GB/T27529-2011
马接触传染性子宫炎诊断技术
Diagnostictechniquesforcontagiousequinemctritis
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2012-03-01
- 文件格式PDF
- 文本页数11页
- 文件大小414.36KB
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马接触传染性子宫炎诊断技术
国家标准 GB/T27529一2011 马接触传染性子宫炎诊断技术 Diagnostictechniquesforcontagiousequinemetritis 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27529一2011 前 言 本标准的附录A,附录B附录C为规范性附录
本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口
本标准起草单位山东出人境检验检疫局、新疆出人境检验检 疫局
本标准主要起草人;朱来华,梁成珠、郑小龙、肖西志、邓明俊、辛学谦,谭乐义、方绍庆、王宫璞 岳志芹,季新成、王群、孙涛,赵玉然
GB/T27529一2011 马接触传染性子宫炎诊断技术 范围 本标准规定了马接触传染性子宫炎(contagiousequinemetritis,CEM)的诊断技术
本标准适用于马接触传染性子宫炎的诊断和检疫
规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款
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GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法,培养基和试剂 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 临床检查 3.1临床特征 公马感染马生殖道泰勒氏杆菌后不表现任何临床症状,当母马感染后表现阴道炎、子宫颈炎,初期 外阴部出现大量渗出物或灰色炎症分泌物,后期渗出物或分泌物逐渐变成黏稠的脓液,其中含有大量的 多核细胞、黏膜脱落细胞和崩解的细胞碎片
3.2判定 根据3.1临床检查可作出初步判定
为了确诊需进行实验室检查，细菌学检查是确诊本病最可靠 的方法
病原分离与初步鉴定 材料准备 器材 微量移液器 二氧化碳培养箱
普通冰箱及低温冰箱(4C、一20C)
离心管
普通生物显微镜
暗视野或相差显微镜
载玻片
接种环 4.1.1. .g 擦镜纸
4.1. 实验室用水 实验室用水是指实验室用于溶解、稀释或配制溶液的水,可用多次蒸或离子交换等制备,符合 GB/T6682二级水要求
4 1. 培养基 3 4.1.3.1运输培养基;见附录A
4.1.3.2选择性琼脂培养基;见附录A
GB/T27529一2011 4.1.3. 含硫酸链霉素(2004g/mL)选择性琼脂培养基;见附录A 4 4.1.3. 卵黄氯化钠琼脂培养基;见附录 A 4
.1. 试剂 4 4.1.4.1除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯
4.1.4.2革兰氏染色液;按GB/T4789.28一2003中2.2规定配制
过氧化物酶试验试剂按GB/T4789.282003中3.18规定,临用时配制
氧化酶试验试剂;按GB/T4789.28-2003中3.20规定,临用时配制,于冰箱内避光保存 样品采集和运送 在采集汹尿生殖道拭子前应至少停用抗生素药物7d,也不得使用消毒药物冲洗泌尿生殖道 母马或公马保定后,用高压消毒的棉拭子刮擦泌尿生殖道黏膜(尿道隐窝、尿道窦、尿道或阴茎鞘 以刮取含有细胞,分泌物的样品
从阴蒂窝和阴蒂窦刮取拭子进行分离培养即可证明马生殖道泰勒氏 杆菌的存在,但要获得纯净的培养物,应从子宫颈或子宫内膜中采集样品来分离
公马;每匹公马分别从阴茎基部/包皮处(包皮垢,尿道隐窝/尿道窦,尿道口采集3份拭子
未怀孕母马;每匹母马分别从子宫颈、阴蒂隐窝,阴蒂窦采集3份拭子
怀孕母马;每匹母马分别从阴蒂隐窝、阴蒂窦采集2份拭子
棉拭子采集后,迅速插人装有1mL2mL含活性炭的运输培养基离心管内,以吸附掉细菌代谢产 生的抑制因子
