甘蔗宿根矮化病菌实时荧光PCR检测方法

甘蔗宿根矮化病菌实时荧光PCR检测方法

国家标准 GB/T36829一2018 甘蔗宿根矮化病菌 实时荧光PCR检测方法 DeteetionofLeifsoniaxylisuhsp.xylibyreal-timePCR 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/36829一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心、农业部甘蔗及制品质量监督检验测试 中心,农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室 本标准主要起草人:高三基、孙生仁、王恒波、傅华英、黄美婷、王锦达、张慧丽、陈如凯
GB/T36829一2018 引 言 本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及到与甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量 PCR相关的专利的利用 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判 该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案 相关信息可以通过以下 联系方式获得: 专利持有人姓名:王恒波 地址;福建省福州市仓山区上下店路15号 请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任
GB/36829一2018 甘蔗宿根矮化病菌 实时荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了甘蔗宿根矮化病菌(Leifsonia.zylisubsp..ryi)实时荧光PCR检测方法的仪器与 设备、试剂与材料、样品的采集与前处理、检测以及结果判断与表述等 本标准适用于可能带有甘蔗宿根矮化病菌的活体寄主植物的快速检测、诊断 缩略语 下列缩略语适用于本文件 nmoniumBromide CTAB;十六烧基三甲基嗅化铵(CetyltrimethyAmm Ct值:循环闵值(CycleThreshold DNase;脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease) FAM:6-基荧光素6-Carboxy-Fluorescein 甘蔗宿根矮化病菌(Lei/somia.rvisubsp y lXX Par-l:甘蔗宿根矮化病菌基因组上编码的一种致病性基因(PathogenicityGene-1 PCR;聚合酶链式反应(Poly meraseChainReaction RNase;核糖核酸酶(Ribonuelease) TAMRA6-拨基四甲基罗丹明(6-Carboxytetramethylrhodaminey 甘蔗宿根矮化病菌基本信息 甘蔗宿根矮化病菌属于微杆菌科Microbacteriaceae雷弗松氏细菌属Leifsonia成员,拉丁文学名 名称为Leifsonia.ryisubsp ryi,缩写为Lxx 甘蔗宿根矮化病菌其他信息参见附录A 方法原理 根据宿根矮化病菌的致病基因Pat-1序列设计一对仅在该病菌Pat-1基因间保守的特异性引物和 -条特异性的荧光双标记TaqMan探针 在实时荧光PCR扩增反应中,TaqMan探针的荧光信号强度 伴随着目标序列PCR扩增产物的增加呈正比关系,通过收集PCR扩增过程的荧光信号值,即可判断试 样是否带有目标序列 仪器与设备 750 5.1实时荧光PCR检测仪:激发/检测波长范围350nm" nm;可用SYBRGreenI染料和 TaqMan探针;升降温速度>2.0C/s;均一性士0.5C;准确性士0.3C;温度范围4C~100C 5.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 5.3电子天平:感量0.01g
GB/T36829一2018 5.4高速台式冷冻离心机:;离心力12000以上 5.5微量加样器;0.1AL2.5 0.5AlL~10AL,2AL20AL,10Ll00L,20AL一200L 50AL~1000 Al 5.6离心管;l.5ml2.0ml 5.7PCR反应管、,带滤芯Tip头、实时荧光PCR反应管 5.8恒温水浴锅 5.9鼓风干燥箱 5.10冰箱;2C一4C、一20C、一80C 5.11生物安全柜 5.12采样工具:砍刀、剪刀、锻子,带槽钻子 o 试剂与材料 6.1试剂 除非另有规定外在分析中仅使用分析纯试剂,实验用水符合GB/T6682的二级水指标,其中涉及 PCR的用水要求达到一级水指标 6.1.1无水乙醉 6.1.2异丙醇 6.1.3仔基乙醇 6.1.4RNase酶(10mg/mL) 6.1.5三氯甲熔-异戊醇(24:1) 6.1.6苯酚-三氧甲婉-异戊醇(25:24:1) 6.1.7荧光PCR反应混合液 包括2×荧光PCR反应液(含TaqDNA聚合酶)、5'-引物,3'-引物、TaqMan探针等,具体配制方 法见附录B 6.1.82xcTAB抽提缓冲液:100mmol/LTris-Hcl(pH8.0),20mmol/IEDTA-Nag,1.4mol/1氯 化钠,2%CTAB,使用前加人0.1%体积分数)的P-基乙醇 6.1.93nmol/L醋酸钠(NaAc,pH5.2). 6.1.1070%乙醉 6.1.11无菌水 6.1.12检测引物 5'-引物;5'-GGTTcCATTGCTTAccGATT-3' 38'-引物;5'-CAAGTTTcGACAGGAACAGC3' 扩增片段大小:106bp 6.1.13TaqMan探针;5'-FAM-CCACGGCTACGTCAATTcGGG-TAMRA-3' 6.2材料 6.2.1阳性对照:用已知含甘蔗宿根矮化病菌的甘蔗样品作阳性对照 6.2.2阴性对照:;用已知不含甘蔗宿根矮化病菌的甘蔗样品作阴性对照 6.2.3空白对照;用无菌一级水代替样品
