GB/T36841-2018
桃丛簇花叶病毒检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofPeachrosettemosaicvirus
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2019-04-01
- 文件格式PDF
- 文本页数14页
- 文件大小884.24KB
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桃丛簇花叶病毒检疫鉴定方法
国家标准 GB/T36841一2018 桃丛簇花叶病毒检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofPeach rosettenosaicirSs 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36841一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位:检验检疫科学研究院、南海出人境检验检疫局、中华人民共 和国厦门出人境检验检疫局、烟台出人境检验检疫局,浙江大学
本标准主要起草人;张永江、邱艳红,谈琪、廖富荣、向均,李金庆,吴建祥,辛言言
GB/36841一2018 桃丛簇花叶病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了桃丛簇花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法
本标准适用于桃树、葡萄、李、洋李等植物材料及传播介体如线虫中桃丛簇花叶病毒的检疫和鉴定
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 基本信息 中文名;桃丛簇花叶病毒 学名:Peachrosettemosaicirus 缩写;PRMv 分类地位;伴生豇豆病毒科(Secoviridae)豇豆花叶病毒亚科(Comovirinae)线虫传多面体病毒属 Neoir4s 桃丛簇花叶病毒的其他信息参见附录A
方法原理 桃丛簇花叶病毒的血清学特性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据,生物学测定为辅助鉴定手 段
根据PRMV与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAs ELISA)和斑点酶联免疫吸附测定(Dot-ELISA);依据PRMV的基因组特征进行逆转录聚合酶链式反 应(RT-PCR)检测
S 仪器用具与试剂 5.1仪器 电子天平(感量0.001g)、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱(一80C)、制冰 机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅,pH计,超净工作台,PCR仪、微波炉,电泳仪、电泳槽、凝胶成 像分析仪、酶标仪、洗板机,恒温水浴锅
5.2用具 酶联板、可调移液器(2.5Al、10Al,20AL、100Al,200AL、I000AL)和可调移液器头、离心管 1.5ml、2.0ml),研钵、微型磨杵等
GB/T36841一2018 5.3试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定
DAS-ELISA检测 试剂见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C 6 检测样品的制备 6.1种子 种子播于灭菌土中,待长出幼苗后将表现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(5株为1组)并 编号,采集的叶片分成2份,根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测
6.2苗木 有症状(如枝条变短丛簇、枝的节间缩短等)的苗木编号单独检测
没有症状的分组并编号检测,分 组方法和检测方法同6.1
6.3植物产品 植物产品有症状的部分(如叶片畸形、花叶,斑驳等)单独编号检测
没有症状或无法观察症状的植 物产品,应按比例取样,分组编号,分组方法和检测方法同6.1
检测鉴定 7.1DAS-L.ISA检测 把制备的样品上清液加人已包被PRMV抗体的酶联板中,进行DAs-ELISA检测
每个样品平行 加到两个孔中
健康的植物组织作为阴性对照,感染PRMV的植物组织作为阳性对照,样品提取缓冲 液作为空白对照;其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致
具体操作见附录B 7.2RT-CR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照
分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作见附录C
7.3生物学测定 将待测样品及阴性对照和阳性对照接种到鉴别寄主植物上,观察症状,具体操作见附录D. 7.4Dot-ELISA检测 把制备的样品上清液点在硝酸纤维素膜上,进行DotELISA检测,对照设置同7.1
具体操作见附 录E 8 结果判定 DAsELISA,Dot-ELISA,RT-PCR和生物学测定中的两种检测方法结果为阳性即可判定样品携 带PRMV
GB/36841一2018 样品保存与结果记录 g.1样品保存 经检测确定携带PRMV的样品应保存在适合的条件下以备复核
如种子保存在干燥室温环境中; 种苗、叶片等样品保存在一80C冰箱中;做好登记和标记工作,保存期限至少1年
9.2结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字
DAS-ELISA检测应有酶 联反应数值;DotELISA检测应有检测图谱;RT-PCR检测应有电泳图片和测序结果;生物学测定应有 鉴别寄主的症状照片
GB/T36841一2018 附 录 A 资料性附录) 桃丛簇花叶病毒相关资料 寄主范围 A.1 自然寄主包括葡萄(Vitisinifera)、桃(Prunusersica),李(Prunussalicina)、祥李(Prunusdo mestica、皱叶酸模(Rumercrispus)、药用蒲公英Tararacumofficinale)等
鉴别寄主包括莫色黎 Chenoodiumamaranticolor)、昆诺阿藜(C.quinoa)、普通烟(Nicotianatabacum)等
A.2危害症状 侵染桃树导致芽分化推迟,春天长出的叶子斑驳、变窄,有的畸形;枝条变短、丛簇;植株矮缩;不结 果或果实减少 侵染葡萄导致叶片不对称和斑驳,枝条节间缩短;浆果脱落;蔓萎缩,最后死亡
A.3分布地区 印度、土耳其、意大利埃及、加拿大和美国 A.4传播方式 传毒介体:美洲剑线虫(Xiphin )、折环长针线虫(L.ongi ridorusdiadecturus)轮线 nem1aq1ericqn7 虫(Criconemoides spp.. 种苗:葡萄、桃、李等的无性繁殖材料如砧木、接穗等可传播;葡萄种子、昆诺藜种子及药用蒲公英种 子的种传率分别为9.5%,90%和3.6%
也可以通过机械接种、嫁接传播
A.5粒体形态 粒体为等轴对称球状正二十面体,直径约为24nm30nm
A.6基因组 基因组为二分体基因组,核酸为正单链RNA,包括RNA】和RNA2两条链,分别为7kb和6.2b.
