烟草及烟草制品转基因检测方法

烟草及烟草制品转基因检测方法

国家标准 GB/T24310一2009 烟草及烟草制品转基因检测方法 Tobaccoandtobaccoproducts一 Deteetingethodofgeneticallmoaifiedorganismcontents 2009-09-30发布 2009-12-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T24310一2009 前 言 本标准的附录A、附录B,附录C,附录D,附录E附录F为规范性附录,附录G为资料性附录 本标准由国家烟草专卖局提出 本标准由全国烟草标准化技术委员会(SAC/Tc144)归口 本标准起草单位:烟草进出口烟叶检测站、深圳出人境检验检疫局 本标准主要起草人:郭兆奎、陈枝南、冯茜、万秀清、颜培强、李丽杰、乔蝉、孙宏宇
GB/T24310一2009 烟草及烟草制品转基因检测方法 范围 本标准规定了烟草种子、鲜烟叶、初烤烟、片烟和卷烟烟丝进行转基因成分检测的样品取样方法和 实验室检测方法 本标准适用于烟草及烟草制品转基因成分检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T5606.1卷烟第1部分;抽样 GB/T19616烟草成批原料取样的一般原则 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 转基因烟草enetealymodifieltobao 通过基因工程技术或现代生物技术改变基因组构成的烟草 3.2 小样 inerement 在一个取样单位一次取出的一定数量的烟草,构成单样的一部分 [G;B/T19616一2004,定义2.6] 3.3 样品sample 从一个群体中选取的一个或多个具有代表性的样本单位 实验室样品laboratorysample 用于实验室检验或测试的样品,其代表总样 [GB/T19616一2004,定义2.10 o 检测样品testsample 实验室样品经过研磨和匀浆(如果需要)处理后进行分析测定的样品 3.6 聚合酶链式反应扩增polmeraseehainreaetion amplifieation PCR扩增 模板DNA序列在含有4种脱氧核糖核酸(aNTP),引物.DNA聚合酶等的反应体系中,在仪器中 通过多次的高温变性、退火和延伸的循环过程,最终使目标DNA片段以几何倍数扩增
GB/T24310一2009 nestedPCR 巢式CR PCR扩增过程中,首先用一对外引物进行第一轮PCR,然后以第一轮PCR扩增产物为模板,使用 第一对引物扩增的DNA序列内部的一对引物再次扩增 3.8 semi-nestedPCR 半巢式PCR PCR扩增过程中,首先用一对外引物进行第一轮PCR扩增,然后以第一轮PCR扩增产物DNA做 为模板,使用该模板DNA序列内部的一个引物及第一轮扩增中的一条外引物进行第二次PCR扩增 3.9 实时定量CR扩增realtimePCRamplifieatiom 在PCR反应体系中加人荧光探针或荧光染料,利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程,最后通 过标准曲线对未知模板进行定量分析 3.10 看家基因howsekeepng gene 细胞或生物体整个生命过程中都持续需要而且必不可少的组成型表达基因 3.11 阳性对照样品psitivecontrosample 经鉴定为含有检测目标成分的对照烟草样品 阴性对照样品negativecontrolsample 经鉴定为不含有检测目标成分的对照烟草样品 3.13 试剂对照样品reagentcontrolsample 检测过程中与样品一起进行各种检测操作的试剂参照样品 3.14 提取空白对照样品extraetionblankcontrolsample 样品DNA提取过程中放置在操作区内的开盖的空白参照样品 3.15 特异性speeificity 特异地检测某种物质,并可将其与相似物质,杂质或降解物分辨开来的能力 实验室要求 4.1样品重复检测 每个待测样品随机分成两份,每份单独进行DNA提取和PCR分析 2 对照样品 4. 