鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定分光光度法

鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定分光光度法

国家标准 GB/T25879一2010 鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定 分光光度法 Determinationofyswymeinchiekene2white一 Speetrophotometry 2011-01-10发布 2011-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T25879一2010 前 言 本标准由农业部提出 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口 本标准起草单位;扬州大学动物科学与技术学院 本标准主要起草人:王金玉、谢恺舟、戴国俊、侯启瑞、刘大林
GB/T25879一2010 鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定 分光光度法 范围 本标准规定了鸡蛋蛋清中溶菌酶的分光光度测定方法 本标准适用于鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力的测定 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3. 蛋清egwhite 位于鸡蛋蛋壳内膜和蛋黄膜之间的半流动胶体物质 3.2 溶菌酶lys0yme -种专门作用于微生物细胞壁的糖苷水解酶 鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的测定 原理 溶菌酶在281nm波长处有最大吸收峰 溶菌酶标准品用每升溶液含9g氯化钠的溶液溶解并稀 释成不同梯度浓度,在281nm波长处测定吸光度并绘制标准曲线,求出标准曲线回归方程 试样经过 处理,按溶菌酶标准品测定方法,测定试样中的吸光度,根据其吸光度值由标准曲线回归方程计算试样 中溶菌酶含量 4.2仪器 紫外-可见分光光度计(波长范围190nm900nm,波长确定性士0.3nm,波长重复精度士0.1nm) 4.2.1 电子分析天平(感量0.1 、1mg mg、 离心机(最大离心力2325g,具10ml离心管) 4.3试剂与材料 溶菌酶标淮品,优级纯,活力在20000U/mg左右 4.3.2氯化钠,分析纯 4.3.3蒸憎水,按GB/T6682执行 4.3.4 医用脱脂纱布 4.4试剂配制 4.4.10.9%氧化钠溶液:称取氯化钠(4.3.2)0.9g,溶解于蒸僧水中,定容至100mL
GB/T25879一2010 4.4.2溶菌酶标准工作液:称取溶菌酶标准品(4.3.1)0.500g,以0.9%氯化钠溶液(4.4.1)溶解定容 至1000ml,得到5004g/mL的溶菌酶标准工作液,于4C密封保存备用,1周内使用 4.5分析步骤 4.5.1标准曲线的绘制 分别吸取溶菌酶标准工作液(4.4.2)1mL,2mL、3mlL、4ml、5ml于25ml.容量瓶中,以0.9% 氯化钠溶液(4.4.1)稀释至刻度,混匀 用10mm石英比色m比色,以0.9%氯化钠溶液(4.4.1)为参 比溶液,在波长281nm处依次测定各标准工作液的吸光度,以溶菌酶标准工作液浓度为横坐标,吸光 度为纵坐标绘制标准曲线,并求出标准曲线回归方程 4.5.2试样测定 鸡蛋蛋清用4层纱布过滤,取过滤试样1mL.,用0.9%氯化钠溶液稀释定容至100ml.,混匀,避免 吸取5mL蛋清的氨化钠溶液1310g离心5min取上清液按照绘制标准曲线的操作步骤 起泡沫 4.5.l),在波长281nm处测定试样溶液的吸光度 平行测定三次,取结果的算术平均值,由标准曲线 回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度 4.6结果的计算与表述 根据试样溶液吸光度值,用标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度c 鸡蛋蛋清中溶菌 酶的含量按式(1)计算 X=c× 式中: 鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量,单位为微克每毫升4g/mL); 试样溶液中溶菌酶的浓度,单位为微克每毫升(4g/mL); 试样溶液定容的体积,单位为毫升(ml.); -试样的体积,单位为毫升(ml. 4.7精密度、准确度、灵敏度 4.7.1精密度 本方法检测鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的批内变异系数CV3%,批间变异系数CV5% 