GB/36841?2018 ? B 淶??) DAS-EL.ISsA B.1? B.1.1 ????? B.1.2?? ??????塣 B.1.3 (pNPP B.1.41BS?(p7.4) (NaCI 8.0g (KH,PO. 0.2g 1.15 (NaeHPO g ?(KCI 0.2g 0.5ml -20(Tween-20) 900mL??,1000mL,4档 B.1.5???(pH7.4 1.3 (NaeSO. ??(PVP,?2400040000 20.0g 900mL1PBST,1PBST1000mL,4C档 B.1.6?(pH9.6 ?(Na.CO. 1.59g 2.93g ?(NaHCO 900ml??,1000mL,4档 B.1.7?????(pH7.4 2.0 ???(BSA g 20.0 ??PVP,?2400040000) g 900mL1PBST,1PBST1000mlL,4 B.1.8??(pH9.8) 97mL ?
GB/T36841一2018 0.1 氯化镁(Mg(C, 1g 溶于800mlL双蒸水中,用浓盐酸(HCl)调pH至9.8,定容至1000mL,4C储存
B.2 实验步骤 B.2.1 包被抗体 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体,每孔加100"l
酶联板加盖或用保鲜膜 包好,37C孵育2h
清空孔中溶液,用1×PHBST加满各孔,3min后倒掉孔中溶液,在吸水纸上拍干
再重复2次上述洗板过程
B.2.2样品制备与加样 待测样品按110(lg样品加人10mL缓冲液)加人抽提缓冲液,在研钵中研磨,将样品研磨液倒人 离心管中;5000r/min离心10min.上清液即为制备好的检测样品
阴性对照,阳性对照作相应处理或 按说明书进行
按10AL/孔分别加人制备好的检测样品、.阴性对照和阳性对照;酶联板加盖或用保鲜 膜包好,4C孵育过夜
酶联板用自来水彻底冲洗,再用1×PBST洗涤3次,每次3min. B.2.3加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人到酶联板中,100AL/孔,酶联板 加盖或用保鲜膜包好,37C孵育4h
酶联板用自来水彻底冲洗,再用1×PBST洗涤3次,每次3min
B.2.4加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),100AL/孔加人到酶联板中 室温避光孵育
B.2.5读数 在不同的时间内如30min,60min,90nmin、120nmin或更长时间,用酶联仪在405nm处读吸光度 (OD)值
B.3结果判定 B.3.1质量控制要求 对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内,即;缓冲液孔和阴性 对照孔的OD值<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0.05计算;阳性对照oD值/阴性对 照OD值>5;同一样品的重复性基本一致
B.3.2结果判定 在满足B3.1的质量控制要求后，结果原则上可判断如下;样品OD丽值/阴性对照OD值>2,判 为阳性;样品OD值/阴性对照OD值在2左右,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验 证;样品OD值/阴性对照OD值<2,判为阴性
若不满足B.3.1的质量控制要求,则不能进行结果判断
GB/36841一2018 附录 C 规范性附录 RT-PCR检测 试剂 C.1.1核酸提取试剂 Trizol或合格的RNA提取试剂盒 C.1.2电泳缓冲液TAE(50× 三羚甲基氨基甲炕(Tris) 242g 57.1ml 冰乙酸(C;H,O 37.2 乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA
2H.O) g 双蒸水定容至1000ml,用时稀释至1×TAE
C.2检测步骤 C.2.1 核酸提取 植物样品;称取0.lg样品加液氮研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5ml离心管中,加人1ml 的Trizol试剂,剧烈震荡3 nmin;4C12000r/min离心10min;将上清液移人一新离心管中,加人 0.5ml氯仿,猛烈震荡15s;4C12000r/min离心15min;小心吸取上层无色水相到新离心管中;加 人等体积异丙醇混匀室温静置10mm;4c120o/mm离心10mn,弃上清液;加人lml75%的 冷乙醇洗涤沉淀;4C10000r/min离心10min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后溶于30ALDEPC Hl,O中,一20C保存备用
