猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20752一2006 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中 硝基味喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Methodforthedeterminationresiduesofthemetabolitesofnitrofuran inpork，beef，chicken，porcineliverandaquaticproducts LC-MS-MSmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20752一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人;庞国芳,张进杰,曹彦忠,郭彤彤将曹亚平、范春林、李学民、刘永明 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20752一2006 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中 硝基肤喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品(鱼类、虾蟹类和贝类)中吠喃它(furaltadone)的代 谢物5-吗琳甲基-3-氨基-2-曙幽婉基酮3amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone，缩写为 AM0Z)、吠喃西林(nitrofurazone)的代谢物氨基脉(sermicarbazide，缩写为SEM)、吠喃妥因(nitro furantoin)的代谢物1-氨基-2-内酰脉(1-aminohydantoin，缩写为AHD)和吠喃哗酮(furazolidone)的代 谢物3-氨基-2-恶陛烧基酮(3-anmino-2-oxazolidinone，缩写为AOZ)残留量液相色谱-串联质谱测定 方法 本标准适用于猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品鱼类、虾蟹类和贝类)中5-吗啾甲基-3-氨基-2-陛 烧基酮、氨基脉,1-氨基-2-内酰脉3-氨基-2-恶陛婉基酮残留量的测定 本标准方法的检出限:5-吗啾甲基-3-氨基-2-恶幽婉基酮,氨基脉、1-氨基-2-内酰脉、3-氨基-2-嗯陛 烧基酮的检出限均为0.54g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分;总则与定义 GB/T6379.1一2004,IsO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,ISO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqIS03696:1987) 原理 试样中残留的硝基吠喃类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化,用Oasi、HLB或性能相当 的固相萃取柱净化 电喷雾离子化,液相色谱-串联质谱检测 用外标法或同位素标记的内标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为优级纯,水为GB/6682规定的一级水 甲醇;色谱纯 4.2乙睛:色谱纯 4.3乙酸乙酯;色谱纯 磷酸氢二钾,K,HPO 44 4 4.5乙酸 4.6二甲亚碱 4.7盐酸
GB/T20752一2006 氢氧化钠 4 .8 4 .9 2-硝基苯甲醛(2-NBA),C,H,NO;含量>99% 4 10磷酸氢二钾溶液;0.lmol/儿L 称取17.4g磷酸氢二钾(4.4),用水溶解,定容至1000 ml 4.11盐酸溶液:0.2mol/L 量取17mL浓盐酸(4.7)用水定容至1000mL 12氢氧化钠溶液;lmol/IL 称取40只氢氧化钠(4.8),用水溶解,定容至1000ml 4 4.13衍生剂含2-硝基苯甲醛0.05mol/L 称取0.075g2-硝基苯甲醛(4.9)溶于10mL二甲亚讽 (4.6),现用现配 4.14样品定容溶液;l0ml.