每次试验中均设置阳性对照阴性对照、试剂对照及提取空白对照 在定性检测时选用0.1%阳性 作为阳性对照;定量检测时设置0.1%,0.5%、1.0%、2.0%、5.0%阳性对照建立标准曲线 4.3防止污染 样品准备、样品前处理,DNA提取、PCR反应液加样,PCR扩增和电泳与凝胶观察等操作在相互隔 离并具有100%外排风的不同操作间中进行,并设置紫外灯,操作前后进行空间过夜照射 样品研磨在 强力通风橱中进行,每个样品更换一次塑料手套;样品的称量应设专用天平,不可在称量试剂的天平室 内进行;用于提取DNA和PCR扩增的耗材用具使用前都应进行灭菌处理,tip头和各种离心管一次性 使用 2
GB/T24310一2009 4.4安全防护 整个试验操作过程中必须穿着工作服和佩戴手套,特别在接触EB时应带抗化学腐蚀的手套及 口罩 4.5有毒废弃物处理 4.5.1含EB的电泳液 处理方法见附录A 4.5.2含EB的凝胶 含有EB的废凝胶暂存于广口瓶中,定期放人生物危害焚烧炉中进行焚烧处理 试剂 除非特别说明,检测中仅使用分析纯化学试剂和超纯去离子水,PCR反应体系用水应使用电阻率 C 为18.2MQcm以上的超纯水 各种缓冲液均冷藏于4C冰箱,各种酶和抗生素母液冻存于一20 以下冰箱 5.1十二烧基硫酸钠(sDs). 5.2乙二胺四乙酸钠(EDTA) 5. 3 十六婉基-二甲基-乙基-溴化铵(CTAB) 5.4Tri、碱 5.5 Tris-HCL 5.6聚乙烯毗咯烧酮(PVP). 5.了 液氮 5.8 三氨甲婉 5. 异戊醇 55 .102颈基乙醇 乙醇 碉酸 55 5." 氢氧化钠 5 琼脂糖 15 误厨蓝 1s 二甲苯青F 17 说乙能 18 冰醋酸 9 55 澳乙锭(EB). 5.20N.C. 5 MgCl .21 .22DNA聚合酶 52310XPRCR缓冲液 5.24尿喘嚏DN八糖基酶(UNG脖》. 5.25dNTP液(dATP.cTP.dcTP各么.百mmolL.dUTP5mmalL. 5.26DNA标准分子量 55. 27限制性内切酶(Xmnl,EcoRv、NsiT. 55 .28sYBRGreenI染料 仪器设备 PCR仪(控温精度士0.3C)
GB/T24310一2009 6.2紫外分光光度计(波长精度0.31 nm 6.3荧光定量PCR仪(控温精度士0.4C 6.4电泳系统(50V600V,10mA400mA. 6.5紫外分析仪(检测灵敏度:Protein>0.02ngDNA>0.05ng). 6.6恒温水浴锅(精度士0.1C) 6.7高速冷冻离心机(最大离心力30000g) 6.8微量离心机(最大离心力20000g) 6.9pH计精度士0.02pH或士2mA 6 10 分析天平感量0.0001g) -86C 6.11超低温冰箱(一40C 6 12 微量移液器(10L20L50L、100L、200L、1000L,精度<0.8%1.0%. 6 3 超纯水器(电阻率18.2MQ m 磁力搅拌器(转速0~2000r/min) 14 6 超净工作台[截流效率;99.9999%,层流风速;0.45m/s(90fpm)] 6 1 6 16恒温干燥箱(30C一300C,温度波动士1%,控温精度士1%) 取样 种子 以品种和种子产地为取样单位,即每个品种作为一个样品,对虽为同一品种,但供种单位(种子产地 来源)不同,也作为单一样品取样,每一样品随机多点取样10g,样品编号注明品种名称、种子产地 7.2鲜烟叶 鲜烟叶样品在田间取样,以品种和种子产地为取样单位随机取样,每个样品在10个不同地块各取 个嫩芽或叶片，编号注明品种名称、种子来源,取样地点,取样单位,取样人、日期等信息,自然失水2d 后放人塑料袋中 7.3初烤烟 以检验批为单位,每检验批的产地和等级应是相同的,50件以下随机选2件各取1个小样,51件 100件取4个小样,101件150件取5个小样,151件一200件取6个小样,200件以上每增50件(不足 50件按50件计)增取1个小样,各小样混合后用四分法缩分出均匀样品2份(每份250g)作实验室样 品供检验和复检,实验室样品应密封并填写标签,注明产地、等级报验号,送样单位、取样人 片烟 对于已装箱的片烟.