线虫样品:在1.5ml离心管中加人15AL无菌蒸榴水,将线虫放人管中并放置冰上;加人100"I TLES缓冲液(100 mmol/1
Tris-ClpH8.0，100mm mol/L.LiCI，10mmol/儿LEDTA，1%SDS)和 00AL苯酚并涡旋10 min;4C12000r/min离心5min;将上清液移人一新离心管中,用100L苯 酚;三氯甲棕(1:1)抽提两次,用100L三叙甲熔抽提一次;上清液加人等体积的4molLLicl,冰上 放置2h;4C12000r /min 离心10min,弃上清;加人1ml70%的乙醉洗涤沉淀;4C10000r/min 离心10min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后溶于20LDEPC-H.O中,-20C保存备用 C.2.2引物序列 上游引物PRMV-293F:5'-CGCCGCTCTATTTGTGGT-3" 下游引物PRMV-293R:5'-CTTGTCAGTGCCATcCGTAAT-3 产物大小;293bp C.2.3反转录 反转录总体系为25Al
在PCR管中依次加人4L总RNA，1AL
下游引物浓度为 20mol/L),在70C温浴5min,然后冰浴5min;瞬时离心,再向PCR管中加人MMLVRT 200U/pL)1AL,5×RT缓冲液5AL,dNTP(10mmol/L1AlLRNasin(40U/pL0.5"L,补充
GB/T36841一2018 DEPC处理水至25AL
轻轻混匀后42C水浴1h,70C灭活10min,合成第一链cDNA,-20C保存 备用
C.2.4CR扩增 ,dNTPs 反应体系:25L;在0.2mlLPCR管中加人10×PCR缓冲液含Mg+)2.5AL 10 nmmol/L)0.5L,上游引物及下游引物(均为20Mmol/L)各0.5AL,Taq酶(5U/L)0.2L,模板 2.0AL和DEPC-HO18.8AL
设置阳性对照、,阴性对照及空白对照
反应程序;95C3min;94C45s，52C45s，721min,35个循环;72C10 min
C.2.5PCR产物琼脂糖凝胶电泳 制备2%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNA分子标记作为分子 量标记,进行电泳
电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条带,并拍摄 记录 C.3 结果判定 阳性对照在293bp左右处有条带,阴性对照和空白对照无特异性条带,待测样品出现与阳性对照 -致的条带,可判定为阳性
阳性对照在293bp左右处有条带,阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带,可判定结果为 阴性
GB/36841一2018 附 录 D 规范性附录 生物学测定 D.1接种 将桃、葡萄、李或洋李病叶加1;(1020)(1g样品:10ml20mL缓冲液)的磷酸盐缓冲液 (0.06mol/LpH8.0)于研钵中充分研磨,在待接种植物(3叶期)叶片表面均匀撒上硅藻土,用手指蘸取 研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面
将待接种的植物预先在黑暗处放置24h再接种效果更好
每个 待测样品接种3棵寄主植物
接种后的寄主植物放置于隔离空间内进行症状观察,观察时间为20d 左右
D.2鉴别寄主症状 苑色藜(C'henopodiwmamaranticolor):接种4d7d后,接种叶有模糊褪绿色斑
系统症状包括 斑驳,叶畸形,扭曲或枝顶坏死,于7d10d内病株出现上述系统症状,最后病株矮化. 昆诺阿藜(C.qguina);接种4d7d后,接种叶有模糊局部褪绿斑,后叶弯曲,脱落
系统症状包 括黄色斑纹和叶片反卷,茎干严重扭曲,顶端坏死
普通烟(Nie )):接种叶褪绿斑或坏死环斑(仅发生于强毒株系,后产生轻型性系统 icotiaatabac 褪绿环斑
