贝类中甲型肝炎病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法

贝类中甲型肝炎病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法

国家标准 GB/T22287一2008 贝类中甲型肝炎病毒检测方法 普通RT一PCR方法和 实时荧光RT一PCR方法 Detectionofhepatitisavirusinshelfish- ContentonalRr一CRandrealtimeluoresteneeRI一CR 2008-08-12发布 2008-12-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22287一2008 前 言 本标准的附录A为规范性附录 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 本标准起草单位;北京出人境检验检疫局、江苏出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:陈广全、饶红、段洪安、冯骞、付溥博、张惠媛、汪琦、曾静、张睿、李金华
GB/T22287一2008 贝类中甲型肝炎病毒检测方法 普通RI一PCR方法和 实时荧光RT一PCR方法 范围 本标准规定了贝类中甲型肝炎病毒的普通RT一PCR和荧光RT一PCR检测方法 本标准适用于贝类中甲型肝炎病毒核酸的检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,ISO3696:1987,MOD GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1193基因分析检测实验室技术要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 聚合酶链式反应polymerasechainreactiom,PCR DNA模板先经高温变性为单链,在适宜的温度下和缓冲液中,两条引物分别与模板DNA两条链 上的一段互补序列发生退火,接着在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP为底物,使退火引物得以延 伸,如此反复变性、退火和延伸,使位于两段引物序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增 2 3 反转录-聚合酶链式反应 reversetranseriptionpolymerasechainreaction,RT一CR RNA在逆转录酶的作用下,适宜反应条件下,被逆转录成cDNA,以cDNA作为模板进行PCR 实时荧光RT一CR RI一CR real-timeflu0rescence 实时荧光RT一PCR方法是在常规RT一PCR的基础上,加人一条特异性的荧光探针 该探针为 -段寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团 探针完整时,报告基团发射的荧 光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和 淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可以接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分 子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 3.4 Ct值eyelethrehola 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 缩略语 下列缩略语适用于本标准
GB/T22287一2008 4.1HAV:甲型肝炎病毒 4.2TCID.0;组织培养半数感染量,是病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度，一般使用Reed Muench方法计算 试剂 除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为去离子水,规格符合GB/T6682相关 规定 5.1甘氨酸缓冲液:见附录A中的A.1.1 5.2PEG8000沉降液;见附录A中的A.1.2 5.3裂解液;Trizolreagent或其他等效产品 5.4Poly(dt)磁珠;Dynalbeads-oligo(dt)25或其他等效产品 注，给出这一信息是为了方便本标准使用者,并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同的效果,则可 使用这些等效产品 5.51×RNA吸附缓冲液;见附录A中的A.2.5 5.62×RNA吸附缓冲液:见附录A中的A.2.6 5.7洗涤缓冲液;见附录A中的A.2.7 5.8 QIAam ViralRNAMiniKitQia iagen529004)'或其他等效产品 anmp Cat.No.10928-034'或其他 5.9Superscripr" 'onestepRT一PCRwithplatinumTaq(Ini itrogenCat 等效产品 SuperseriptrMfirststrandsyhthesissystemforRTPCR(InvitrogenCat.No.18080-051或 5 10 其他等效产品 5. UniversalPCRMasterMix(AB14304437)''或其他等效产品 