乙睛(4.2),0.3ml乙酸(4.5),用水稀释到100ml 4.15四种硝基吠喃代谢物标准物质;喃它酮的代谢物5-吗啾甲基-3-氨基-2-恶陛烧基酮(3-at -amln0-5 yl20 morpholinometh emicarbazide，缩写为 -oxazolidinone，缩写为AMOZ),吠喃西林的代谢物氨基脉(se sEM),吠喃妥因的代谢物1-氨基-2-内酰脉(1-aminohydantoin 缩写为AHD)和肤喃哮囤的代谢物 缩写为A0Z)标准物质 四种标准物质的纯度均 3-氨基-2-恶陛烧基酮3-amino no-2-oxazolidinone 99% 4.16四种硝基吠喃代谢物内标标准物质;5-吗啾甲基-3-氨基-2-飕陛婉基酮的内标物,D-AM0Z;氨 基脉的内标物,C'N-SEM;1-氨基-2-内酰脉的内标物,C -AHD;3-氨基-2-呕陛炕基酮的内标物 D,-A0Z 四种内标标准物质的纯度均>99% 4.17四种硝基肤喃代谢物标准储备溶液l.0mg/ml 称取适量的四种硝基吠喃代谢物标准物质 4.15),分别用甲醉(4.1)稀释成1.0mg/mL的标准储备液 避光保存于一18C冰柜中,可使用大 四种硝基吠喃代谢物混合标准溶液;0.1g/mL 吸取适量四种硝基吠喃代谢物的标准储备溶 14g/ml的混合标准溶液,避光保存于一18C冰柜中,可使用三个月 液(4.17),用甲醇稀释成0.！ 4.19四种硝基吠喃代谢物内标标准储备溶液l.0mg/mL 称取适量的四种硝基吠喃代谢物内标标 准物质(4.16),分别用甲醇配成1.0mg/ml的标准储备液 避光保存于一18C冰柜中,可使用六个月 4.20四种硝基吠喃代谢物内标标准溶液.0.1g/mL 移取适量的四种硝基吠喃代谢物内标标准储 备溶液(4.19),用甲醇稀释成0.1ug/ml的混合内标标准溶液,避光保存于一18C冰柜中,可使用三 个月 4.21OasisHLB固相萃取柱或相当者:60mg,3mL 使用前分别用5mL甲醇和10nml水预处理 保持柱体湿润 0.2pm涉膜 4.22 仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪,配有电喷雾离子源 5.2分析天平;感量0.1g和0.01只各一台 5.3液体混匀器 5.4固相萃取装置 5.5氮气吹干仪 5.恒温振荡水浴 5.7真空泵;真空度应达到80kPa 5 .8 微量注射器;25l,100 5.9棕色具塞离心管:25mL,50ml 5.10pH计;测量精度士0.02pH单位 5.11贮液器;50mL 5.12离心机:转速40001 r/min以上
GB/T20752一2006 试样的制备与保存 试样的制备 实验室样品用组织捣碎机绞碎,分出0.5kg作为试样 6. 2 试样保存 试样置于一18C冰柜,避光保存 测定步骤 7.1混合基质标准校准溶液的制备 7.1.1样品称取和脱脂 称取5个阴性样品2g(精确到0.01g),分别置于50mL棕色离心管(5.9)中,加人10ml甲醇-水 混合溶液(2+1),均质1min,再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头,二者合并4000r/min离心 5nmin,吸取上清液弃掉 向5个离心管中分别加人适量四种硝基吠喃代谢物混合标准溶液(4.18),使 四种硝基吠喃代谢物最终测定浓度分别为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.0ng/mL、 10.0r ng/ml. 再向每个离心管中加人适量混合内标标准溶液(4.20).使四种硝基峡暗代谢物内标物最 终测定浓度均为2.0ng/mL 7.1.2水解和衍生化 向上述每个离心管中加人10mL.0.2nmol/1盐酸溶液(4.11)均质1min用10mL.0.2nmol/1盐酸 溶液洗涤均质器刀头,二者合并后加人0.3ml衍生剂(4.13),用液体混匀器混匀,置于37C恒温振荡 水浴(5.6)中避光反应16h 7.1.3净化 上述衍生溶液放置至室温后,加人5mlL.0.1mol/L磷酸氢二钾溶液(4.10),用1mol/儿氢氧化钠 溶液(4.12)调节溶液pH约为7.4,4000r/min离心10min,上清液(若待测样品含脂肪较多,上清液加 5nml.正已烧,振荡2min,4000r/min离心10nmin吸取并弃掉正已熔)倒人下接OasisHLB固相萃取 柱(4.21)的贮液器(5.11)中,在固相萃取装置(5.4)上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB 柱,待样液全部通过固相萃取柱后用10mL水洗涤固相萃取柱,弃去全部流出液 用真空系泵(5.7)在 65kPa负压下抽干OasisHLB固相萃取柱15n min 用5ml乙酸乙酯(4.3)洗脱被测物于25ml棕色 离心管中,使用氮气吹干仪(5.5),在40C水浴中吹干,用样品定容溶液(4.14)溶解并定容至1.0mL 混匀后过0.2m滤膜(4.22)用液相色谱-串联质谱测定 7.2待测样品溶液的制备 称取待测样品2g(精确到0.01g),置于50mL棕色具塞离心管(5.9)中,加人10mL甲醇-水混合 溶液(2十1),均质1min,再用5ml甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头,二者合并4000r/min离心 5min，吸取上清液弃掉 向离心管中加人适量混合内标标准溶液,使四种硝基吠喃代谢物内标物最终 测定浓度均为2.0ng/ml 按7.1.2和7.1.3操作 阴性样品基质空白溶液的制备 称取阴性样品2g(精确到0.01g),置于50m棕色具塞离心管(5.9)中,加人10mL甲醇-水混合 溶液(2十1),均质1nmin.