GB/T36841?2018 ? E 淶??) ???(Dot-EL.IsA) E.1 ? E.1.1?? ??0.45m?? E.1.2? ????塣 E.1.3?? ???,?????,???? E.1.4?? ?(NBT)5--4-3-(BCIP)??;NBT70%? NBT?50mg/mL?,BcIP100%???УBCIP?50mg/mL.? ,2???????20档 E.1.5PBs? ?(NaCI 8.0g 3.0 Na,HPO12H.O) g KHPO 0.2g ?(KCD) 0.2g pH?7.4,?1000mL E.1.6PBST?(??? PBS? 1000mL -20(Twen-20) 0.5ml E.1.7?(?? ?? 5.0g PBST? 100mmL E.1.8?? F??(Tris 12.14 ?(NaCI 5.84g 0,475 ?MgCLl g pH?9.5,??1000ml 10
GB/36841一2018 E.1.9底物显色液 0mL的底物缓冲液中加人66LNBT储备液和33LBCIP储备液
E.2操作步骤 E.2.1 样品制备 待测样品按1;20(1g样品加人20ml缓冲液)加人PHBS缓冲液,用研钵研磨成浆,5000尽离心 3 ,上清液即为制备好的检测样品
阴性对照、阳性对照作相应的处理 min E.2.2点样 用慑子取一张膜放至干净的培养皿内,用移液枪取34L病叶提取液上清轻点到膜上,每取一个样 换一个枪头
E.2.3膜干燥 点样完成后膜在室温下干燥,直至看不到点样水印为止，约10nmin E.2.4封闭 膜在封闭缓冲液中37C振荡孵育30min E.2.5加第一抗体 在一个平皿中用抗体稀释液将藜草花叶病毒特异性鼠源单克隆抗体稀释成1:2000倍溶液(体积 比),用银子将膜放人抗体溶液中,室温水平摇床上缓慢摇动孵育60min;倒去上述抗体溶液后加人 PBST洗涤液,在水平摇床上缓慢摇动洗涤膜3min;重复洗涤2次
E.2.6加酶标第二抗体 用抗体稀释液将碱性磷酸酯酶(AP)标记的羊抗鼠酶标二抗稀释成1:8000倍溶液(体积比),用 锻子将膜放人上述酶标二抗溶液中,室温水平摇床上缓慢摇动孵育60tmin;倒去上述酶标二抗溶液后 加人PBST洗涤液,在水平摇床上缓慢摇动洗涤NC膜3min;PBST重复洗涤3次;最后再洗涤1次以 去除膜表面的吐温-20o. E.2.7加底物显色 在一个干净的平皿中加人10mL底物缓冲液,66ML.NBT和33LBCIP底物储备液,混匀;将洗 好的NC膜放人平皿中避光显色10min一20min,将膜用自来水漂洗一下洗去底物终止反应
E.3结果判断 E.3.1当阳性对照出现紫色斑点,阴性对照未出现紫色斑点时,若样品出现紫色斑点,则检测结果为 阳性
E.3.2当阳性对照出现紫色斑点,阴性对照未出现紫色斑点时,若样品未出现紫色斑点,则检测结果为 阴性
GB/T36841一2018 参 考 文献 [1]李明福,相宁，朱水芳.进境植物检疫性有害生物-病毒卷[M].北京:农业出版社 2013:106-110. [2]BoutsikaK，PhillipsMs,MacfarlanesA，etal
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桃丛簇花叶病毒检疫鉴定方法GB/T36841-2018
随着全球贸易的不断发展，植物病毒的传播已经成为一个全球性的问题。桃丛簇花叶病毒是一种常见的植物病毒，它可以感染桃树、杏树、樱桃树等多种果树和观赏树木，严重危害了果树和观赏树木的生长和产量。因此，对桃丛簇花叶病毒的检疫鉴定方法的研究具有重要的现实意义。
GB/T36841-2018的制定背景
GB/T36841-2018是由中国国家标准化管理委员会发布的《植物病毒检疫鉴定方法 桃丛簇花叶病毒检疫鉴定方法》标准。
该标准的制定是为了规范桃丛簇花叶病毒的检疫鉴定方法，提高检疫工作的准确性和效率，保护我国的农业生产和观赏业发展。该标准的发布填补了国内桃丛簇花叶病毒检疫鉴定方法的空白。
GB/T36841-2018的主要内容
GB/T36841-2018主要包括以下内容：
- 术语和定义
- 试剂和材料
- 样品收集和处理
- 病毒的检测方法
- 结果判定和报告编制
- 检测质量控制
该标准明确了桃丛簇花叶病毒的检测方法、结果的判定标准和报告编制等方面的要求，为桃丛簇花叶病毒的检疫鉴定提供了科学可靠的技术支持。
结论
GB/T36841-2018的发布，标志着桃丛簇花叶病毒的检疫鉴定方法已经得到了国家的认可和推广。对于加强我国植物病毒的检测、预防和控制具有重要的参考意义。
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