11 5.12普通RTPCR检测引物序列(5’-3’) 正义引物(No.P1) CAGCACATCAGAAAGGTGAG 反义引物(No.P2 cTccAGAATcATcTccAAc 引物位于HAV基因组中编码VP1一VP3壳蛋白的区域,目的片段长度为192bp 加无RNase的去离子水配制成100amol/L储备液 5.13实时荧光RTPCR检测的引物和探针 引物或探针序列(5'-3' 正义引物HAV1 TTTCCGGAGCCCCTCTTG AAAGGGAAATTTAGCCTATAGCC 反义引物(HAV2) AAAGGGAAAATTTAGCCTATAGCC 反义引物(HAV3) FAM一ACTTGATACCTCACCGCCGTTTGCCTTAMRA 探针 加无RNase的去离子水配制成100AmolI储备液 5.14DNA分子量标记.100bp一200bp 5. 1550xTAE或其他等效缓冲液;见附录A中的A.1.3 5. 1610×上样缓冲液:见附录A中的A.1.6 5. 17甲肝减毒活疫苗:作为阳性对照添加于已知的阴性贝类样品中制成阳性质控样品 5 8 三氧甲炕;每次使用时注意防止Rnase污染 19异丙醇每次使用时注意防止Rnase污染 1 给出这一信息是为了方便本标准使用者,并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具有相同的效果,则可 使用这些等效产品
GB/T22287一2008 5.2075%乙醇:见附录A中的A.2.4 5.21无RNase的去离子水:见附录A中的A.2.3 5.22澳化乙锭(104g/L);见附录A中的A.1.4 5.23焦碳酸二乙酯 仪器与设备 6.1组织匀浆器(0r/min~20000r/min). 6.2PCR仪(PE9600或其他等效设备) 6.3实时荧光PCR仪(ABI7000或其他等效设备) 6.4凝胶成像系统 6.5恒温水浴(10C95C) 6.6涡旋混匀器(200r/min一2500r/min). 6.7电泳仪(oV一300v). 6.8酸度计(0一14.0opH,最小显示单位0.olpH.lmV). 6.9高速冷冻岗心机(Mdesmn四add221或其他等效设备》 6.10微量加样器(0.1L一2L，lL一10L,20l一100L,100L一1000L,1000L 5 0004l) 6. 超低温冰箱(一80c). .11 6 2带滤心的无Rmac的微量加样器吸头(d0,Ll0AL.200L.l, ml) 6 .13无RNase的离心管和PCR反应管(20L,1.5mlL,2mL) 磁力搅拌器 6 14 6 .15电子天平(最小精度值0.01g) 样品处理 样品的运输与保存 样品至少应在4C以下的环境中进行运输 实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检 测应将样品保存于一80C冰箱中 7.2取样 用灭菌蒸水将贝壳表面的污泥清洗干净,打开贝壳后,倒掉腔内的液体,使用灭菌消毒的剪刀和 锻子取贝的消化道组织10g 病毒的富集 10g贝类消化道组织中加人70m甘氨酸缓冲液(样品质量与缓冲液体积之比为1:7),组织匀浆 器中充分破碎混匀2min 取出匀浆液30mL，置37C孵育30min 于4C,15000g,离心20min 收集上清液，加人等体积三氯甲婉,涡旋混匀1min,室温放置5min,1 ,1700g，4C,离心30nmin 从上 层液相取出15mL上清液,加人等体积的PEG8000溶液(PEG终浓度为8%),于4C过夜沉降病毒 10000g,4,离心5min 弃上清,保留沉淀 选择下列两种方法之一进行RNA提取 病毒RNA提取 9 硅胶膜法 向沉淀中加人6mol/儿L的异硫氧酸溶液1ml尽量使沉淀充分溶解,涡旋混匀,使用Qiagen的 QIAamp ,ViralRNAMiniKit或其他等效产品进行RNA提取 按照厂家的试剂盒使用说明进行 操作
GB/T22287一2008 9.2磁珠法 于沉淀中加人5mlTrizolreagent,涡旋混匀使沉淀充分溶解 4C放置1h 转移至10mL或 15ml的离心管中,加人1.2ml三氯甲烧,剧烈涡旋混匀1min,室温放置5min 4C,12000g离心 5min.取上清液 加人0.5倍体积异丙醇,室温放置5min 4c.500g离心10min 弃上清液用 75%乙醇(4C洗涤沉淀 ll000g，4C,离心10min 弃上清液,倒置于吸水纸上,尽量吸干液体 3000g,4C,离心10s,将管壁上的残余液体甩到管底,用微量加样器尽量将其吸干,冰上干燥5nm min一 10min 用300AlL无RNA酶的水重悬沉淀,加热至90C,涡旋混匀使沉淀溶解 按照Dynalbeads oligo(dt)25或其他等效产品使用说明进行RNA纯化 9.3RNA的保存 制备好的RNA应尽快进行反转录 若暂时不能进行反转录,应于一80C保存备用 10 核酸扩增 10.1普通RT一PCR方法 TM pR！