在低温条件(2C一8c)下,样品尽快(24h48h内)送往实验室
4.3病原分离培养 样品到达实验室后,立即用棉拭子蘸取样品液直接涂布于选择性琼脂培养基和含硫酸链霉素 (2004g/mL选择性琼脂培养基平板上,每个拭子均接种2个平板
平板在5%~10%的二氧化碳培养箱内35C37C培养,最初24h应检查是否有杂菌污染
48h后应每天观察,培养7d14d. 4.4病原初步鉴定 4.4.1菌落鉴定 48h后应每天观察琼脂培养基
观察培养基上有无疑似特征性菌落
马生殖道泰勒氏杆菌的菌 落很小,直径2 n,边缘完整光滑,有光泽,呈浅灰黄色
如无特征性菌落,可弃之
mm3mm 4.4.2革兰氏染色鉴定 按GB/T4789.282003中2.2规定操作
4.4.3湿片动力试验 取干净载玻片一块,用微量移液器加一滴生理盐水,无菌挑取少量菌落,涂抹分散均勺
使用暗视 野或相差显微镜检查,先用低倍物镜,再用高倍物镜,观察细菌形态特征与动力特征
4.4.4生化鉴定 4.4.4.1 氧化酶试验 取典型菌落,按GB/T4789.282003中3.18规定操作
4.4.4.2过氧化氢酶试验 取典型菌落,按GB/T4789.28一2003中3.20规定操作 4.4.4.3磷脂酶试验 用接种环挑取固体培养基上典型菌落,点种于卵黄氯化钠琼脂平板(每张平板至少可接种10点)， 在5%一10%的二氧化碳培养箱内7飞厌氧培养21h,观察接种点的变化 磷脂酶试验阳性者产生卵磷脂酶,分解卵黄中的卵磷脂,接种点的底部及周围形成乳白色的混 浊带
GB/T27529一2011 4.5结果判定 4.5.1根据细菌的菌落特征,革兰氏染色特征,湿片动力试验,过氧化氢酶试验、磷脂酶试验和氧化酶 试验的结果可进行初步鉴定
4.5.2马生殖道泰勒氏杆菌生长缓慢,菌落很小,直经2mm一3mm,边缘完整光滑,有光泽,呈浅灰 黄色 马生殖道泰勒氏杆菌革兰氏染色阴性,杆状或球杆状,有时呈多形态(长达6am),并可表现两 4.5.3 极着色
4.5.4马生殖道泰勒氏杆菌无运动性
4.5.5马生殖道泰勒氏杆菌能产生过氧化氢酶和磷酸脂酶,氧化酶强阳性,无其他生化反应
4. .5.6凡符合马生殖道泰勒氏杆菌一般特征和生化特性的细菌,可初步判定为马生殖道泰勒氏杆菌， 如初步判定为马生殖道泰勒氏杆菌,则需要进一步应用马生殖道泰勒氏杆菌特异抗血清进行血清学 鉴定
病原血清学鉴定技术 玻片乳胶凝集试验 5 试验材料 5.1.1.1马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原
55 .1.1.2马生殖道泰勒氏杆菌阳性血清致敏乳胶
5.1.1.3马生殖道泰勒氏杆菌阴性血清致敏乳胶
5.1.1.4载玻片
5.1.1.5玻璃铅笔
5. .1.1.6接种环
5. .1.1.7牙签或火柴杆
5.1.2操作程序 使用前,马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原应充分振荡,所有试剂在室温平衡使其温度达到20C 左右
取洁净载玻片一块,用玻璃铅笔划成小格
滴加1滴马生殖道泰勒氏杆菌阳性血清致敏乳胶(约25AL.),再用接种环在琼脂培养基上钩取待 鉴定细菌培养物适量,或滴加1滴液体培养物(约25aL) 同时于载玻片另一端滴加l滴马生殖道泰勒氏杆菌阴性血清致敏乳胶,同样钩取该细菌培养物混 匀于其中
以牙签或火柴杆混匀,在3min5min内判定结果
5.1.3结果判定 “十十+”:100%凝集,全部乳胶凝集,成絮状团块,出现大的凝集片或粒状物,液体清亮
“十十十”;75%凝集,大部分乳胶凝集成较小的颗粒,有可见凝集块,液体清亮,几乎完全透明
“十+”:50%凝集,半量乳胶凝集成细小颗粒,出现比较明显的颗粒状凝集颗粒或小凝块,液体不甚 透明
“十”;25%凝集,仅可勉强看到粒状物,或较少量的乳胶凝集成可见的细颗粒,液体混浊
”无凝集现象,全部乳胶液体仍为均匀混浊,无颗粒
以“十+”或以上的反应强度作为该反应滴度的终点,判为凝集试验阳性
5.1.4结果说明 玻片乳胶凝集试验因可能出现非特异性凝集反应,仅用做马生殖道泰勒氏杆菌的初步血清学鉴定
GB/T27529一2011 5.2间接荧光抗体法 5.2. 试验材料 1 5 .2.1.1马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原
