水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法

水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法

国家标准 GB/T22916一2008 水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测方法 ProtoeolofMuorogenieRT-PCRforvesieularstomatitisvirus 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22916一2008 前 言 本标准参考了世界动物卫生组织(OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册哺乳动物、禽鸟与蜜蜂)》 第5版) 本标准的附录A为规范性附录,附录B为资料性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口 本标准起草单位:深圳出人境检验检疫局、云南出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:花群义周晓黎、曾少灵、曹琛福、詹爱军,张彩虹、林庆燕、陈兵、杨云庆、孙洁
GB/T22916一2008 水泡性口炎病毒荧光RI-PCR检测方法 范围 本标准规定了水泡性口炎病毒荧光RT-CR检测的操作方法 本标准适用于动物及其产品中水泡性口炎病毒的检测 缩略语 下列缩略语适用于本标准 2.1荧光RT-CR 荧光反转录-聚合酶链反应 2.2C值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阂值时所经历的循环数 2.3RNA 核糖核酸 2.4DEPc 焦碳酸磷酯 2.5PBS 磷酸盐缓冲盐水(配方见附录A). 2.6Iaq酶 TagDNA聚合酶 2.7VSV 水泡性口炎病毒 原理 水泡性口类稍春属RNA梅毒.根据水泡性口炎病毒两型共有基因特定的序列合成一对特异性引 物和一条特异性的荧光双标记探针 通过严格设计和筛选的引物和探针,涵盖水泡性口炎病毒的两个 型和突变株,为水泡性口炎病毒的特异性通用引物和探针 探针的5'端标记FAM荧光素,它发出的荧 光能够被检测仪器接收,称为报告荧光基团;3'端标记TAMRA荧光素,它在近距离内能吸收5'端报告 荧光基团发出的荻光信号,称为淬灭荧光基团 在扩增时,Taq酶发挥它的5'-3'端外切核酸酶的功 能,将探针水解成单核苷酸,消除阻碍,标记在探针两端的报告荧光基团和淬灭荧光基团均游离于溶液 中,仪器检测到发出的荧光信号 材料与试剂 仪器与器材 荧光RT-PCR检测仪 4.1.2高速台式冷冻离心机离心速度12000r/min以上. 台式离心机(离心速度3000r/min) 4.1.4混匀器 4.1.5冰箱(2C~8C和一20C两种). 4.1.6微量可调移液器(5L. ,10AL,.100AL,1000L)及配套带滤芯吸头
GB/T22916一2008 4.1.7Ependor管a.5ml),透明薄壁PR管(0.2nml). 4.2试剂 4.2.1除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯,所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC 水处理后高压灭菌)分装 4.2.2三氯甲婉 4.2.3异丙醇:一20C预冷 4.2.4PBS;配方见附录A 4.2.575%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制,一20C预冷 4.2.6水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测试剂盒;组成、功能及使用注意事项参见附录B 4.2.7 引物.上游引物为'-ATcccTccTAcAGTTAAGc.AGAATcA?',下游引物为'-TGAAG TAATCAGCCGGGTATTC-3' 4.2.8荧光双标记探针(10mol/L);(FAM)5'-CGAAATTACCGGCCAACGAGGATC3'TAM AR) 扩增目标片段长度为97bp 抽样 5.1采样工具 下列采样工具应经121C士2C,15min高压灭菌并烘干 5.1.1 5 .1.2棉拭子 55. .1.3剪刀、银子 5.14注射器 5 1.51.5mLEppendorl管 .1.6研钵 5 样品采集 5.2.1采集的样品主要是口腔、蹄冠上的水泡上皮组织,水泡液、血液、口腔分泌物和组织 采集后立 即冷藏送检或放人含抗生素的PBS缓冲液中于4C环境中保藏 编号并作好记录 5.2.2水泡液及水泡皮;只有当水泡完整时才能采集到水泡液 水泡一旦出现很快就会破溃,所以要 不失时机地采集水泡液 首先用75%酒精轻轻消毒水泡表皮,尽量去掉污物,用灭菌生理盐水擦去酒 精,然后用无菌注射器穿刺水泡吸取水泡液,置于含抗生素的PBS缓冲液灭菌瓶中 55 2.3水泡液采取后,将水泡皮以无菌术剪下,放人含抗生素的PBS缓冲液中 