一PCRwithplatim 10.1.1Superscript" numTaqInvitrogen)方法;RT与PCR在一个反 one-step 应体系中一次完成,反应体系包含: 2×反应混合物 25Al 1L 正义引物(No.P1)(10pmol/L) 反义引物(No.P2)10pmol/L 1l 1L 酶混合物 模板 20l 水 2l 反应条件:50C,30min;94C,2min 变性(94C,3min) 94C,1min,49C,1min20s 72C,lmin n,40个循环;延伸(72C,l0min) 注:可使用其他等效的一步法或两步法RT一PCR检测试剂盒进行,反应体系浓度和反应条件可做相应调整 10.1.2琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 用1×电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶 在电泳槽中加人电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶 将10LPCR扩增产物分别与适量加样缓冲液混合,点样 5V/emm恒压,电泳20min 凝胶成像仪下 观察电泳结果,拍照并记录结果 10.1.3阳性产物的确认 10.1.3.1在阴、阳对照均成立的前提下,如果扩增出与目的片段大小相符的扩增条带,可初步判断为 RT一PCR扩增阳性 将PCR产物用快速纯化试剂盒纯化后,连接质粒后进行测序,并与GeneBank数 据库中的序列进行比对 10.1.3.2使用10.2方法进行检测和确认 10.2实时荧光RT一CR方法 10.2.1反转录反应 RNA 2Al dNTP 1A 随机引物(10Amol/L 1Al 无RNase的去离子水 6 Al 上述混合物于65C孵育5min,放于冰上1min 后,加人下列反应混合物 10×缓冲液 2L 氧化镁(MgCl 4l DTT 2L
GB/T22287一2008 Rnaseout 1l 反转录酶 1L min,75C,15min,4C 反转录反应条件:42C,30 10.2.2实时荧光CR反应体系 2×PCR反应缓冲液 25山 反义引物HAV2和HAV3均10pmol/L) 4.5L.HAV2和HAV3等体积,共4.5L 正义引物(HAV1)(10pmol/AL 4.5l 探针(10pmol/L 1.25山 cDNA 2l 50 加灭菌去离子水至 L. 实时荧光RT一PCR反应参数 50C,2min;95C,l0min;95C,15s,60C,lmin n,50个循环 注:可使用其他等效的一步法或两步法RT一PCR检测试剂盒进行,反应体系浓度和反应条件可做相应调整 质量控制 1 11.1阳性对照;将100个TCID的甲肝疫苗添加于10g已知的阴性贝类消化道组织中,与待检样品 进行相同的处理 阳性对照的目的是测试样品中的核酸是否被有效的提取出来 如果阳性对照出现阴 性结果,说明病毒RNA提取失败,应重新对样品进行检测 11.2阴性对照;取已知的阴性贝类消化道组织10g,与待检样品进行相同的处理 若阴性对照出现阳 性结果,可能是试剂反应体系有污染,应查找原因,重新进行检测 11.3试剂空白对照;进行普通PCR及实时荧光PCR需设立试剂对照,以检测PCR反应混合物中是 否存在污染 若试剂空白对照出现阳性结果,应更换试剂后重新进行检测 1 结果判断及表述 12.1结果判断 12.1.1普通RT一PCR方法 12.1.1.1对待测样品进行RTPCR检测,如果阴性对照和空白对照未出现条带,，阳性对照出现预期 大小的扩增条带,而样品未出现预期大小的扩增条带,则可判定样品甲型肝炎病毒核酸检测阴性 12.1.1.2如果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对照和样品出现预期大小的扩增条带,并且对 PCR产物序列分析证实与甲型肝炎病毒序列一致,则可判断样品甲型肝炎病毒核酸检测阳性;若两者 序列不一致,则可判断样品甲型肝炎病毒核酸检测阴性 12 .1.2实时荧光RI一CR方法 待检样品的Ct值>43时,则判断为甲型肝炎病毒核酸检测阴性 待检样品的Ct值<40时,则判断为甲型肝炎病毒核酸检测阳性 待检样品的4043时,则判断甲型肝炎病 毒核酸检测阴性 若重新检测的40GB/T22287一2008 乙酯具有挥发性,应在通风橱或通风良好的环境中配制和使用;所有使用过的器皿应于121C高压 30min 后再进行清洗 Trizol -reagent对皮肤具有极强的腐蚀性,操作时应戴乳胶手套 13.3实验中产生的废弃物和器皿(除配制焦碳酸二乙酯的器皿外)应于121C高压20min后再丢弃 或进行清洗 13.4操作三氯甲婉、异丙醇时应佩戴一次性手套并在通风橱或通风良好的环境中配制和使用 14 防污染措施 检测过程中防污染措施按照SN/T1193中的规定执行
GB/T22287?2008 ?A 淶?? ? A.1?? A.1.1???;0.1nmol/L?,0.3mol/LNaCl,pH9.5 ?(? 7.5g ?(NaCD 17.5g 800 ?? ml 5mol/1?(NaOH pH9.5 ??1000mL,121C,15miná??C9? 1.2PEG8000?;16%?)PEG8000,0.525mol/LNaCl A PEG8000? 16g 3.07 ?(NaCD) g ??100ml,???,121C,l5miná?4C 9? A.1.350XTAE?: A.1.3.10.5mol/LEDTA-Na(?)?,pH8.0 EDTA-NaH.O 186.1 g 800ml ?? pH8.0 5mol/? ??100mL.l2 C,15miná A.1.3.2TAE??(50) ?(Tris) 242g 57.1ml 0.5nmol/1EDTA?,pH8.o 100ml ??1000mL,121C,15miná ????1?á A.1.4廯?(EB)?(10g/aL ?? 20mg ?? 20mL A.1.50.5g/ml??1.5%? ? 1.5g 1TAE?? 100mL ???,50C~55C?,??(EB)?5L,ζ?, ,??,?????,?(?40min),? á A 1.610?: 25 g 100ml ?? 0.1 g
