猪链球菌2型PCR定型检测技术

猪链球菌2型PCR定型检测技术

国家标准 GB/T19915.3一2005 猪链球菌2型PCR定型检测技术 NMethodfordeteetionStreptococeussuistype2yrCR 2005-11-01实施 2005-09-27发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19915.3一2005 猪链球菌2型PCR定型检测技术 范围 本标准规定了猪链球菌2型的PCR的定型方法 本标准适用于由猪链球菌2型引致的病死猪分离菌的检测和定型 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682一1992分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 猪链球菌2型Sstreptocceussuistype2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌,根据其荚膜多糖抗原的差异,可分为1一3！及1/2共35个 血清型 猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型,不仅对猪致病性很强,而且可以感染特定的人群,是 -种重要的人畜共患病病原菌 测定方法 方法提要 挑取可疑细菌培养物菌落加人PCR反应管中,进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,与 标准分子量标记比较,确定扩增产物的大小 4.2试剂和材料 除另有规定,所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T6682一1992的灭菌双蒸水 4.2.1猪链球菌2型定型PCR反应混合物和猪链球菌2型定型套式PCR反应混合物 4.2.2TaqDNA聚合酶 4.2.3琼脂糖;电泳级 4.2.4澳化乙锭 4.2.5分子量标记:DL-2000 4.2.6TE缓冲液;10mmol/儿Tris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0). 4.2.710×PCR缓冲液;100mmol/LKcl,160mmol/L(NH,.sO,20mmol/LMgso,200mmol/几 TnsHc(pH8.8).1% TritonX-100,1 /mlLBSA mg/ 242gTi、碱，57.lmL冰乙酸,100mL.0.5mol/几EDTA(pH8.0),加蒸懈水至 4.2. 8 电泳缓冲液 1000mL,使用时10倍稀释 4.2.9加样缓冲液:0.25%溴酚蓝,40%蔗糖 4.2.10荚膜基因PCR引物和荚膜基因套式PCR引物 4.2.11阳性对照和阴性对照
GB/T19915.3一2005 4.3仪器和设备 4.3.1离心机 4.3.2DNA热循环仪 4.3.3核酸电泳仪 4.3.4pH计 4.3.5移液器:l0AL、20AL、100AL、1000AL 4.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统 4.4荚膜基因PCR操作步骤 PCR扩增 用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型定型PCR反应混合物的PCR管中,混 匀,加人Tuq酶(sU/aL)0.5L..2000r/min离心10s,立即进行PR扩增,同时设阳性对照和阴性 对照 扩增条件为95C预变性3min;95C20s,55C30s,72C40s,30个循环;72C延伸7min,4C 保存 4.4.2CR产物回收 按Sngc PCR 产物回收试剂盒说明书进行 gong 4421在25L.IR产物中加人I0L结合缓冲液I(hmdnxbuferI),混匀 将混合物转移到2mL收集管内的UIQ-10柱中,室温放置2min.12000g室温离心 4.4.2.2 mIn 倒掉收集管中废液,将UNIQ10桂放置同一个收集管中,加人250L洗液(wash.soluton). 12000g室温离心1min 倒掉收集管中废液,重复步骤4.4.2.3一次 取下UNIQ-10柱,倒掉收集管中的废液,将UNIQ-10柱放人同一个收集管中,12000g室温 离心lmin. 将UNQ-10柱放人一根新的1.5mL微量离心管中,在柱子膜中央加12L洗脱缓冲液 4. elutionbuffer),37C放置2min 12000g室温离心1min,收集回收液 4.4.2. 4.4.3酶切 0.5mlEpendoff管中依次加人 DNA(PCR回收产物)8.0L Hind 1.0Al 0×bufer 1.0L 混匀,37C酶切2h 4.4.4琼脂糖凝胶电泳 在电泳缓冲液中加人1%琼脂糖,加热融化后加人溴化乙锭制备凝胶,凝固后进行电泳 8l酶切 产物加人2al5×上样缓冲液,混匀后加人上样孔,80V恒压电泳20min,紫外线透射检测 4.4.5检测猪链球菌2型荚膜基因的套式PCR 用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型定型套式PCR反应混合物的PCR管 中,混匀,加人Taq酶(5U/l)1.0L.,2000r/min离心10s,立即进行PCR扩增 扩增条件为;95c 预变性3nmin;95C40s,55C30s,72C40s,30个循环;72C延伸7min,4C保存 结果及判断 5.1试验结果成立条件 阳性对照经荚膜基因PCR扩增产物酶切后出现164p和223bp两条条带后,阳性对照经套式
GB/T19915.3一2005 PCR出现178bp及387p两条条带,阴性对照PCR产物电泳后没有条带,试验结果成立,否则,结果 不成立 5.2结果判断 在试验结果成立的前提下,如果样品中荚膜基因PCR产物酶切后出现164bp和223bp两条条带 或套式PCR出现178bp及387bp两条条带,表明猪链球菌2型荚膜基因阳性,再结合液体培养出现短 链的特性,可确诊为猪链球菌2型 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物,应收集后高压灭菌处理
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