以箱(内装100kg烟叶)为取样单位.用长筒状取样器,每箱随机取约2g烟 叶,将每个集装箱的99箱烟叶所取的近200g烟叶作为一个检测样品;也可在复烤加工车间,结合水分 测定取样,注明烟叶产地、等级和箱号,取样地点、送样单位和取样人 7.5卷烟 按照GB/T5606.1中规定的方法进行卷烟抽样 烟叶样品DNA提取方法 8.1样品前处理 种子 随机取烟草种子样品放人装有滤纸保湿的培养皿中,28C光照下培养7d,用滤纸吸出表面水分 称种子萌发幼苗质量约900g,在灭菌的研钵内加液氮研磨呈粉末,分别装人3个已知质量的15mL 离心管中,再称量,置一20C冰箱中储存备用
GB/T24310一2009 8.1.2鲜烟叶 随机取鲜叶样品约900mg,在研钵内加液氮(5.7)研磨成粉末,转人称量的3个1.5ml离心管中 称量确定叶片组织质量 8.1.3烤后烟叶 随机取烟叶样品约20g,用硫酸纸包好,置方盘加盖后,40C恒温干燥箱6.16)中过夜使其干燥， 在灭菌的研钵中研成粉末,存于20mL离心管中,从中取约60mg分别放人两个1.5m离心管中 8.1.4卷烟 随机取卷烟50支,去除卷烟纸,滤嘴,将烟丝按8.1.3方法前处理 DNA提取 方法见附录B DNA产量和纯度测定 8. .3 方法见附录C 转基因烟草定性检测方法 首先进行共有序列标志的PCR扩增,再通过巢式PCR,限制性内切酶酶切和目的基因序列扩增方 法进行验证,确定所转目的基因的种类 共有序列标志的CR扩增 9.1.1CR引物 用于转基因烟草检测共有标志主要有;花椰菜花叶病毒35S启动子、根癌农杆菌nos终止子和编码 卡那霉素抗性基因(NPTI),根据这些核甘酸序列设计PCR引物进行烟草转基因检测 9.1.1.135S启动子序列扩增 35S-1:5'cCTACAAATGcCATCATTGCG3" 35s-2;5'GGGTcTTGcGAAGGATAGTG3” 该引物的扩增片段长度为205bp,作为转基因烟草检测的标志,确定花椰菜花叶病毒35S启动子序 列的存在 9.1.1.2nos终止子序列扩增 NOS-1:5'GATTGAATCCTGTTGCCGGT-3” NOS-2:5'GTAACATAGATGACACCGCG-3’ 该引物的扩增片段长度为213bp,作为转基因烟草检测的标志,确定来自根癌农杆菌的终止子序列 nos的存在 g.1.1.3NPr基因序列扩增 NPT-l:5'GCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGC-3’ NPT-2:5'GCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGA-3” 该引物的扩增片段长度为41lbp,作为转基因烟草检测的标志,确定卡那霉素抗性基因NPTI序 列的存在 g.1.2PCR扩增体系 见附录D 9.1.3PCR扩增条件 见附录D. 9.1.4电泳及凝胶观察 称琼脂糖(5.14)溶于0.5倍TBE缓冲液(第E.10章)中,制成1.5%凝胶,加EB(0.5g/ml)待 温度降至55C左右时倒人放有梳子的凝胶模具中,冷凝后拔出梳子,放人水平电泳槽中,取10l扩增 产物加澳酚蓝上样缓冲液(第E.11章)点样,加DNA标准分子量标记(5.26)电泳(6.4),紫外分析仪 6.5)观察电泳结果
GB/T24310一2009 9.2特异性基因序列的PCR检测 在烟草上进行过转基因研究的主要有烟草普通花叶病外壳蛋白基因(TMV-ep),黄瓜花叶病毒外 壳蛋白基因(CMV-cp),马铃薯Y病毒外壳蛋白基因(PVY-ep)、TMV和PVY病毒复制酶基因和苏云 金杆菌杀虫蛋白(BT)等基因,根据这些目的基因序列,设计引物用于阳性样品的目的基因鉴定 9.2.1烟草普通花叶病外壳蛋白基因TMIV-ep TMV15'-GTGTTCTTGTCATCAGCGTGGGC-3’ TMV25’-CACCGTTGCGTCATCTACTCTACG-3” 