GB/T22287一2008 0.lg 二甲苯青 A.2RNase的去除和无RNas溶液的配制 配置溶液用的酒精、异丙醇,Tris,EDTA、LiCl,NaOH等应采用未开封的新品 配制溶液所用的 去离子水、玻璃容器、微量加样器吸头、药勺等塑料用具应无RNase 操作过程中应自始至终戴一次性 橡胶或乳胶手套,并经常更换,以避免将皮肤上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶污染用具或 带人溶液 A.2.1玻璃容器应在240C烘烤4h以去除RNase. A.2.2离心管、微量加样器吸头、药勺等塑料用具应用0.1%的DEPC焦碳酸二乙醋)水室温浸泡过 夜,然后灭菌,烘干;或直接购买无RNase的相应规格离心管、微量加样器吸头 A.2.3无RNase去离子水 100nml 去离子水 50丛l 焦碳酸二乙酯(DEPC) 室温过夜,121C,15min灭菌,或直接购买无RNase去离子水 A.2.475%乙醇 无水乙醇 7.5mL 2.5ml 无RNase去离子水 现用现配 A.2.51×RNA吸附缓冲液(Tris,LiCI,EDTA-Na H.0为优级纯 A.2.5.11mol/儿Tris-HClpH7.5 T Tris 1.21g 无RNase去离子水 6ml 36.5%盐酸 0.75ml mol/L盐酸 调pH至7.5 加无RNase去离子水至10mL,分装到1.5mL无RNase离心管中,一20C保存 A.2.5.20.5mol/1EDTA-Na.乙二铵四乙酸二钠),pH7.5 EDTA-Na;H.O 1.86g 无RNase去离子水 6mL 10mol/L氢氧化钠溶液 调pH至7.5 加无RNase去离子水至10ml,分装到1.5mL无RNase离心管中,一20C保存 A.2.5.35mol/1LiCl LiC 2.12g 无RNase去离子水 8ml 加无RNase去离子水至10mL,分装到1.5mL无RNase离心管中,一20C保存 A.2.5.41×RNA吸附缓冲液;含20 nol/儿 Tris-HClpH7.5),1.0mol/儿LLiCI,2mmol/L mmG EDTA-Na2,pH7.5 1mol/LTris-HCl 200 L 5mol/LLiCI 2000 kL 0.5nmolLEDTA-Na(pH7.5) 40 l 7760 无RNase去离子水 4L 10ml 总体积 现配现用 A.2.62×RNA吸附缓冲液Tris,LiCI,EDTA-Na H.O为优级纯:含40mmol/LTris-HCl
GB/T22287一2008 pH7.5),2.0mol/LLiCl,4mmo ol/LEDTA-Nag,pH7.5 00l 1mol/LTris-HCI 5mol/1LiCl 4000L 0.5mol/LEDTA-Na.pH7.5 0儿l 5520 无RNase去离子水 L 10mL 总体积 现配现用 A.2.7洗涤缓冲液(Tris,LiCI,EDTA-Na H.O为优级纯):含10mmol/LTris-HClpH7.5). 0.15mol/LLiCI,lmmol/LEDTA-NaepH7.5 1mol/ITris-HCI 100l 5mol/LLiCI 300 心 0.5mol/LEDTA-Na.(pH7.5 20AL 9580 无RNase去离子水 4L 总体积 10mL 现配现用
GB/T22287一2008 参 考 文 献 atitis [1 Costa一Mattioli,M.,etal.2002).Quantifieationanddurationofviraemiaduring ghepat Ainfectionas sdeterminedbyrealtimeRT一PCR.J.ViralHepatitis.9:101-106. [2] Loisy，F.，etal 2005).Real-timeRT一PCRfornorovirusscreeningin shellish J.Vir ologicalMethods.123:1-7. [37 CristinaRibao，etal2004).AssementofdfferentcommercialRNA-exrractionand RT一PCRkitsfordetectionofhepatitisAVirusinmusseltissues. VirologicalMethods.115:177 182. NarayananJothilkumar，etal2005)RapidandsensitivedeteetionofNorovirusesby [4] usingTagMan-basedO)neStepReverseTranscriptionPCRassaysanda ppliceation tonaturallycon taminatedshellfishsamples Appl.EnvironMierobiolApr:1870-1875. [E5 Y Carolshieh,etal.1999)Amethodtodetectlowlevelsofentericvirusesincon taminatedoystersJ] Appl.EnvironMicrobiol4709-4714. [6 AlissaB.Dix，Lee-annJaykus.1998)Virionconcentrationmethodforthedetectionof humanentericvirusesinextractsofhard-shelledclamms JFoodProtection.4:458-465 10