液 中,42C杂交过夜后,用大量2×ssC,0.1%sDS室温洗膜2次,每次5min,再用0.5xssC,0.1%SDS 于68C洗膜2次,每次5min 洗膜后把膜加人洗涤液中洗膜2次,弃去,用封闭液封闭30min后,加 人用封闭液稀释了500倍的Anti-DGAP,轻摇30min 最后,将结合完抗体的膜用洗涤液洗膜2次 每次15min,加人检测液平衡3min,再加人NBT/IBCIP溶液,黑暗中静置显色2h,待观察到理想的显 1
GB/T36822一2018 色后,用无菌水浸泡10min终止反应,进行拍照 D.3结果判定 若膜上的地高辛标记显示信号(如图D.1)可判定为阳性,否则为阴性 图D.1样品在膜上的杂交信号 12
GB/36822?2018 ? E 淶?? E.1NA ? l.0g ? 3.0g ? 5.0g 10.0" 15.0 ? g 1000mL ?? pH7.2,?(121C,15min) E.2KB 20 ?? g 10g 1.5 ?? g 15 ? 1000ml ?? pH7.2,?(121C,15min) E.3EBBA 1g ? 0.2g ?? 0.2g ? 0.3g 0.25" ? 16g ? 1000ml pH?5.3~5.5,600A15mg/m????1nmL10mg/mLR? ?;121C15min?55C,?10mL.95%?,1ml250mg/mL ???1mL.10mg/mLù? E.4Twz ? 5g 0.25g ? ? 15g 13
GB/T36822?2018 1000mL ? ?,?50C?? 10m -80( 2mL ?Χ(25m/ml /mL 5mL С?(30mg/ mL 5mL ?(10mg/ 14
GB/36822一2018 参考文献 .andSen snsitiveDetectionofAcidoora.r [1]TIANY,ZHAOY,wALcoTTRR,etal.Reiable ci/ruliinCucurbitSeedUsi aPadlockProbe-BhasedAssay[].Plantdisease,2013,97(7):961-966 inga [2]QIANT,FENGJ,JIEH,etal.Selectivedeteetionofviableseed-borneAcidoorarcitrulli byreal-timePCRwith iummonoazide门.ScientificReports,2016,6:35457 preid [3]BAHARO,EFRANTM,HADARE,etal.Newsubspeciesspecificpolymerasechainreaction-based assayforthedeteetionoAeidowrdraeuesubsp.cirwli[],PlantPathoogy,2008,57:754-763. [4]sCHAADNw,sONGwY,HATZIILOUKAsE.PCRprimersfordetectionofplantpatho eciesofAciloora.r; genicspeciesand abpe ;US6146834[P],2000-1l1-l4. [5 WALCOTTRR,GITAITISRD,CASTROAC.RoleofBlossommsinWatermelonSeedIn- tetaionbyAeidrwraraenaesbsp.ciruli[].Phytopathology,2003,93()529-531

瓜类果斑病菌检疫鉴定方法GB/T36822-2018

1. 前言

瓜类蔬菜是我国常见的蔬菜之一，由于其口感清爽，营养丰富，深受广大人民群众的喜爱。然而，瓜类果斑病菌已成为一个严重的问题，它会导致瓜类蔬菜大量减产和质量下降。

2. GB/T36822-2018标准介绍

GB/T36822-2018《瓜类果斑病菌检疫鉴定方法》是中国农业部颁布的技术标准，旨在规范瓜类果斑病菌检疫鉴定工作，确保瓜类蔬菜无果斑病菌污染。

3. 瓜类果斑病菌的检疫鉴定方法

瓜类果斑病菌的检疫鉴定方法主要包括样品采集、传统鉴定方法、分子生物学鉴定方法。

3.1 样品采集

在进行检疫鉴定之前，必须首先进行样品采集。采集的瓜类应当是新鲜的，且植株上没有任何的病斑。采集时应避免对瓜类造成机械损伤，否则会影响后续的检测结果。

3.2 传统鉴定方法

传统鉴定方法主要采用形态学和生理学的特征辨识瓜类果斑病菌。通过观察它的菌丝、孢子形态等来进行判断。这种方法比较容易操作，但其准确性受到操作者经验及外界环境等因素的影响。

3.3 分子生物学鉴定方法

分子生物学鉴定方法是近年来发展起来的一种新型的检测技术。它利用PCR扩增技术，可以直接从样品中检测瓜类果斑病菌的基因序列，从而进行鉴定。这种方法准确性高，且可以在较短时间内得到结果，是一种非常有前途的检测技术。

4. 总结

瓜类果斑病菌给瓜类蔬菜种植带来了很大的影响，为了保护瓜类蔬菜的健康，我们需要对其进行检疫鉴定。GB/T36822-2018标准规范了瓜类果斑病菌的检疫鉴定方法，我们应当按照标准要求进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。

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