若水泡已经破溃,则 只能采集破溃的水泡皮,用灭菌生理盐水涮洗掉水泡皮上的污物,放人上述缓冲液中 5.2.4口腔分泌物和咽喉拭子;用拭子采取口腔分泌物或将拭子深人口腔内来回刮3次一5次取分泌 液,拭子一并放人盛有1.0ml含抗生素的PBS缓冲液的1.5ml Eppendorf管中 也可用食道探杯刮 取咽喉液体,放人加有抗生素的PBSs中 编号,冷藏送检或低温保藏 5.2.5血液;用真空采血管或无菌注射器直接采取至无菌Eppendorf管中,密封、编号后保存于4C环 境中送检 5.2.6肌肉或组织脏器;无菌采集待检样品,装人一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号,冷藏送检或低 温保藏 3 样品贮运 5 样品采集后,放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品,放人一个塑料袋内),于保温箱中加冰、密 封,送实验室 5 样品制备 5.4.1水泡液、口腔分泌物、血液和精液 样品在混匀器上充分混合后,用高压灭菌锻子将拭子中的液体挤出,室温放置30min,取上清液转
GB/T22916一2008 人无菌的1.5mLEppendorf管中,编号备用 5. .4.2水泡皮、肌肉或组织脏器 取待检样品2.0g于洁净,灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加10mL Ps混匀4C下以300r/minm 离心15min, ,取上清液转人无菌的1.5mLEppendor管中,编号备用 5.5样本存放 制备的样本在2C~8C条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置于一70C以下,但应避免反 复冻融(冻融不超过三次) 操作方法 实验室要求 水泡性口炎病毒荧光RT-PCR检测的实验室分为三个相对独立的工作区域;样本制备区、反应混 合物配制区和检测区;各工作区域应有明确标记,避免不同工作区域内的设备、物品混用;每一区域应有 专用的仪器设备;进人各个工作区域应严格遵循单一方向顺序,即只能从样本制备区、扩增反应混合物 配制区至检测区 6.2样本的处理 在样本制备区进行 样品中总RNA提取的试剂盒,有商品化试剂盒出售,也可自行配制 6.2.2取n个灭菌的1.5mLEppendor管,其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的数量之和(阳 性对照,阴性对照在试剂盒中已标出),编号 6.2.3每管加人600A裂解液,分别加人被检样本、阴性对照、阳性对照各200L,一份样本换用一 个吸头,再加人200L三氧甲烧,在混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可以用 手颠倒混匀) 于4以12000r/min离心15min 6.2.4取与6.2.2相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管,加人500L异丙醇(一20C预冷),做标记 吸取6.2.3各管中的上清液转移至相应的管中,上清液应至少吸取500l,不能吸出中间层,颠倒 混匀 6.2.5于4C、以12000r/min离心15min(Eppendor管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒 去上清液,倒置于吸水纸上沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干);加人600L75%乙醇,颠 倒洗涤 6.2.6于4C、以12000r/min离心10min(Eppendor管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒 去上清液,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干 以4000r/'min离心10s(Eppendo管开口保持朝离心机转轴方向放置),将管壁上的残余液 6.2.7 体甩到管底部,小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀 -面,室温干燥3min,不能过于干燥,以免RNA不溶 各管加人lLDEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA.以2000 6.2.8 r/min离心5s,冰上保存备 用 提取的RNA应在2h内进行PCR扩增;若需长期保存应放置于一70C冰箱内 6.3检测 6.3.1扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行 从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶,在室温下融化 后,以2000r/min离心5s 设所需荧光RT-PCR检测总数为n(n=u十2十1),其中u为被检样品数、2 为阳性对照数、l为阴性对照数,每个样品测试反应体系配制见表1.
