动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法

动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法

国家标准 GB/21103一2007 动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性 检测方法实时荧光PCR方法 Identifieationofmammalderivedmaterialsinamimaoriginatedfeedstuffs一 RealtimePCRmethoud 2007-10-24发布 2008-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21103一2007 前 言 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 本标准主要起草单位:辽宁出人境检验检疫局、宝生物工程(大连)有限公司、 检验检疫科学研究院、山东出人境检验检疫局、深圳出人境检验检疫 局、上海出人境检验检疫局 本标准主要起草人:曹际娟、李晶泉、郑秋月、徐昊、张舒亚、于爱丽、王玉萍、陈颖、徐宝梁、高宏伟、 宗卉、金东权 本标准首次发布
GB/T21103一2007 动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性 检测方法实时荧光PCR方法 范围 本标准规定了动物源性饲料中哺乳动物源性成分(包括牛、绵羊、山羊、猪、兔、鹿、马、驴、狗、猫等 实时荧光PCR检测方法,该检测方法的检出限为0.1% 本标准适用于动物源性饲料中哺乳动物源性成分的定性检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样(GB/Tl4699.1一2005,IsO6497;2002,IDT SN/T1193基因检验实验室技术要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 实时荧光CRrealtimeCR 实时荧光聚合酶链式反应 3.2 c'值eyeetme 每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数 原理 采用TaqMan实时荧光CR技术,根据线粒体DNA的12s核糖体RNA(12sribosomalRNA. 12sSrRNA)基因上哺乳动物与非哺乳动物种间序列差异而进行哺乳动物源性成分鉴定 利用裂解液破 碎细胞，三氯甲熔抽提蛋白质,异丙醉沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增 以实时荧光检测技术,采用多重PCR方法,将所用试剂配制成预混合形式,组建成实时荧光PCR哺乳 在同一反应管内对哺乳动物的12srRNA基因及内参照基因同时进行扩增 动物DNA检测试剂盒 并通过标记两种不同荧光物质6-戌基荧光素(6carboxyfluorescein,FAM)、5-六氧荧光素(5-hexachlo ro-fluorescein n,HEX)的探针进行特异性杂交,两色荧光同步检测 其中,对内参照反应的检测,可以监 控反应是否正常进行,防止假阴性结果 观察实时荧光PCR的增幅曲线,从而对动物源性饲料中哺乳 动物源性成分进行快速检测 试剂与材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,实验用水符合GB6682的要求
GB/T21103一2007 1 DNA提取用试剂 5 5. .1.1三氯甲烧 5.1.2异戊醉 1.3异丙醇 5 1.470%乙醇 5 5. .1.5裂解液;1%cTAB(cetyltrithylammoniumbromide,十六婉基三甲基澳化铵),0.05mol/几 Tris-HCl(pH8.0)[Tris-;tris(hydroxymethyl aminomethane， 三胫甲基氨基甲烧],0.7mol/儿L NaCl.0.01mol/1EDTA(pH8.0)(ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸) 5.1.6TE缓冲液(Tris-HCI,EDTA缓冲液:l0mmol/ITris-HClpH8.0),1mmol/L EDTA (pH8.0) 5.2实时荧光PCR哺乳动物DNA检测试剂盒 5.2.12×哺乳动物源性检测预混合液 含有ExaHs(终浓度1.25U/25L),dNTPs(终浓度各0.4mnmol/L),Mg+(终浓度3mnmol/L). 5.2.2哺乳动物源性检测引物混合液 含有扩增哺乳动物基因组DNA及内参照的引物(序列详见表1)、内参照(aDNA) 各引物终浓度 0.1mol/L1.04mol/I 表1哺乳动物及内参照引物序列 名 列 称 序 哺乳动物5'-引物-1 5'-AGTGcTTAGTTGAATTAGGccATG3" 5'-AGTGcTTAATTGAACAAGGccATG3" 哺乳动物5'-引物-2 哺乳动物5'-引物-3 5'-AG:TGC'TTGATTG,AATAAG;GCCATG3' 哺乳动物5'-引物-4 5'-AG.AG;CTTAATTG,AATCAGGCCATG3 哺乳动物5'-引物-5 5'-AGAGcTTAATTGAATAGGGccATG3 5'-AGAGCTCAATTGAATcGGGcCAT(G3 哺乳动物5'-引物-6 哺乳动物3'-引物-1 -TCCAGTATG;CTTACCTTGTTACGA-3 哺乳动物?'-引物-2 TTACCTTGTTACGACTTGTCTCCT-3 5'-GGcTG;ATTGAccGGcAGATTA3" 内参照5'-引物 内参照3'-引物 5'-GCGGGTATAGGTTTTATTGATGGC-3 5.2.3哺乳动物源性检测探针混合液 含有检测哺乳动物基因组DNA的探针及检测内参照的探针(序列详见表2) 探针浓度与使用的 实时荧光PCR扩增仪,荧光标记物质种类有关,实际使用时请参照仪器说明书,或各荧光探针的具体使 用要求进行 表2哺乳动物及内参照探针序列 称 序 列 5'FAM)-CGCACACACCGCCCGTCACCC-3'Eclipse) 哺乳动物探针 内参照探针 5'(HEX)-CCGCCACGACGATGAACAGAcGCT-3'(Eelipse)