其PCR扩增产物片段长度为327bp 9.2.2黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因CMv-ep CMV15'-ACCCAACCTTTGTAGGGAGTGAGCG-3’ CMV25’-ACATAGCAGAGATGGCGGCAACG-3” 其PCR扩增产物片段长度为264bp 9.2.3马铃薯Y病毒外壳蛋白基因PVY-cep PVY15'-GATATTTCAAATACTCGGGCA-3 PVY25'-GCATAACGCGCTAAACCCAT-3” 其CR扩增产物片段长度为362bp. 9.2.4TNMIV复制酶基因TMIV54KD T54D15'-GAGTTGTCTGGCATCAT'TGA-3 T54D25'-ACAATGGTCAAAGCCGGGTA-3” 其PCR扩增产物片段长度为296bp 9.2.5wY复制酶基因wY-nmih PvYnib15'-GcTccGGTGTAAGGAGAAGA-3 PVYnib25'-GtGAGcCATCcAGcCATCACAG-3" 其PCR扩增产物片段长度为230bp 9.2.6苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt-eryIAe) BT15'-CAGTTTcTGcTCAGcG.AGT-3” BT25'-GCTGAGGTGAAGATTAGcTG-3 其PCR扩增产物片段长度为381bp 9.2.7黄瓜花叶病毒微卫星NACMVsatRNA CMVsatl5'-CTGcGTGATGATcCTTCACT-3” CMVsat25-TTCAcGGAGATCAGCATAGC-3” 其PCR扩增产物片段长度为322bp 9.2.8豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpI eptil5'-TTGCTTGAACCACCTCGGAACT-3’ epti25'-CTTGCC'TGGCATTGATCGTGTA-3’ 其PCR扩增产物片段长度为196bp 9.2.9草甘膜耐药基因EPSsP(5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶) EPSP15’- -3” -tccagccatccgcgaacaag EPSP25’ -3” -agcagcggcggaatcagcat 其PCR扩增产物片段长度为265bp 上述各种引物(9.2.1~9.2.9)PCR扩增体系和条件见附录D 9 结果验证试验 对于35S启动子和nos终止子序列引物的PCR扩增均未出现阳性条带的样品,进行巢式或半巢式
GB/T24310一2009 PCR扩增,以提高检测的灵敏度,若仍没有扩增产物,可确定该样品为阴性,不含转基因烟草成分;对于 35S启动子和(或)nos终止子序列引物的PCR扩增同时或有一种出现阳性条带的样品,重新提取 DNA,重复前述PCR检测排除污染,同时进行巢式PCR扩增和限制性内切酶酶切反应排除非特异性 扩增的可能 巢式或半巢式CR反应验证 将第一次扩增的产物(引物为35S-1和35S-2或NOS-1和NOS-2)加超纯水稀释100倍,取1L作 为第二次扩增的DNA模板,以下列引物进行第二次扩增,扩增体系与扩增条件见附录D 9.3.1.135S巢式PCR 35S35’GATTGTGCGTCATCCCTT-3” 35S45’ACAGTGGTCCCAAAGATGGA 扩增产物片段长度为127bp 9.3.1.235S半巢式PCR 35Ssnl5'-CTACAAATGCCATCATTGCG-3” 35Ssn25'-GATAGTTGGGATTGTGCGTCA-3” 扩增产物片段长度为192bp 9.3.1.3ns终止子巢式CR NOSnl5'-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3” NOSn25'-cccATcTcATAAATAAcGTc-3" 扩增片段长度为104bp 9.3.2限制性内切酶酶切反应验证 