5.2.1.2马生殖道泰勒氏杆菌荧光标记的标准阳性血清
5.2.1.3 马生殖道泰勒氏杆菌标准阴性血清
异硫氢酸荧光素(FITC)标记的抗抗体诊断液
0.1molLpHH8.0磷酸盐缓冲液(PBs)(见附录B) 5.2. 5.2.1.6甘油缓冲液(见附录B). .2.1.7丙酮;乙醉(体积比1;l，一20C预冷 5.2.1.8恒温培养箱
5.2.1.g 费光显微镜 5.2.1.10载玻片
5.2.1.11盖玻片
5.2.1.12玻璃铅笔 5.2.1.13接种环 5.2.1.14错子 5.2.1.15染色缸
5.2.2操作程序 取一干净载玻片,用玻璃铅笔画定样品区域(直径0.5em),用接种环在琼脂培养基上钩取待鉴定 细菌培养物适量,涂布均匀,风干
同时以马生殖道泰勒氏杆菌的标准抗原作为阳性对照
待涂片似干未干时,滴加预冷丙酮.乙醇液,固定细胞5min- 10min
用缀子将载玻片放人PBS液染色缸中充分漂洗，经过3次,每次3min一5min 将载玻片上多余的水擦干,分别取10l马生殖道泰勒杆菌的标准阳性血清、标准阴性血清(事先 用PBS稀释10倍一20倍)滴于标本上,放于湿盒内,37C温育30min
将载玻片上多余的水份擦干,滴加10L异硫氮酸荧光素(FITc)标记的抗抗体诊断液(以PBS稀 释至工作效价),并使它布满整个标本
置湿盒中,放37C温箱,作用30min,取出玻片,用PBS充分漂洗，经过3次,每次3min~5min
将载玻片上多余的水份擦干,在标本处滴一小滴甘油缓冲液,轻轻加上盖玻片
5.2.3结果判定 将载玻片放在荧光显微镜载物台上,调好光源即可观察
阳性反应者FITC荧光色素呈明亮的黄 绿色荧光
5 2 结果说明 间接荧光抗体法因特异性强、灵敏度高,可用做马生殖道泰勒氏杆菌的最后确诊 病原套式CR分子鉴定 材料与试剂 6 1.1仪器与器材 6 PCR扩增仪
6 1.1.2 高速台式冷冻离心机(离心速度12000r/min以上)
6 台式离心机离心速度2000r r/min
6 1.1.4混匀器
6 1.1.5冰箱(2C8和一20两种). 6.1.1.6微量可调移液器及配套带滤芯吸头
GB/T27529一2011 6.1.1.7Eppendorf管(1.5mL带盖塑料离心管)
6.1.1.8稳压稳流电泳仪和水平电泳槽
6 电泳凝胶成像系统(或紫外分析仪) 6 试剂 6 蛋白酶K:见附录C
6 10%SDs液:见附录C 异丙醉;一20C预冷 NaAc(3mol/L):见附录C 75%乙醇:见附录C Taq酶:5U/L 0×XPCR缓冲液
mmol/L
小NTPs:含有dATP,dTTP,dCTP,dGTP各2.51 电泳缓冲液:用5×TBE电泳缓冲液稀释成工作浓度,即0.5×TBE缓冲液(见附录C)
6.1.2.10EB,见附录C 6.1.2.11 加样缓冲液(6×):见附录C
6.1.2.120.1lmol/LPBs(pH8.0)见附录B 6.1.2.13引物;加灭菌蒸懈水配制成20mol/1工作液(见表1). 表1套式PCR引物序列 序列 在l6SrRNA位置 名称 5'-ccATTAGAGGcTGTTAATcAATcGGGAAAcc-3” 38-67 上游外侧引物PP 上游内侧引物PP2 5'-CCATACcGAACCCAATACCAAGCACACAAG-3’ 245-274 下游引物PR1 5'-GTGTCATTAAGGTGTGTATTTGGTC'TGGTG3’ 482-453 6.2DNA模板的制备 取n个灭菌的1.5mLEppendori管,其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和阳性对照,阴 性对照在试剂盒中已标出),编号 用微量可调移液器于每管加pH7.0PBSs1mL将生殖道拭子浸泡、挤压后,于4C15000r/m离 1min,去上清液
心 用微量可调移液器于每管加人蛋白酶K至终浓度100/ml和sDS至终浓度10g/L,55C水浴 2 h
. 用微量可调移液器于每管分别加人苯盼,苯酚-氯仿-异丙醇混合液(体积比为25:24:1、氯仿,在 混匀器上剧烈混匀,各抽提1次,吸取水相转移至新Eppendor管
用微量可调移液器及配套带滤芯吸头于每管加人1/10体积3mol/L的NaAc和2.5倍体积的无 水乙醇,轻轻混匀后置一20C沉淀1h,4C条件下12000r/min离心15min,弃掉上清液