GB/T21103一2007 5.2.4阳性对照 用已知含哺乳动物源性成分的样品作阳性对照 5.2.5 双蒸水 仪器与设备 6.1实时荧光PCR检测系统 6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 6.3电子天平;感量0.01g 6.4离心机:离心力12000 6.5微量移液器:0.5L一10L.I0L一100L.l0L200L,.100L一1000L. 6.6实时荧光PCR反应管 6 恒温水浴箱 试样的选取与制备 按照GB/T14699.1采样,将实验室样品粉碎,充分混合均匀后待用 检验步骤 1 8. DNA提取 称取适量饲料(饲料粒度为100目称取50mg;60目称取100g;20目称取200mg)于1.5ml离 心管中,加人l一8oA裂解液,GC30mm.期间每隔10nmn振荡混匀1200r/m离心 5min. ,吸取上清液至一新离心管中,加400l三氯甲炕十异戊醇(24+1),充分混匀;12000r 离 r/min 心5min,吸取上清液至一新离心管中,加0.8倍体积异丙醉,室温下沉淀1h一2h;12000r/min离心 10min,弃上清液;70%乙醇洗涤一次,晾干;加人50LTE,溶解沉淀 也可用等效的DNA提取试剂盒提取模板DNA 8. 2 DNA浓度和纯度的测定 取》LDNA莽液加双蒸水稀释至1ml，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和 280nm 处的吸光值A和A AM DNA的浓度按式(1)计算: c=A×N×50/1000 式中 DNA浓度,单位为微克每微升(4g/L); 260 nm处的吸光值; 核酸稀释倍数 N 当A/A比值在1.71.9之间时,适宜于PCR扩增 实时荧光PCR检测 3.1反应体系的体积为25AL,2×哺乳动物源性检测预混合液加12.5L,哺乳动物源性检测引物 8 混合液和哺乳动物源性检测探针混合液各加1L,样品DNA(1ng/l100ng/L)1L.,加双燕水至 25L 8.3.2在各实时荧光PCR反应管中加人上述试剂后，盖紧管,离心5一10 8.3.3将离心后的实时荧光PCR反应管放人实时荧光PCR检测系统内,记录样本摆放顺序 8.3.4实时荧光CR反应条件随不同仪器略有改变，一般的反应程序为.95C10s.,1个循环,95c 5s,60C30s,40个循环,在每次循环的退火时收集荧光
GB/T21103一2007 8.3.5检测结束后,根据扩增曲线和Ct值判定结果 8.3.6检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照 用已知含哺乳动物源性成分的样品作阳性 用已知不含哺乳动物源性成分的样品作阴性对照,用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白 对照 对照 注也可用等效的哺乳动物源性成分实时荧光CR检测试剂盒进行实时荧光PCR检测 结果判断与表述 结果分析条件设定 9 直接读取检测结果 阔值设定原则根据仪器噪声情况进行调整 9.2结果判定 9.2.1对照结果 空白对照:无FAM荧光信号检出 有HEX荧光信号检出,Ct值应<35.o. 阴性对照;无FAM荧光信号检出 有HEX荧光信号检出,Ct值应<35.0 阳性对照;有FAM和HEx荧光信号检出 且FAM通道出现典型的扩增曲线.Ct值<28.0 否则,实验视为无效 9.2.2检测结果的判定 Ct值<35为有效值,Ct值>35为无效值(详见表3). 表3结果的判定情况 FAM荧光 HEX荧光 结果判定情况 同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常,检测实际样品时,如果有FAM 荧光和HEx荧光检出,且Ct值<35,判定为含有哺乳动物源性成分;如果Ct值 >35,可视为不含有哺乳动物源性成分 同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常,检测实际样品时,HEX荧光信 号未检出,C值>35(如果检测样品浓度高会抑制内参照DNA的扩增);如果有 FAM荧光检出,且Ct值<35,判定为含有哺乳动物源性成分;如果FAM荧光 ct值>35,可视为不含有哺乳动物鄙性成分 同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常,检测实际样品时有HEx荧光 检出,无FAM荧光检出,判定为不含有哺乳动物源性成分 PCR反应失败 注意以下几个方面后再次进行反应 如果同时进行的阳性对照实验结果正常,则可能是样品DNA制备有问题,如 样品中可能存在PCR反应的抑制物等 2 如果同时进行的阳性对照实验结果不正常,则可能是实验操作失败或试剂 失活 9 结果表述 检出哺乳动物源性成分 未检出哺乳动物源性成分
GB/T21103一2007 10 检测过程中防止交叉污染的措施 按照SN/T1193执行 11 废弃物处理 检测过程中的废弃物,收集后在焚烧炉中焚烧处理