应用该验证方法前提条件;PCR扩增过程中,将CR扩增体系中的dNTPs液中的“dUTP”替换成 dTTP”",浓度为2.5nmmol/儿 9.3.2.1CR产物的纯化 PCR扩增产物凝胶电泳后,紫外观察,并选择特异性条带用锋利刀片切下,应用凝胶中DNA回收 试剂盒回收特异性PCR扩增条带(DNA 9.3.2.2酶切反应 9.3.2.2.135S启动子 对于出现35SPCR扩增条带的回收样品,采用限制性内切酶EcoRV对扩增产物进行酶切分析 方法是先将PCR扩增产物纯化,加限制性内切酶EcoRV5U,35SPCR扩增产物10L,限制酶2倍体 积的酶切缓冲液配制酶切反应液,37C恒温水浴中酶切3h后,以酶切前后的DNA进行1.6%琼脂糖 电泳,紫外分析仪观察胶片上的条带,若为35S特异PCR扩增产物,其205bp片段被酶切成152bp和 53bp两个片段 9.3.2.2.2nos终止子 对于nos引物PCR反应呈阳性的回收样品,利用限制性内切酶Nsil可将213bp的片段切成126bp 和87bp的两条片段,反应条件同35S启动子扩增产物的酶切反应 3.3扩增产物的测序验证 9 将PCR扩增条带切胶回收测序,排除非特异性扩增 转基因检测控制 凡出现PCR特异条带亮度(或荧光信号)等于或高于0.1%参比对照的样品确定为阳性,有扩增条 带,且亮度(或荧光信号)弱于0.1%的样品要重新提取DNA,重复上述检测 10 转基因烟草定量检测 选择35S启动子或nos终止子进行荧光定量PCR检测(6.3)
GB/T24310一2009 10.1TaqMan探针荧光定量PCR检测法 10.1.1靶序列引物和TaqMan探针 35s启动子靶序列引物:35SF;5'-GTcTTGcGAAGGATAGTGGGA-3 35SR:5'-CACGTCTTCAAAGCAAGTGGA-3” TaqMan探针;35STMP;5'-TGCGTCATCCC'TTACGTCAGTGGAGAT-3 nos终止子靶序列引物;nosF;5'-AGGATTCAATCTTAAGAAAC-3” nosR:5'-GGATCTCATGCT(GGAGTTCT-3” TaqMan探针:nosTMP:5'-ATGTTTGAAcGATcGG-3’ 上述靶序列TaqMan探针的荧光标记为5'FAM&.3'TAMRA 10.1.2看家基因引物和IaqMan探针 引物;NRF5'-TGrCcATGAACAGATGGCTcTAAcTcT-3” NRR5-TACCTTGATTACTCGTCGAGTGAAGA-3’ -3” TaqMan探针:NRSTMP5'-ATTCcCTTTTTTAATCATTTGAAGGTACTCATTTTTTTcG 荧光标记为5'TET&.3'TAMRA 10.1.3反应体系 见附录F 10.1.4反应条件 见附录F 10.2sYBRGreenI荧光染料实时定量PCR检测法 10.2.1靶序列引物 同10.1.1中35S启动子,nos终止子和nos终止子与NPT交界处靶序列引物 10.2.2反应体系 见附录F 10.2.3反应程序 见附录F 10.3标准曲线的建立 10.3.1相对含量标准曲线的建立 利用5种已知含量的标准物(含转基因烟草5%、2%、1%,0.5%和0.1%)进行荧光定量PCR反 应,建立转基因成分相对含量与PCR反应Ct值(有看家基因同时扩增时应用看家基因与目标基因的 ACt值)之间的标准曲线和回归方程 10.3.2绝对含量标准曲线的建立 通过标准物的碱基数和紫外分光光度计(6.2)oD确定标准物的拷贝数,设置不同拷贝数的标准 模板进行荧光定量PCR反应,建立粑序列拷贝数与Ct值(或ACt值)之间的标准曲线 10.4样品阳性含量的分析 各样品的阳性含量根据该样品的Ct值(或ACt值)和标准样品所建立的标准曲线和回归方程进行 计算 11 转基因烟草检测验证标准 11.1DNA提取物的浓度与纯度 DNA提取物浓度>100ng/L DNA提取物纯度l.7OD260/OD280<1.9