用微量可调移液器于每管加人75%乙醉洗涤,4C条件下12000r/min离心5min,沉淀烘干后悬 浮于水中,取适量用作PCR模板
若需长期保存应放置一70C冰箱
6. 3 半套式CR程序 第一次CR反应 第一次PCR反应液组成如下: 10×PCR缓冲液 5Ml Mg(Cl,(25mmol/L 4l dNTP(2.5mmol/L 4Ml 引物PPI(20mol/) lL
GB/T27529一2011 引物PR1(204mol/L lL Taq酶((5U/AL)) 0.5L 2Ml DNA模板(I0ng/L) 水 32.5L 在PCR管内加人上述成分,总体积为50AL,3000r/min离心10s
将PCR反应管置于PCR扩增仪
先95C5min,再进行95C30s、5830s、72C30s,35次 循环,然后72C10min,最后4C保温
6.3.2第二次PCR反应 第二次PCR反应液组成如下 10×PCR缓冲液 5 l MgCl.(25mmol/L 4l dNTPs(2.5mmol/L 4L 引物PP2(20pmol/L) lAL 引物PR1(20pmol/L) lL 0.5 l Taq酶(5U/L) DNA模板(10ng/aL 2 L 水 32.5Al 第一次PCR R产物在带稳压稳流电泳仪的水平电泳槽内逃行琼脂糖凝胶电泳后，在电泳凝胶成像 系统(或紫外分析仪)上进行观察
如果不出现445bp的DNA扩增条带,取2L.产物做模板;如果电 泳后出现445bp的DNA扩增条带,则需将产物按1:1000稀释后,取24l作为第二次PCR的模板
在PCR管内加人上述成分,总体积为50L.3000r/min离心10s 将PCR反应管置于PCR扩增仪
先95C5min,再进行95C30s,62C30s,7230s,35次 循环,然后72C10min,最后4C保温
6.3.3对照设立 从6.2DNA模板的制备开始,设立阳性对照、,阴性对照
以含有已知马生殖道泰勒氏杆菌NcTC 11184株的细菌悬液作为阳性对照,蒸憎水作为阴性对照
6.3.4PCR产物琼脂糖电泳 用TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖(含0.54g/mlEB)平板
将平板放人水平电泳槽,使电泳 缓冲液刚好淹没胶面
将10AL样品和2L加样冲液(6×)混匀后加人样品孔
在电泳时设立DNA 标准分子量作对照
5V/em电泳约30min,当澳酚蓝到达底部时停止
在紫外灯下观察结果
6.4结果判定 第一次PCR后阳性对照会出现一条445bp的DNA片段
阴性对照则无 第二次(半套式)PCR后,阳性对照会出现一条238bp的DNA片段
阴性对照则无
待测样品PCR扩增后,如能在相应445bp,238bp位置上出现DNA条带,即可判定为阳性反应
必要时对扩增产物进行序列测定与比对
6 结果说明 套式PCR技术因特异性强、灵敏度高,结合PCR序列测定、比对,亦可用做马生殖道泰勒氏杆菌的 最后确诊
GB/T27529?2011 ?A 淶?? ? A.1 ?(NaCD) 3.0g 0.2 ?(KCD g ?(CaCl 0.1 ??(MgCl, 0.1 (KHPO 0.2g (NaHPO 1.15g (C,HNaO.s) 1.0 g ? 10.0g" ? 4.0g ??,???1000ml,??107.9kPa121C?15 min ??.5"%()???? ? 10.0g ? 3.0g 5.0 ? g ? 15.0g 900ml?,?107.9kPa121C?15min?70C80?, 50nl.??,70C?80??12mim,???;??45C?50c,1ml 100mg/ml?(?0.83mol/I)lml277mg/ml(?1.59mol/L) ??(ls/ml.).ù(5g/ml)ùB(Sp/mL)?? 1000mL;?,??,??4nmm,???? 3 ù(200g/mL)?? A." 5%()????ù(20o /mL 4g ???(?? A.4.110"%??? ??1,???,10%??100mL,?, A.4.2?? ? 6 g ? 1.8g ? 23 g 30 ?(NaCD) g ? 650ml 0%??? 100mL ??(10%??),??,pH??7.6107.9kPa121C ?15min,?60C,?10%???100ml,?,??