GB/36829一2018 样品的采集与前处理 7.1取样工具准备 砍刀、剪刀、镀子、带槽钻子等取样工具应经121C士2C、1.1×10Pa高压灭菌15min或经 60干热灭菌2h 7.2采样方法 7.2.1采样过程中应避免样本交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次性手套,每采一个样品后， 采样工具用75%乙醇进行消毒 7.2.2叶片样品:用剪刀取甘蔗植株或种苗最高可见肥厚带叶上一叶(一1叶)叶片,编号备用 7.2.3蔗汁样品;用带槽钻子钻取甘蔗植株基部蔗茎蔗汁1ml于1.5mL离心管,若为甘蔗蔗种,取中 部种茎,编号备用 7.3存放与运送 采集或处理的样本在2C一8C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,要求放置一80C冰箱 但应避免反复冻融 采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,或用液氮处理,尽快运送到实 验室 检测 8 8.1蔗叶总DNA的提取 8.1.1蔗叶总DNA的提取应在样品处理区进行 取1.5mL无DNase酶的离心管,并对每个管进行 编号 8.1.2称取0.1g一0.2只蔗叶样品材料,并用液氮研磨成粉末状(要保持液氮不挥发干净) 8.1.3向1.5mL离心管中加人粉末,等液氮刚挥发完立即加人600l预热(约65C)的cTAB缓冲 液,充分摇匀 8.1.465C保温60min,每隔15min一20min摇匀1次 B.1.51200！离心10mim,弃沉淀-取上请液移至新离心管,加人等体积装爵-三氨甲烧-异皮醉(5 24:1),剧烈振荡30s 8.1.612000离心10tmin,弃沉淀,取上清液移至新离心管,加人等体积三氯甲熔-异戊醇(24:1). 剧烈振荡30s 8.1.712000尽离心10min,弃沉淀取上清液移至新离心管,先加1/10体积预冷(4)的3mol/几 NaAc(pH5.2),再加等体积预冷(4C)的异丙醇,将离心管轻轻翻转几次(约5s),一20C放置20min~ 30min 8.1.812000离心10min,弃上清液,沉淀用70%乙醉洗涨2次,每次1200 离心1min,最后用 无水乙醇洗涂1次,并1200《离心1nin 离心管内壁敞f(或用灭菌过的逃纸吸干)后,加30儿无 菌水溶解 加人IL10ms/'mL的Na爵.7飞水浴1h去除RNA.置一笔保存备用. 8.1.9 8.1.10使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计上测260nm和280nm处的吸光值A和Am DNA浓度按式(l)计算 =A0×N×50/1000
GB/T36829一2018 式中 -DNA浓度,单位为微克每微升(4g/pL); -260nm A0 处的吸光值; N -DNA稀释倍数 当A260/A28O 比值在为1.8一2.0之同时,适合于实时荧光RcR扩增 8.2蔗汁总DA提取 8.2.1取1.5ml、,2.0ml无DNase酶的离心管,并对每个管进行对应编号 8.2.2取0.5ml蔗汁于1.5mL离心管中,3000离心5min,取上清液300L移至2.0ml，离心 管中 8.2.3加人600L预热(约65C)的cTAB缓冲液,充分摇匀 8.2.465C保温60min,每隔15min- 120min摇匀1次 8.2.5加人600L.三氧甲炕-异戊醇(24:1)剧烈摇晃30s,12000离心10 min 8.2.6取上清液移至新的1.5m离心管中,加人等体积三氯甲炕-异戊醇(24:1),轻轻翻转几次(约 5s)，12000！离心10min 8.2.7取上清液移至新的1.5mL离心管,先加1/10体积预冷(4C)的3nmol/LNaAe(pH5.2),再加 等体积预冷(4C)的异丙醇,将离心管轻轻翻转几次(约5s),-20C放置20min~30min. 8.2.812000片离心10nmin,弃上清液沉淀用70%和无水乙醇各洗涤一次,每次12000！离心 1min 离心管内壁晾干(或用灭菌过的滤纸吸干)后,加304l无菌水溶解 8.2.9同8.1.9 8.2.10同8.1.10 8.3实时荧光CR反应 8.3.1实时荧光PCR反应应在核酸检验区进行 从试剂盒中取出含有TaqDNA聚合酶的荧光PCR 反应液,在冰上融化后,2000尽离心5s 每个测试样本PCR反应体系见附录B 每个反应体系应设 置3个平行反应 8.3.2根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量,全部加完后,充分混合均匀,2000离心5s 向 每个实时荧光PCR管中各分装24.0AL 8.3.3在各设定的实时荧光PCR管中分别加人模板DNA溶液各1.0L.DNA约100ng),空白对照 加1.0!L无菌水代替模板 盖紧管盖后,轻微混匀,500g离心30s 将8.3.3中加样后的实时荧光PCR反应管放人荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序 实时荧 8.3.4 光CR反应条件随不同仪器略有改变，一般的反应程序为;s0c2min.5七变性10mm,95C15， 60C1min,40个循环 在每次循环的延伸阶段收集荧光信号 结果判断与表述 9 9.1结果分析条件设定 实时荧光PCR反应结束后,设置荧光信号值,闯值设定原则根据仪器噪音情况进行调整,以值 线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准 9.2对照结果 检测过程中分别设阳性对照,阴性对照和空白对照 用已知含甘蔗宿根矮化病菌的样品作阳性对 照,用已知不含甘蔗宿根矮化病菌的样品作阴性对照,用等体积的无菌一级水代替模板DNA作空白
