河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素、氯地孕酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法

河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素、氯地孕酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22962一2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素、 氯地孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationofaltren0gest，chlormadinoneresidues infugu，eelandbakedeel LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22962一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准负责起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、深圳出人境检验 检疫局 本标准主要起草人:康海宁,谢丽琪、肖来龙、赵琼晖、张建莹、庞国芳
GB/T22962一2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素、 氯地孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素(altrenogest)和氯地孕削chlormadinone)残留量的 液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氯地孕酮残留量的确证和定量测定 本标准方法检出限;烯丙孕素和氯地孕酮的检出限均为0.54g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度 第1部分:总则与定义 GB/T6379.1一2004,IsO5725-1:1994,IDT (GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一20o4,Iso5725-2;1994,IDr) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,IsO3696;1987,MOD 原理 试样在37C经过16h酶解后,采用乙晴提取试样中残留的烯丙孕素和氯地孕阴,提取液经乙腊饱 和正己婉脱脂、固相萃取柱净化 电喷雾离子化,液相色谱-串联质谱检测和确证,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇:色谱纯 4.2乙睛;色谱纯 4.3正己婉;包谱纯 甲酸:色谱纯 4.5乙酸铵;色谱纯 4.6氯化钠 4.7乙酸钠 4.8乙酸 4.g 8 -葡萄糖苷酸/硫酸酯酶;116300nit/ml 4.10乙酸钠缓冲溶液;0.2mol/L,pH5.2 称取16.4g乙酸钠(4.7)溶解于800ml.水中,用乙酸 4.8)调节pH值至5.2,用水定容至1000mL 4.11乙晴饱和正已烧取500ml正己烧(4.3),加人适量乙晴(4.2),充分振摇后,待两相分层，上层 即为乙睛饱和正己烧溶液
GB/T22962一2008 4.1220%乙睛水溶液:量取20mL乙睛(4.2)和80mL水,混合均匀 4.13样品定容溶液;量取50ml.乙睛(4.2)和50mL水,混合均匀,加人0.1ml甲酸(4.4),混合 均匀 4.140.005mol/L乙酸铵(含0.05%甲酸);准确称取0.3854g乙酸铵(4.5),用水溶解并转移至 1000mL容量瓶中,加人0.5mL甲酸(4.4),用水定容至刻度线 4 15标准物质:烯丙孕素(CAs.850-50-2)、氯地孕酮(CAS:302-22-7),纯度均大于99% 4.16标准储备溶液;分别称取适量的烯丙孕素和氯地孕酮标准物质(4.15),用甲醉(4.1)配制成浓度 为100mg/1的标准储备溶液，一18C以下避光保存 4. .17混合中间标准溶液I;吸取适量的各标准储备溶液(4.16),用甲醇(4.1)稀释成浓度为1.0mg/几 的混合中间标准溶液I,0C4C避光保存 4.18混合中间标准溶液I;吸取适量的各标准储备溶液(4.16),用甲醇(4.1)稀释,配制成烯丙孕索浓 度为1.5mg/儿L,氯地孕酮浓度为1.0mg/几的混合中间标准溶液I,0C一4C避光保存 4.19HLB固相萃取柱或相当者:60mg.3mL 使用前用5mL甲醇.5mL水活化,保持柱体湿润 4.20滤膜.0.2 Am 仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源(ESI) 5.2均质器 5.3旋涡混匀器 5.4恒温空气浴摇床 5. 固相萃取装置 5.6吹氮浓缩仪 5.7分析天平;感量0.1mg和0.01只 5. .8 移液器;l0AlL100AL和100L1000L 聚丙烯离心管:15mL和50mL,具塞 55 5. 10容量瓶;l00m和1000mL 55 .11离心机转速不低于5000r/min 试样制备与保存 试样制备 6 河豚鱼、鳗鱼取连皮的鱼肉,将皮、肉分离后取鱼皮置于微波炉中,加热后连同鱼肉、鳗鱼制品取所 有可食部分一并放人组织捣碎机均质,充分混匀,装人清洁容器内,并标明标记 制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 6.2试样保存 试样于-18C以下保存,新鲜或冷冻的组织样品可在2C6C贮存72h 测定步骤 样品提取 称取待测样品5.0g(精确至0.01g)于50mL具塞离心管中,加人10ml乙酸钠缓冲溶液(4.10). 30L葡萄糖苷酸/硫酸酯酶(4.9),旋涡振荡2min,置于37C恒温空气浴摇床中酶解16h 酶解后的 样品浒液冷却至室温后,加人10mL乙腊(4.2),旋涡混匀1min,在往复式振荡器上振荡提取minr 3000r/min离心5min,将上清液转移至另一50mlL离心管中 在残渣中加人10mL乙睛,重复提取