GB/T24310一2009 11.2检测过程 11.2.1定性检测 PCR反应中提取空白对照、阴性对照和PCR试剂对照无扩增条带,0.1%含量的阳性出现明显的 特异性条带 酶切验证试验中,阳性对照扩增产物的酶切反应完全,待测样品酶切产物长度正确 11.2.2定量检测 同时满足以下条件,扩增结果方可接受 提取空白对照、阴性对照和PCR试剂对照Ct>40; 回归方程的相关系数达到0.95以上; 阴性样品C值大于0.1%样品的Ct值 所有阳性标准参比Ct值重复操作的CV变异系数)<15%; 待测样品C值重复操作的CV变异系数)<20%， 12 检测报告 检测报告应包含以下信息;送样单位与送样人;取样地点与样品产地;检测样品的种类与状态;生产 年度;收样日期;检测标记及所用的验证反应;所提取样品DNA的浓度和纯度;几种对照的表现;烟草 转基因检测结果报告单的样式参见附录G 检测报告应详细记录所测结果,也应该说明非本标准规定或被认为是可供选择的所有操作细节以 及可能影响检测结果的任何细节 检测报告应包括确认样品所必需的所有资料
GB/T24310一2009 附 录A 规范性附录 含EB电泳液的处理方法 A.1将溴化乙锭(EB)溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/mL A.2加人一倍体积的0.5mol/1KMnO溶液,混匀,再加人等量的25nmol/LHCI,混匀,置室温数 小时 A.3加人一倍体积的2.5mol/LNaOH溶液,混匀并废弃 10
GB/T24310一2009 B 附 录 规范性附录 各类样品的NA提取方法 B.1种子 B.1.1取液氮研磨后的粉末约300mg加人300l2×CTAB提取缓冲液,充分混匀后在65C中水 浴10min B.1.2加人等体积的三氯甲烧/异戊醉(24:1,体积分数),混匀后在1200og离心4min B.1.3取上清液,加十分之一体积的10xCTAB提取缓冲液,加人等体积的三氯甲烧/异戊醇(241. 体积分数),混匀后在12000g离心4min. B.1.4取上清,加等体积CTAB沉淀缓冲液,混匀后在15000g下离心8min B.1.5去上清,沉淀加l00L高盐TE,65C水浴10min. B.1.6加人两倍体积的冷无水乙醇(一20C冰箱贮存),一40C冷置30min B.1.715000g离心8min,沉淀溶于70L超纯水中 B.2鲜烟叶 DNA提取方法同第B.1章 B.3烤后烟叶(烟丝 B.3.1向内盛60mg左右待测样品的1.5mL离心管中,加人450AL超纯水,250L2xCTAB抽提 缓冲液,振荡混匀后,65C的恒温水浴10n min B.3.2加700l三氯甲炕/异戊醇(24;l,体积分数,混匀后在12000g离心5" min B.3.3取上清液,加十分之一体积的10%CTAB提取缓冲液,加人等体积的三氧甲婉/异戊醉(24;1. 体积分数),混匀后在12000g离心5min. B.3.4取上清,加等体积的CTAB沉淀缓冲液,混匀后在15000g离心8min. B.3.5去上清,加100AL高盐TE缓冲液,65C水浴10" mln B.3.6加人二倍体积冷无水乙醇,于一40C冷置30min B.3.715000g离心8min,弃上清,沉淀溶于50AL超纯水中 1l
GB/T24310一2009 c 附 录 规范性附录 DNA提取物的浓度和纯度的测定方法 C.1紫外区波长扫描 C.1.1姻叶DNA提取物的产量和纯度用紫外分光光度计220nm和320nm之间的波长扫描来估测 C.1.2用超纯水将紫外分光光度计调零,校正基线 C.1.3将10ALDNA提取液加人比色皿中,加超纯水1990L后,移液器抽打混匀,进行220nm~ 320nm波长扫描 C.1.4提取的DNA产量以260nm下的吸光值来计算,OD值为1相当于每毫升溶液中含有50g双 链DNA c.1.5DNA提取物纯度用OD260/280的值来估算,比值在1.7~1.9为纯度较好,比值大于1.9提取 的DNA中含RNA,比值小于1.7提取液中含一些蛋白质等杂质,要重新提取DNA 硝酸还原酶基因序列CR扩增 提取DNA的质量可通过对其进行烟草内源硝酸还原酶基因序列扩增来判定,引物序列为: NR-15'-GTGTCATGAACAGATGGCTC-3" NR-25’-GATTACTCGTCGAGTGAAGA-3” 扩增片段长度为104bp 12
