猪链球菌2型溶血素基因PCR检测方法

猪链球菌2型溶血素基因PCR检测方法

国家标准 GB/T19915.g2005 猪链球菌2型溶血素基因PCR 检测 方 法 Detectionmethodofthehemolysingenefor" Streptoeoecussuistype2yPCR 2005-11-01实施 2005-09-27发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19915.9一2005 猪链球菌2型溶血素基因PCR 测方法 检 范围 本标准规定了猪链球菌2型溶血素基因PCR检测的操作方法 本标准适用于猪及其产品中分离菌株的猪链球菌2型溶血素基因的检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682一1992分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 猪链球菌2型Streptococeussuistype2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌,根据其荚膜多糖抗原的差异,可分为1一34及1/2共35个 血清型 猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型,不仅对猪致病性很强,而且可以感染特定的人群,是 -种重要的人畜共患病病原菌 缩略语 PCR polymerasechainreaetion,聚合酶链式反应 DNA deoxyribonueleicacid,脱氧核糖核酸 dNTP deoxyribonucleosidetiphosphate,脱氧核苷酸三磷酸 basepair,碱基对 bp 测定方法 方法提要 以可疑细菌培养物提取的核酸,作为DNA模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,与 标准分子量标记比较,来确定扩增产物的大小 5.2试剂和材料 除另有规定,所用试剂均为分析纯,水为符合GB/T6882-1992的灭菌双燕水 5.2.1猪链球菌2型溶血素基因PCR反应混合物:10×PCR缓冲液2.5L、25mmol!/LMgCl 2.0AL,2.5mmol/LdNTP2AL、上下游引物各1AL.,用双蒸水补至20L 引物序列如下,其目的片 段长度为495bp slyl;5'ccC,AAG,TTC,AAG,CCG,CAT,TTA3'(1542) sly2;5'GAA.,GAT,TG;C,GAG,CAT,TTC,CTG3'(2036 5.2.2 TuDNA聚合陈
GB/T19915.9一2005 5.2.3琼脂糖:电泳级 5.2.4澳化乙锭 5.2.5酚;Tis饱和 5.2.6三氯甲烧 5.2.7异皮醉 B.28 异丙醇 5.2.970%乙醉 5.2.10分子量标记;DL-200o. mmol/LEDTA 5.2.11十六烧基三甲基澳化锁(cTAB)提取液;0.lmmal/儿TislHc(pH7.5),10 pH7.5),2%CTAB,0.7mmol/儿NaCI,1%3硫基乙醇 5.2.12TE缓冲液:10mmol/几Tris-HCl(pH8.0),1 nol/LEDTA(pH8.0). mm 0×rR缓冲液，lo0 5.2.13 mmol/LKCI.160mmol/I.NH,)SO,20mmol/IMgsO, mLBSA 200mmol/几Tris-HCIpH8.8),1%TritonX-100,lmg .2.14电泳缓冲液，212gTris,57.1mlL 冰乙酸，100mL.0.5 ml/儿EDTA(pH8.0)加燕溜水至 1000mL;使用时10倍稀释 5.2.15加样缓冲液.0.25%澳蓝,l0%蔗糖 5.3仪器和设备 5.3.1离心机 5.3.2DNA热循环仪 5.3.3核酸电泳仪 5.3.4pH计 5.3.5移液器.10L.20aL.100l.00L 5.3.6紫外线透射仪或凝胶成像系统 5.3.7恒温水浴锅 5.4操作步骤 样品处理和基因组DNA的提取 取可疑细菌的培养物1.0mL..l0000r/min离心1min,沉淀用560LTE缓冲液悬浮,或挑取可 疑细菌菌落,用560LTE缓冲液悬浮,加人30AL10%十二烧基碗酸纳(sDs)和3L20g/儿蛋白膊 K,37C水浴60nmin后,再加人100L5mol/LNaCl和80LcTAB/NaCl,65C水浴10min,加人体 积比为25:24:1的酚十三氧甲炕十异戊醇混合液770L,混匀,4C12000r/min离心5min,取 400L.上清液;加人体积比241的三氧甲烧十异皮醉混合液400pL,混匀.c1200r/mm离心 5nmin,取200Al上清液加人等体积的异丙醇沉淀;4C12000r/min离心15min,弃上清;70%乙醉洗 涤一次,脉干;加人50nL 双蒸水溶解沉淀 也可用等效的DNA提取试剂盒提取DNA模板 5.4.2CR扩增 取比待检菌株数多两只的猪链球菌2型溶血素基因PCR反应混合物的PCR管,2000r/min离心 0s后各加人Taq酶(2.5U/L)0.3L,分别加人待检菌株DNA提取物和阴性、阳性核酸对照5.0L 到PCR管中,2000r/min离心10s,立即进行PCR扩增 扩增条件为:95C预变性5nmin;94C1min 56c1min,72c1nmin,35个循环;72C延伸10min,4C保存 5. 4 PCR扩增产物电泳检测 取1.5g琼脂糖,于100mL电泳缓冲液中加热,充分溶化,制胶 在电泳槽中加人电泳缓冲液,使 液面刚刚没过凝胶 取20LPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后加样,进行电泳 电压大小 5V/e 35 根据电泳槽长度来确定,一般控制在3V/em~ /em,电泳时间为30min一 nmin 将电泳好的凝胶
GB/T19915.9一2005 放人终浓度为14g/ml的溴化乙锭染色缓冲液中染色15min20min,在紫外线透射仪或凝胶成像系 统上观察结果,并做好试验记录和样品位置 结果及判断 6.1试验结果成立条件 阳性对照的PCR产物电泳后在495bp的位置上出现一条特异性条带,阴性对照PCR产物电泳后 没有条带,试验结果成立;否则,结果不成立 6.2结果判断 6.2.1在试验结果成立的前提下,如果样品中PCR产物电泳后在495bp的位置上出现一条特异性条 带,判为该菌株含有猪链球菌2型溶血素基因 在试脸结果战立的前提下,如果样品中vR产物电谋后在4sp的位置上未出现一条特异性 6.2.2 条带,判为该菌株不含有猪链球菌2型溶血素基因 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物,应收集后高压灭菌处理 检测过程中防止交叉污染的措施见附录A
GB/T19915.g一2005 附录 A 规范性附录》 检测过程中防止交叉污染的措施 抽样和制样过程 抽样和制样工具,应清洗干净,121c,15min~20min灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用 存 放样品的容器应该经过清洗,灭菌,或为一次性灭菌容器 A.2检测过程 A.2.1PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR区 将模板提取、PCR反应液配 制,PCR循环扩增及CR产物的鉴定等步骤分区或分室进行 实验室的运作应从“净区”到“脏区”单 方向进行 A.2.2实验过程中,应穿实验服和戴手套,手套要经常更换 各区要有专用实验服,经常清洗 A.2.3各区所有的试剂、器材(尤其是移液器),仪器都应专用,不得带出该区 A.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121C、15nmin一20nmin灭菌,避免核酸和(或)核酸酶污染 每种 溶液应使用高质量的成分和新燕憎的双蒸水 在20C一25C贮存的试剂中,可加0.025%的叠氮钠 所有试剂应该以大体积配制.然后分装成仅够一次使用的量进行贮存 A.2.5装有DNA模板或引物的离心管打开之前,要简短离心,离心管不能用力崩开,以免产生气 溶胶 A.2.6前PCR区中,最好能在PCR操作箱中加人PCR反应各组分 A.2.7实验前后,实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA A.2.8可使用UDG和dUTP系统控制污染