GB/T22962一2008 -次,5000r/min离心5min,合并乙睛层 在乙睛提取液中加人5g氯化钠(4.6),旋涡混匀1 min" 5000r/min离心3min 取上层乙晴层8m于15m离心管中,加人4ml乙晴饱和正己烧溶液 (4.l1),充分振摇,5000r/min离心3min,弃去上层有机溶液 再加人4ml乙睛饱和正已烧溶液,重 复上述操作一次 将经脱脂处理后的乙晴提取液置于45C水浴下吹氮浓缩至2ml,加水定容至 l0ml,待净化 净化 将7.1中所得溶液转人活化好的HLB固相萃取柱(4.19)中,以约3mL/min的流速使样液全部通 过固相萃取柱,弃去流出液 再分别用3ml20%乙晴水溶液(4.12)、3m水淋洗,弃去流出液,用真 空系抽干固相萃取柱15min 用3mL乙睛洗脱被测物于15mL离心管中,45C水浴下吹氮浓缩至近 干,用样品定容溶液(4.l3)溶解并定容至1.0ml,旋涡混匀后过0.2Am滤膜(4.20),用液相色谱-串联 质谱仪测定 7.3基质空白液和基质混合标准工作液的制备 称取阴性样品5.0g精确至0.01g)于50nml具塞离心管中,按7.1和7.2操作制备基质空白液; 混合标准工作液根据需要于使用前用基质空白液配制 测定条件 液相色谱参考条件 a)色谱柱:C色谱柱,1.7Am,50mm×2.1mm(内径)或相当者 b) 柱温:40C: 进样量.10l c) d 流动相流速及梯度洗脱条件见表1 表1流动相,流速及梯度洗脱条件 时间/min 流速/ml/min 0.005mol/I乙酸铵溶液(含0.05%甲酸/% 甲醉/% 0.0 0.30 50 50 5.0 0.30 20 80 95 6.0 0.30 6.1 0.3o 50 50 7.5 0.3o 50 50 7.4.2质谱参考条件 离子化模式:电喷雾离子源; a b)扫描方式:正离子扫描; 检测方式:多反应监测(MRM); 分辨率;单位分辨率 电喷雾电压:3000V e 辅助气流速;700L/h; 碰撞气:氲气; 幕帘气流速;50L/h; 离子源温度:105C; 辅助气温度:400C; 定性离子对.定量离子对,采集时间、锥孔电压及碰撞能量见表2 k
GB/T22962一2008 表2烯丙孕素和氯地孕酮测定的质谱参数 化合物名称 参考保留时间/min 母离子 子离子 采集时间/s 锥孔电压/V 碰撞能量/eV 227.1" 婚丙孕素 0.1 40 3.33 31l.1 269.2 8 309.2 16 氯地孕 3.64 405.0 26 301.3 20 为定量离子,对于不同质谱仪器,仪器参数可能存在差异,测定前应将质谱参数优化到最佳 7.4. 液相色谱-串联质谱测定 3 7.4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同试验条件下,样品中待测物质的保留时间 与基质标准溶液的保留时间偏差在士2.5%之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基 质混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较,偏差不超过表3规定的范围,则可判定为 样品中存在对应的待测物 以%表示 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 K一50 20GB/T22962一2008 以95%的可信度来计算 9. 2 重复性 在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,被测物的添加浓度 范围及重复性方程见表4 表4烯丙孕素和氧地孕酮的含量范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克 样品基质 重复性限，" 化合物名称 添加浓度范围 再现性限R 河豚血 lgr=0.9946lgm一1.065 gR=0.8883lg-0.6884 =0.72o -1.0303 烯丙孕素 鳗鱼 0.56.0 7602 2ln g！ lgR-0.8434lgm 烤毁 lgr=0.8043lgm一1.1958 uR- =0.6684lgm一0.703" 河豚鱼 0.7496lgm-0.8566 lgR=0.6634lgm一0.636" 氯地孕制 0.54.0 鳗鱼 lgr=0.8361lgm一0.8584 gR=0.8167lgm-0.5954 烤鳗 lgr=1.2612lg-1.0845 lgR=0.9505lg-0.6580 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.3再现性 在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,被测物的添加浓度 范围及再现性方程见表4，
GB/T22962?2008 ?A ?? ????MRM1)?? ?????????(MRM)???A.1 ?311.1/227.1 ?31l.1/269.2 100 100 3.63 -4" min min T T 3w4 3.00 4.00 405/309.2 405/301.3 100- 100 min mmin "ww"w ?A.1????????(MR)??
GB/T22962一2008 附 录B 资料性附录 回 率 收 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氧地孕酮的添加浓度及其回收率范围试验数据见表B.1 表B.1河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中烯丙孕素和氯地孕酮的添加浓度及其回收率范围试验数据 回收率范围/% 添加浓度/ 化合物名称 4g/kg 烤鳗 河豚鱼 鳗鱼 0,5 72.5105 63.678.5 82.6110 1.5 73.986.6 73.5~85.0 79.689.1 烯丙孕索 3.0 69.481.8 79.3~93.0 75.683.9 81.286 3 6.0 72.4~78.9 72.4一82.4 83.5~107 73.2l08 99，4118 1.0 81.0~101 80.6~80,5 81.2~105 氯地孕酮 8 2.0 81.996.7 86.795 81.187.0 4.0 90.8107 85.795.0 83.587.4