再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头.二者合并4000r/min离心 5min，吸取上清液弃掉 按7.1.2和7.1.3操作 测定 7.4.1液相色谱条件 色谱柱:Atlantis-Cs,3.54m,150mm×2.1mm(内径)或相当者; a b 柱温:35C;
GB/T20752一2006 进样量:40L c 流动相及流速见表1 表1液相色谱梯度洗脱条件 时间/minm 流速/ 0.3%乙酸水溶液/% 0.3%乙酸乙睛溶液/% /min L 80 0.00 200 20 50 3.00 200 50 50 8.00 200 50 8.01 200 80 20 80 20 6.00 200 7.4.2质谱条件 离子源:电喷雾离子源(ESI); aa b)扫描方式;正离子扫描 检测方式;多反应监测(MRM); 电喷雾电压(Is)5000V; 辅助气(AUX)流速;7L/min; 辅助气温度TEM):480C; 聚焦电压(FP):150V; g h 碰撞室出口电压(CXP);l1V; 去簇电压(DP);45V; 四种硝基吠喃代谢物和内标衍生物的定性离子对、定量离子对,采集时间及碰撞气能量质谱参 数见表2 表2四种硝基味喃代谢物和内标衍生物的质谱参数 衍生后的硝基吠喃代谢物 定性离子对 定量离子对 采集时间/s 碰撞气能量/v 及内标物名称 m/e) m/e) 5-吗味甲基-3-氨基-2-恶陛婉基酮的衍生 335/291 18 335/291 100 16 物(2-NPAM0Z 335/128 209/192 1 氨基曝的衍生物(2-NPSEM) 209/166 150 209/166 15 249/134 19 1-氨基-2-内酰脉的衍生物(2-NPAHD) 249/134 200 2 249/178 3-氨基-2-飕陛烧基酮的衍生物2-NP 236/134 19 100 236/134 17 236/192 AO 5-吗眯甲基-3-氨基-2-感陛恍基酮内标物 340/296 340/296 100 18 的衍生物(2-NPD;-AMOZ 氨基脉内标物的衍生物(2-NPCN- 212/168 212/168 100 15 SEM 1！氨基-2内肤脉内标物的衍生物(2NP 252/134 252/134 100 32 iC,-AHD 3-氨基-2-嗯陛炕基炯内标物的衍生物(2 240/134 240/134 100 22 NPD-A0Z
GB/T20752一2006 7.4.3液相色谱-串联质谱测定 77 .4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质和内标物的 保留时间之比,也就是相对保留时间,与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在士2.5% 之内;且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定 性离子的相对丰度进行比较,若偏差不超过表3规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 >50 >20一50 -l020 1o 相对离子丰度 允许的最大偏差 士20 土25 士30 士5o 7.4.3.2定量测定 内标法定量;用仪器软件中的内标定量程序 外标法定量;在仪器最佳工作条件下,四种硝基吠喃代谢物的混合基质标准校准溶液进样测定,以 混合基质标准校准溶液浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对待测 样品进行定量,样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内 四种硝基吠喃代谢物和内 标物衍生物的标准物质多反应监测(MRM)色谐图参见图A.1 四种硝基吠喃代谢物的添加浓度及其 平均回收率的试验数据参见表B.1 平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.6回收率试验 吸取适量混合标准工作溶液和内标标准工作溶液,分别按7.1.2和7.1.3衍生、浓缩,得到相应浓 