4.7.2准确度 ys/ml范围内,回收率>95% 鸡蛋蛋清溶液中器加溶菌酶标准品浓度在204g/mL一60n 4.7.3灵敏度 本方法检测鸡蛋蛋清溶液中溶菌酶含量的最低检测限为0.34g/ml 鸡蛋蛋清中溶菌酶活力的测定 原理 溶菌酶通过溶解G菌的细胞壁使细菌溶解,菌液在可见光范围内的吸光度降低 酶的活力表示 为在特定条件下单位时间内转化底物的速度 本标淮根据该原理,以溶壁微球菌为底物,用分光光度 法,以450nm波长处菌液单位时间内吸光度降低程度为依据,测定溶菌酶的活力 5.2仪器 5.2.1紫外-可见分光光度计(波长范围190nm900nm,波长确定性土0.3nm,波长重复精度士0.1nmm) 5.2.2电子分析天平(感量0.1mg、！mg) 5.2.3摇床(控温范围0C~100,转速振幅;0r/min一300r/min) pH计(精密度士0.01). 5 5.2. 离心机(最大离心力2325g,具10mL离心管
GB/T25879一2010 5.2.6高压灭菌锅 5.2.7超低温冰箱 5.3试剂与材料 5.3.1氧化销,分析纯 5.3. 甘油(丙三醉),分析纯 2 5. .3. 3 磷酸氢二钠,分析纯 5.3.4磷酸二氢钠,分析纯 5.3.5牛肉膏,生化试剂 5.3.6蛋白陈,生化试剂 5 .3.7酵母提取物,生化试剂 5 3.8琼脂,生化试剂 5.3.9溶壁微球菌(MicrococcuslysodeikticusFlenming). 5 试剂配制与培养基制备 5 0.9%氯化钠溶液;称取氯化钠0.9g,溶解于蒸僧水中,定容至100mL,121C高压灭菌 30min 20%甘油(丙三醇)溶液;称取甘油20.0g,溶解于蒸水中,定容至100mL,121C高压灭菌 5 30min 5 0.2mol/LpH6.2磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠(NagHPO12H,O)71.63g,用蒸僧水溶 解定容至1000mL;称取磷酸二氢钠(NaH,PO2H,O)33.00g,燕憎水溶解并定容至1000ml 取 Na,HP(溶液18.5mL与NaH,PO，溶液81.5mL混合,混匀即可 固体培养基;牛肉膏0.3g,蛋白陈1.0g、氧化钠0.5其溶解于100mL水中,各组分溶解后,加 5.4.4 人琼脂2.0g,持续搅拌至琼脂完全溶解,用1mol/L氢氧化钠调整pH至7.27.4,并用水定容至 100mL,分装在试管里,每管液量为15mL20mL,加棉花塞,121C高压灭菌30min后,倒人培养皿 中加盖,冷却至室温 液体LB培养基,蛋白陈1.0g、脖母提取物0.5g.氯化钠1.0g溶解于100mL水中,用1molL 5.4.5 氢氧化钠调整pH至7.27.4,分装在试管里,121C高压蒸汽灭菌30 min 5.5分析步骤 5.5.1菌液的制备 将溶壁微球菌(5.3.9)先接种于灭菌的固体培养基(5.4.4)中活化和扩大培养,再接种于灭菌的液 体LB培养基(5.4.5)中,37C摇床培养至菌体增殖,培养9h一10h,将培养液1310只离心10min,收 集沉淀的菌体 该菌体加人3倍体积灭菌的0.9%氧化钠溶液(5.4.1)悬浮,1310g离心10min,收集 沉淀的菌体,重复4次一5次 再用20%甘油溶液(5.4.2)将菌体制成黏稠状,置于一60C保存,半年 内使用 使用前,用磷酸盐缓冲液(6.4.3)溶解溶壁微球菌,调至oD.吸光度值范围在1.2- l.4,2C 8C放置 5.5.2鸡蛋蛋清溶液的制备 鸡蛋蛋清用4层纱布过滤 取过滤试样1mL,用磷酸盐缓冲液(5.4.3)定容至100mL,1310离 心5min除去不溶物 5.5.3试样测定 按4.5的方法,在281nm波长处测定鸡蛋蛋清溶液的吸光度,并计算蛋清溶液中的溶菌酶浓度c 鸡蛋蛋清溶液,菌液于25C水浴中保温,在450nm波长处测定酶活力,试样测定反应体系见表1
GB/T25879一2010 表1试样测定反应体系 加人物 测定液/mL 空白液/mL 鸡蛋蛋清溶液 0.2 0.0 菌液 1.0 0.0 磷酸盐缓冲液(pH6.27 1.2 用空白液调零,加0.2mL鸡蛋蛋清溶液到10mm石英比色皿中,从加人1.0mL菌液开始计时、 记录在450nm波长处反应15、和75、时的读数为A、A 按每分钟OD值下降0.001为一个活力 单位(U)的定义,鸡蛋蛋清中溶菌酶的活力按式(2)计算 EO EA= o.001又E 式中 E 鸡蛋蛋清中溶菌酶活力,单位为单位每毫克(U/mg)1 在两时间点测定的吸光度A、A之差 EO0 0.2mL鸡蛋蛋清溶液中含有溶菌酶的质量,单位为毫克(mg E 0.2ml.鸡蛋蛋清溶液中溶菌酶的质量E 与试样溶液中溶菌酶的浓度c之间的关系按式(3) 计算: 0.2xc 3 E 1000 5.6重复性 在相同条件下获得的三次独立测试结果的变异系数CVs10%