GB/T24310一2009 D 附 录 规范性附录 烟草转基因检测PCR扩增体系与扩增条件 D.1PCR扩增体系 按每50pL反应含DNA聚合酶1U.UNG酶1u(巢式PCR中不加).上行和下行引物备 25pmol,dNTPs1L,10×PCRbufer5L,根据所作扩增的管数,计算出各组分应加的总体积,配母 液混匀后,再分装至各个0.25mL扩增管中,然后根据所测得的OD按60ong加人DNA模板 D.2PCR扩增条件 采用下列循环程序进行扩增 热启动UNG酶;50C,5min(巢式PCR去除此步) 预变性:95C下5min 循环设定;变性94C30s 退火45s(温度见表D.1 延伸72C45s 循环次数:35个循环 后延伸:72C5 min 各种PCR引物的退火温度见表D.1 表D.1各种PCR引物的退火温度 引物 退火温度/c 退火温度/C 引物 NR1-NR2 CMVibl-cMVNib2 61 62 35S1-35S2 64 B;T1-BT2 63 NOSs1-NOS2 63 CMVsatl-CMVsat2 64 64 NPT1-NPT2 65 CMVmpl-CMVmp2 64 TMV1-TMV2 64 CPTl1-CPTI2 64 CMV1-CMV2 64 EPSP1-EPSP2 PvY1-PvY2 63 35S3-35S4 62 T54D1-T54D2 35SSnl-35SSn2 63 63 s4 62 PVYNib1-PVYNib2 NOSnl-NOSn2 13
GB/T24310一2009 附录E 规范性附录 溶液的配制 E.1EDTA溶液(1000mL,0.5mol/L,pHH8.0) 准确称量186.1【乙二胶四乙酸纳溶于800ml超纯水中 磁力搅拌,滴加12mol/LNaOH调pH至8.0 定容至1000ml 121C灭菌15min,4C冰箱中保存,每3个月重新配制 E.2Iris-HCI缓冲液(1000mLpHH8.0 准确称量121gTris碱溶于900mL超纯水中 加浓盐酸(11.6mol/L)约46ml 调pH值至8.0 超纯水定容至1000ml E.3IE缓冲液(100mL.10mmol/L,pl18.0) 100mLTris-HCI缓冲液中加人200aLEDTA溶液(0.5mol/LpH8.0),4C冰箱中保存 E.42xCTAB提取缓冲液(100ml 称取2gCTAB、8.1816gNaCl、lgPVP并加人60mL超纯水磁力搅拌使其溶化. 加人20mL0.5mol/LTris-HC缓冲液(pH8.0). 加人4m0.5mol/LEDTA(pH8.0) 定容100mL,4C冰箱中保存 E.510xcTAB缓冲液(100mL) 称取10gcTAB,4.0908gNaCl 加人80ml超纯水,磁力搅拌使其溶解 定容100ml,4C冰箱中保存 E.6cIAB沉淀缓冲液(100mL 称取1gCTAB加人80ml超纯水,磁力搅拌使其溶解 加人10mL0.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0) 加人2ml.0.5mol/LEDTA(pH8.0) 定容100mL,4C冰箱中保存 高盐TE缓冲液(100mL) 称5.844gNaCl,加80mL超纯水搅拌溶解 加2ml0.5mol/1Tris-HCl缓冲液(pH8.0) 加200AL0.5mol/IEDTA(pH8.0). 定容100mL,4C冰箱中保存 14