GB/36829一2018 对照 空白对照,无Ct值且无扩增曲线;阴性对照,无Ct值且无扩增曲线;阳性对照,Ct值应小于或等于 30.0,并出现典型的扩增曲线 否则,此次实验视为无效,需要查明原因重新检测 g.3检测结果的判定 g.3.1阴性 Ct值大于或等于40.0,且无典型的扩增曲线,表示样品中不含甘蔗宿根矮化病菌 g.3.2阳性 C值小于或等于35.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中含甘蔗宿根矮化病菌 9.3.3有效原则 Ct值大于35.0且小于40.0,并出现典型的扩增曲线的样本应进行重做检测实验 重复实验的结 果ct值仍然大于35.0且小于40.0,并出现典型的扩增曲线,则判定样本检测结果为阳性;C!值大于或 等于40.0,则判定样本检测结果为阴性 9.4结果表述 该试样中检出甘蔗宿根矮化病菌 该试样中未检出甘蔗宿根矮化病菌
GB/T36829一2018 附 录 A 资料性附录) 宿根矮化病菌其他信息 病菌粒体形态特征 该病菌为革兰氏阳性细菌,菌体呈直或微弯的细长棒状,有的中部或一端膨大,内有间体,菌体大小 为(0.25m~0.5mx(1Mm一4Mnm) 病菌基因组大小约2.6Mb A.2寄主范围 寄主为甘蔗属中的热带种(Saccharumo/ieinarum),大茎野生种(Saccharumrobustum,种 (Saccharum sinensis)、割手密(Saccharumspontaneum)和甘蔗栽培种(Saccharumspp.hybrid) 3 病害症状 A 感染的蔗株表现植株矮化,生长不良 剖开蔗茎可见病株的幼茎顶端生长区组织或成熟蔗茎基部 节部维管束组织呈现粉红色至橙红色病症,颜色深浅常因品种而异 A.4分布地区 甘蔗宿根矮化病于1945年在澳大利亚昆士兰首次发现,随后在美国、南非、、印度、巴西等多数 种植甘蔗的国家或地区都有分布 A.5传播途径 主要通过感病的无性繁殖材料(种质)传播,也可通过收获机械传播
GB/36829一2018 附录B 规范性附录 每个测试样本荧光PCR扩增反应体系 每个测试样本荧光PCR扩增反应体系见表B.1 表B.1每个测试样本荧光PCR扩增反应体系 试剂 使用量/l 25l反应体系终浓度 2×荧光PCR反应液(含TaqDNA聚合酶 12.5 5'-引物(10mol/IL 2.25 0.9mol/1 3'- '-引物(10pmol/L 2.25 0,9Mmol/1 费光探针0pmlL) l.0 0.4mol/I 模板DNA 1.0 补无菌水至25 无菌水 注1:PCR反应体系中各种试剂的使用量可根据具体情况进行适当调整 注2，可采用商品化试剂盒进行样本的荧光PCR扩增
GB/T36829?2018 diseaseof [1]DavisM.Gilla lspieAGJHarisRw.LonsonRH.1980.Ratoon.stunmimng sugarcane:Isolationofthecausalbacterium.Seience210:1365-1367 Evtushenko Subbotin [2] TiedjeJ.2000.Leifsoniapoaegennov.sp IDorofeeva nov.isolatedfromnematodegalls Poannua andreclassificationof Cor"7nebctern1gti6 Leifson1962 ILeifson1962 1 agatica nomreV. cOmb.nOVand gennov. Clazuibacter.rliDavis 1984with .xyliDavis 1984 Subspeciesas gen. nov.combnov.InternationalJournalofSystematicEvolutionaryMicrobiolo 50:371-380 logy FeganMCroftBJTeakleDSHayward SmithGR.1998.Sensitiveandspecific detectionofClaibacte causativeagentofratoonstuntingdiseaseofsugarcane Subsp.yli withapolymerasechainreaction-basedassay.PlantPathology47;495-504 FuH-Y,SunSRWangJ-DAhmadKWangH-BChenR-KGaoSJ.2016.Rapidand QuantitativeDetectionofLeifsonia..rylisubsp..ryliinSugarcaneStalkJuiceUsingaReal-timeFlu- orescentTaqManPCRAssay.BioMedResearchlnternational12:l-8. RichardEP.2007.EarlydetectionofLeifsonia.rylisubsp.ryliin [51 GrishamMPPanY sugarcaneleavesbyreal-timepolymerasechainreaction.PlantDisease91:430-434. [6 HarrisonNAandDavisMJ.1988.ColonizationofvasculartissuesbyClazuibacter.ryli subsp.zyliinstallksof cultivarsdifferinginsusceptibility stuntingdisease.Phy SugarCane tOratOOn topathology78:722-727 Monteiro-VitorelloCBCamargoLEAVanSluysMAKitajimaJPTruffDetal 2004.ThegenomesequenceoftheGrampositivesugarcanepathogenLeifsomiarylisubsp.ryli.Mo lecularPlant-MicrobeInteractions17:827-836. [8]PelosicsLourencoMV,SilvaMSantosAZFrancasCMarinsM.2013.Develop mentofaTaqmanrealtimeCRassayfordetectionofLei/fsonia.ryisubsp.ryli.TropicalPlantPa thology38:343-345.