度的混合标准衍生溶液和内标标准衍生溶液 用基质空白溶液(7.3)稀释成所需浓度的标准校准溶液 阴性样品中添加标准溶液,按7.2操作,测定后计算样品添加的回收率 结果计算 结果按(1)式计算 1000 X=c×一× 000 式中 -试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(ug/kg) 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); -样品溶液最终定容体积,单位为毫升(mL) -样品溶液所代表最终试样的质量,单位为克(g) m 精密度 本部分的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r 四种硝基吠喃代谢物 的含量范围及重复性方程见表4 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R 四种硝基吠喃代谢物
GB/T20752一2006 的含量范围及再现性方程见表4 表4含量范围及重复性和再现性方程 含量范围 重复性限 再现性限R 硝基肤喃代谢物的衍生物名称 ug/kg) ;-吗咪甲基-3-氨基-2-哗烧基酬的 0.0966m十0.0048 lgR=1.1707gm一0.6600 0.22.0 行生物 氨基脉的衍生物 0.22.0 lgr=1.0512lgm一0.980l lgR=1.0002lgm一0,8848 -氨基-2-内酰脉的衔生物 lgr=1.0349lgm-0.9565 gR=1.0083lgm-0.8949 0.5一5.0 8-氮基-2-唱瞠烧基酮的衔生物 gR=0.8278gm一0.8431 0.22.0 lgr"=0,9919lgm一0.9195 注，"为两次测定结果的算术平均值
GB/T20752一2006 附 录 A 资料性附录 四种硝基肤喃代谢物及内标衍生物的多反应监测(MRM)色谱图 四种硝基吠喃代谢物及内标物衍生物的多反应监测(MRM)色谱图,见图A.1 1,26e4 5-吗淋甲基-3-氨基-2-唱眸炊基制的衍生物 - 151/min 1,26e4 1.00e4 氮基脉的衍生物 事0a.00e 0.00" 15/min 3666 1-氨基-2-内t脉的衍生物 3000 200 1000 151/min 2.0e4 3-氮基-2-啄眸烧基刚的们生物 1.5e4 1.0e4 5000,0 0.0" 151/min 2.5e4 5-味甲基-3-氨-2-思坐烧搞内标物的衍生物 151/min 2.4o4 氨基默内标物的行生物 I 00 13 15/nin 9358 8000 1-氮基-2-内俄骡内标物的钉生物 6000 4000 2000 13 4 15/min 3,0e4 3-氮基-2-恶眸婉基内标物的行生物 2.0e4 .0u4 151/min 图A.1四种硝基肤喃代谢物及内标物衍生物的多反应监测(MRM)色谱图
GB/T20752一2006 附录B 资料性附录) 回收率 四种硝基吠喃代谢物平均添加回收率(n=10),见表B.1 四种硝基肤喃代谢物平均添加回收率(n=10) 表B.1 不同样品中四种硝基吠喃代谢物的平均回收率/(% 四种硝基峡喃代谢物 添加浓度 衍生物名称 4g/kg 猪 肉 牛 肉 鸡 肉 猪肝 河豚鱼 虾 扇 贝 0.2 88.2 90.1 91.2 85.4 89,5 82.3 84. 5 0.5 90.3 88.2 92.3 83.2 87.9 84.1 87.8 2NPAMOZ 1.0 85.6 85.5 88.6 82.4 90,l 85,2 88.2 85.6 2.0 87.8 90.6 85.9 84.l 83,l1 85.6 89,7 88.9 81.2 82. 89.1 88.9 82，4 0.5 87.6 87 5 88.6 86.6 87.8 86.6 84. 5 2NPSEM 86.8 86.8 86.9 82.1 85.6 85.8 86.2 l.0 2.0 85.4 85.4 85.8 83.5 87.2 82.6 82. 88.9 88.2 0.5 84.2 83.2 82.3 82.1 82." 1.0 87.8 85.9 89.6 81.6 85." 83.2 82.8 2NPAHD 2.0 88.1 87.1 87.5 84.6 84.6 84.2 83. 6 82.6 5.0 83.6 86.8 84，7 82.8 81.6 84.2 91.2 2 92.1 88.2 88.2 0.2 90. 88.2 90.2 90.5 90.3 91.0 87.3 85.3 87.9 89.1 0.5 2NPp.Ao2 88.6 88.9 89.6 85.6 91.2 86,2 85.4 l.0 2.0 86.2 85.6 88.2 84.8 88.6 85.4 83.2