GB/T27529?2011 ? B 淶?? ???? B.10.1mol/1λ?(PBs,pHH8.0) 5.59g 0.41g ?5.59g0.41g,??1000ml,??ɡ B.2?? 90mL 0.1mol/LPBS(pH8.0 10mL ?90mL?10mLpH8.0PBS?,???
GB/T27529一2011 附 录 c 规范性附录 PCR试剂配制方法 c.1蛋白酶K(10mg/mL 50 蛋白酶K mg 5mL 蒸溜水 50mg蛋白酶K溶于5mL蒸水中,分装成每管1mL,一20C保存 C.210%SDs 100 SDS(十二熔基磺酸钠 g 1000mL 蒸溜水 100gSDS在900ml.水中溶解,加热至68助溶,加水定容至1000ml,室温保存
C.33mol/L醋酸钠 408g醋酸钠(Na.Ae3H.O),在900ml水中溶解,加水定容至1000 ml,室温保存
107.9kPa、 121C高压灭菌15min. C.475%乙醇 燕僧水 75mL 无水乙醇 25mL 用无水乙醉醇和蒸僧水充分混匀,-20C预冷
C.55×TBE电泳缓冲液(5×浓缩液 Tris 54.0g 砌酸 27.5g EDTA 2.9 g 加三蒸水到 1000mL 用5mol/L的盐酸(Hcl)调到pH8.0,或直接购买商品化的产品
c.6EB(染色剂 100 澳化乙锭(EB) mmg 蒸水 10m 用三燕水配制成10mg/mL的浓缩液,使用时每10mL琼脂溶液中加1L
C.7加样缓冲液(6× 0.25 澳酚蓝 g 蔗糖 40 C 蒸僧水 100ml 称取澳酚蓝0.25和蔗糖40g,充分溶解于80ml蒸水,最后定容至100mL
107.9kPa、 121C高压灭菌15 min
马接触传染性子宫炎诊断技术GB/T27529-2011
马接触传染性子宫炎是由细菌引起的一种常见马医学疾病，表现为慢性子宫内膜炎和输卵管炎。该病具有高度传染性，严重影响马的生殖健康和产能。为了更好地控制和预防马接触传染性子宫炎，国家制定了GB/T27529-2011标准，规定了马接触传染性子宫炎的诊断技术。
GB/T27529-2011标准规定了马接触传染性子宫炎的诊断技术应该具备的条件和要求。首先，要求检测方法必须具有高度敏感性和特异性，以确保检测结果的可靠性。其次，要求检测过程中应该采取严格的防污染措施，避免样本交叉感染。同时，还规定了检测时间、温度和荧光强度等参数的范围和要求。
马接触传染性子宫炎的诊断技术主要包括以下方面：
- 临床表现：通过观察马的临床表现，如子宫瘀血、分泌物异常等，初步判断是否存在马接触传染性子宫炎。
- 病原学检测：采集子宫分泌物或其他相关组织，使用细菌培养、PCR等技术检测病原体，并确定是否为引起马接触传染性子宫炎的病菌。
- 免疫学检测：采用ELISA、IFAT等技术，检测马的血清中是否存在抗体，确定是否感染了马接触传染性子宫炎。
总之，马接触传染性子宫炎的诊断技术是一个多方面、复杂的过程。GB/T27529-2011标准的制定和实施，为该疾病的规范诊治提供了保障。