GB/T24310一2009 E.8三氯甲烧/异戊醇(24:1,体积分数 量取96ml三氯甲烧和4ml异戊醉加人100ml广口瓶中 摇匀后,分装在3个广口瓶中 4C冰箱中保存 E.950×TAE 称取Tris碱242g、冰乙酸57.1mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL 超纯水定容1000ml,4C冰箱中保存 E.105×TBE的配制 称取Tris碱54g、棚酸27.5g,0.5mol/IEDTA(pH8.0)20ml 超纯水定容1000mL,4C冰箱中保存 稻释5倍为1xTBE,稀释10倍为0.5XTBE. E.11澳酚蓝上样缓冲液的配制 称取蔗糖(400型)150mg 加人1%澳酚蓝150L,1%二甲苯青FF150L 超纯水定容100pL，4C冰箱中保存 E.121.5%琼脂糖凝胶的制备 称1.5g琼脂糖于100mL三角瓶中,加100nml1×TAE电泳缓冲液,加热直至琼脂糖完全溶解 加5,L滩乙馆,摇匀背温度约指C后倒人已经放好梳子的胶模中,踪脂糖完全旋结后拔出样梳 15
GB/T24310一2009 附 录 规范性附录 荧光定量CR扩增体系与扩增条件 F.1IaqMan探针 F.1.1反应体系 组分 体积(终浓度 UNG酶 0.5U 10×PCRbuffer(含MgC123.25mmol/L) 2.5AL A \mpliTaqGoldDNA聚合酶 2.5U dNTPs 1L(dATP,dcTP,dGITP各2.5mmol/L dUTP5mmol/L 200nmol/L 引物1 200nmol/L 引物2 200nmol/L 荧光探针 模板DNA 100ng Total 25Al F.1.2反应条件 热启动UNG酶;50C,5min 预变性:95C,5min 循环设定;变性95C20s 退火62C30s 读板 循环次数:40个循环 r.2sYBRGreenI荧光染料 r.2.1反应体系 组分 体积 10×PCRbuffer 2.5L DNA聚合酶 0.25L(1.25U) dNTPs 1L(dATP,dCTP,dGTP各2.5mmol/L,dlUTP5mmol/L UNG 0.5Uu 引物1 0.25Al(5pmol 引物2 0.25L(5pmol 5×sYBRGreen 0.25L 200 模板DNN ！Al(100ng~ ng 19. dH2oO .635山 F.2.2反应条件 热启动UNG酶:50C,5min 预变性:95C下5nmin 循环设定;变性94C30s 16
GB/T24310?2009 ?64C45s 72C45s ?35? 17
GB/T24310一2009 附录G 资料性附录 烟草转基因检测结果报告单 烟草转基因检测结果报告单见表G.1 表G.1烟草转基因检测结果报告单 No 送样单位 送样人 sampleprovider mplin球er san rson 样品来源/产地 样品类型 sample/index sampletype 样品等级/品种 生产年度 samplegrade/variety eroptime 样品品牌/条码 样品其他信息 samplebrand/barode otherinformation 收样时间 样品状态 samplereceivedate satmplestatuS 检测项目 检测方法 转基因检测 detectionmethod deteetionitem GMTdetection 提取样1 浓度(yied):OD260= 纯度(purity):OD260/OD280= extract1 DNA评价 DNACheck 提取样" 浓度(yield):OD260一 纯度(purity):(OD260/OD2805 extract2 extraet135Spromoter: NOS-terminator: NPTIIsequence: PCR检测 PCRdeteetion extract2 35Spromoter: NOS-terminator; NPTlIlsequence: 对照表现 阳性对照 阴性对照 提取对照: negativecontrol: controlsperformance positivecontrol: blank: N:PCR检测阴性其他说明 备注 P:PCR检测阳性; note P:positiveresult; N;negativeresultothers 结论 conelusion 批准人 审核人 编制人 authorized verifier ompile 检测单位盖章) 月 检测时间: 年 TEsTDATE 18