GB/T22916一2008 表1反应体系混合液的配制 序号 每管用量/a山l "管总用量/al 组 分 25 n×25 荧光RT-CR反应液(2×) Taq附 RT-PCR反转录酶颗粒 1/2(颗 n×1/2(颗) RNA酶抑制剂RNasin) n×1 ROX参考染料 1×l ROXreferencedye) 卫×12 DEPC水 12AL 6.3.2反应体系混合液分装 根据测试样品的总数(n),计算好各试剂的使用量,加人到适当体积的试管中,向其中加人n×1/2 颗)RT-PCR反转录酶颗粒,充分混合均匀,向每个PCR管中各分装40al,转移至样本处理区 6.3.3加样 在样本处理区进行 在各设定的PCR管中分别加人6.2.8中制备的RNA溶液10L,盖紧管盖 以500r/min离心30s 将PCR管放于96孔板上,一定要按顺序记录好被检样品管、阳性对照管阴性 对照管,转移至检测区 6.3.4荧光RT-CR检测 在检测区进行 将6.3.2中离心后的PCR管放人荧光RT-PR检测仪内,记录样本摆放顺 6.3.4.1 序 在96孔板内(表内)记录或填写被检样品(Unknown)、阳性对照(PC)、阴性对照(NTC) 设置探 针;5'为FAM,3'为TAMAR 6.3.4.2循环条件设置 -第一阶段,反转录42C/30min; -第二阶段,预变性92C/3min; -第三阶段,92C/10s,45C/30s,72C/1 lmin,5个循环; 第四阶段,92C/10s,60C/30s,40个循环,在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光 试验检测结束后,根据收集的荧光曲线和C值判定结果 结果判定 7.1结果分析条件设定 直接读取检测结果 基线和阂值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阂值线刚好超过正常阴 性样品扩增曲线的最高点为准 7.2质控标准 7.2.1阴性对照无C值,并且无扩增曲线，一直为水平线 7.2.2阳性对照的C'值应小于28.0,并出现典型的扩增曲线,2个阳性对照扩增曲线基本重合,否则 此次实验视为无效 7.3结果描述及判定 7.3.1阴性 无c'值并且无扩增曲线,表示样品中无水泡性口炎病毒 7.3.2阳性 C！值小于等于30.0.且出现典型的扩增曲线,表示样品中存在水泡性口炎病毒 7.3.3有效原则 C值在30.035.5的样本建议重做 重做结果无C值或大于35.0者为阴性,否则为阳性
GB/T22916?2008 ?A 淶?? ? A.1A? 0.2mol/??;(NaHPOH.O)27.6g,?,? l000ml A.2B? 0.2nmol/L??;(Na,HPO7H,O)53.6g(NaHPO12H,O 71.6g,NaHPO2H,o35.6g),???,?1000m A.30.01molLpH7.2λ?(PBs) ?A?14ml,B?36mL,?(NaCI)8.5g,???1000ml121C15minm ?,?,?°?1000IUù1000gù?
GB/T22916一2008 B 附 录 资料性附录 试剂盒的组成 B.1试剂盒组成 每个试剂盒可做48个检测,包括以下成分 裂解液 30mL×1盒 DEPC水 2mL×1管 RT-PCR反应液(内含水泡性口炎病毒的引物、探针) 750AlX1管 RT-PCR酶 2颗粒×12管 Taq酶 12LX1管 阴性对照 lmL×1管 阳性对照(非感染性体外转录RNA) 2mL×1管 ROX参考染料(ROXreferencedye 0.1mL×1管 B.2说明 B.2.1裂解液的主要成分为异硫氮酸呱和酚,为RNA提取试剂,外观为红色液体,于4C保存 B.2.2DEPC水是用1%DEPC处理后的去离子水,用于溶解RNA B.2.3RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子 B.3功能 试剂盒可用于动物组织样品(包括水泡皮、水泡液、组织,脏器、分泌物、血液等)中水泡性口炎病毒 的检测 B.4使用时的注意事项 B.4.1在检测过程中,应严防不同样品间的交叉污染 B.4.2反应液分装时应避免产生气泡,上机前检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器 B.4.3RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活,应在室温条件下置于干燥器内保存,使用时取出所需数量,剩 余部分立即放回干燥器中