甘蔗宿根矮化病菌实时荧光PCR检测方法GB/T36829-2018

甘蔗宿根矮化病是由甘蔗宿根矮化病菌引起的病害，其危害对甘蔗的生长发育和产量都有着显著的影响。因此，对于甘蔗宿根矮化病的快速、准确检测就显得尤为重要。

实时荧光PCR技术作为一种高灵敏度、高特异性、高效率的分子生物学检测方法，在甘蔗宿根矮化病的检测中具有广泛的应用前景。

GB/T36829-2018是我国发布的《甘蔗宿根矮化病菌实时荧光PCR检测方法标准》，该标准规定了实时荧光PCR检测方法的操作流程、仪器设备、试剂材料和质量控制等方面的要求，为甘蔗宿根矮化病的快速、准确检测提供了技术指导。

具体来说，该标准要求在DNA提取、PCR反应和数据分析等步骤中，都需要进行质量控制，以保证结果的准确性和可靠性。

其中，DNA提取过程中需要使用优质的DNA提取试剂盒，并通过比较三种不同提取方法的效果，选择最适合的提取方法。

在PCR反应过程中，需要选择合适的引物和探针，并进行反应体系的优化，同时还需要进行PCR产物的检测和分析，以确定PCR反应的特异性和灵敏度。

最后，在数据分析过程中，需要对荧光信号进行采集和分析，并根据标准曲线计算样品中甘蔗宿根矮化病菌的浓度。

总之，GB/T36829-2018标准提供了一套完整的实时荧光PCR检测方法，可以为甘蔗宿根矮化病的快速、准确检测提供技术支持和保障。

甘蔗宿根矮化病菌实时荧光PCR检测方法的相关资料

和甘蔗宿根矮化病菌实时荧光PCR检测方法类似的标准

GB/T36829-2018

甘蔗宿根矮化病菌实时荧光PCR检测方法

2022/8/12 2:44:18 现行