国家标准 GB/T36873一2018 原种鸡群禽白血病净化检测规程 Codeofpractieefrdeteectonofavianleuknsisinfeetioninchickepedigree breederflock 2018-09-17发布 2019-04-01实施国家市场监督管理总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/36873一2018 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由农业农村部提出本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口本标准起草单位:山东农业大学、动物卫生与流行病学中心,安徽科技学院、扬州大学、华南农业大学本标准主要起草人;赵鹏、崔治中,李卫华,张训海、秦爱建、叶建强、曹伟胜
GB/36873一2018 原种鸡群禽白血病净化检测规程范围本标准规定了原种鸡群禽白血病净化检测规程本标准适用于原种鸡群实施针对禽白血病的净化规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T26436一2010禽白血病诊断技术 NY/T6802003禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3. 原种鸡群pedigreebreederfock 进行选育种的原始禽群 3.2 动物疫病净化anialdiseaseeradication 在一个养殖场或指定区域内,通过持续检测和监测发现患病动物或带毒动物,并通过淘汰带毒动物以实现根除某种动物疫病的过程检测规程 4.1出壳雏鸡胎粪的检测与淘汰 4.1.1样品的收集在灭菌的1.5ml离心管中每管预先放人0.5ml灭菌的磷酸缓冲盐溶液(phosphatebufersaline. PBS,0.01mol/儿L,pH7.4)(PBS配制操作规范见附录A),或采用符合NY/T680一2003的商品化试剂盒专用稀释液,将离心管对准鸡肛门处轻轻按压雏鸡腹部将胎粪挤人1.5mL离心管中 4.1.2样品的处理与检测将装有胎粪的1.5mL离心管在涡旋震荡仪上充分震荡混匀,然后放于液氮中迅速冷冻,冷冻 2min后取出置于37C水浴锅中融化,然后将离心管在涡旋震荡仪上再次充分震荡混匀如此反复冻融两次后将离心管置于台式离心机中,12000片离心1nmin,离心后取上清,应按照NY/T6802003 或采用符合NY/T680一2003的商品化试剂盒检测胎粪中禽白血病病毒p27抗原
GB/T36873一2018 4.1.3检测后的处理同一只(羽)母鸡所产的雏鸡中,只要有一只雏鸡胎粪检测为禽白血病病毒p27抗原阳性则该纸袋中所有同胞雏鸡及其对应母鸡均视为禽白血病病毒阳性,阳性鸡不再列为育种选育个体,应淘汰做无害化处理阴性鸡立即运送至育雏舍中饲养出壳期间注意事项 4.1.4 出壳期间操作注意事项参见附录B 4.2育雏后期的检测与淘汰 4.2.1鸡群全血病毒分离在育雏结束前10d左右,对按照育种标准选定的雏鸡逐一无菌采集抗凝血,应按照GB/T26436 2010接种DF-1细胞进行病毒分离,培养7d9d后取细胞上清,应按照NY/T680-2003或采用符合 NY/T680-2003的商品化试剂盒检测细胞上清中禽白血病病毒p27抗原,若禽白血病病毒p27抗原为阳性则判定该雏鸡为禽白血病病毒阳性鸡(全血病毒分离操作规范见附录C) 4.2.2检测后的处理经病毒分离为阳性的雏鸡不再列为育种选育个体,应淘汰做无害化处理对检测为阴性的选留后备种鸡应维持小群饲养或单笼饲养育雏期间注意事项 4.2.3 育雏期间操作注意事项参见附录D. 4.3开产初期的检测与淘汰 4.3.1母鸡的检测每只(羽)母鸡逐一无菌采集抗凝血,应按照GB/T26436一2010接种DF-1细胞进行病毒分离,培养7d~9d后取细胞上清,应按照NY/T680-2003或采用符合NY/T680-2003的商品化试剂盒检测细胞上清中禽白血病病毒p27抗原,若禽白血病病毒p27抗原为阳性则判定该母鸡为禽白血病病毒阳性鸡(全血病毒分离操作规范见附录C) 4.3.2公鸡的检测每只羽)公鸡逐 -无菌采集抗豪血,应拨照cB/T28436一200接种DP1细胞进行精毒分离,培养7d~9d后取细胞上清,应按照NY/T6802003或采用符合NY/T680一2003的商品化试剂盒检测细胞上清中禽白血病病毒p27抗原,若禽白血病病毒p27抗原为阳性则判定该公鸡为禽白血病病毒阳性鸡(全血病毒分离操作规范见附录C) 同时对每只(羽)公鸡逐一采集新鲜精液接种DF-1细胞进行病毒分离(公鸡精液病毒分离操作规范见附录E),公鸡的血浆和精液任何一方检测结果为阳性即判定该公鸡为禽白血病病毒阳性鸡 4.3.3检测后的处理经病毒分离为禽白血病病毒阳性种鸡不再列为育种选育个体,应淘汰做无害化处理对检测为阴性的选留后备种鸡维持单笼饲养
GB/36873一2018 4.4留种前的检测与淘汰 4.4.1母鸡的检测每只(羽)母鸡逐一无菌采集抗凝血,应按照GB/T26436一2010接种DF-1细胞进行病毒分离,培养7d9d后取细胞上清,应按照NY/T680一2003或采用符合NY/T6802003的商品化试剂盒检测细胞上清中禽白血病病毒p27抗原,若禽白血病病毒p27抗原为阳性则判定该母鸡为禽白血病病毒阳性鸡全血病毒分离操作规范见附录C) 4.4.2公鸡的检测每只(羽)公鸡逐一无菌采集抗凝血,应按照GB/T26436一2010接种DF-1细胞进行病毒分离,培养7d~9d后取细胞上清,应按照NY/T680一2003或采用符合NY/T680-2003的商品化试剂盒检测细胞上清中禽白血病病毒p27抗原,若禽白血病病毒p27抗原为阳性则判定该公鸡为禽白血病病毒阳性鸡(全血病毒分离操作规范见附录C) 同时对每只(羽)公鸡逐一采集新鲜精液接种DF-1细胞进行病毒分离(公鸡精液病毒分离操作规范见附录E),公鸡的血浆和精液任何一方检测结果为阳性即判定该公鸡为禽白血病病毒阳性鸡 4.4.3检测后的处理经病毒分离为禽白血病病毒阳性种鸡不再列为育种选育个体,应淘汰做无害化处理对检测为阴性的选留后备种鸡维持单笼饲养 4.5种蛋的选留和孵化按照4.14.4所列检测规程淘汰阳性鸡后,每只阴性母鸡仅选用来源于1只阴性公鸡的精液进行人工授精母鸡所产种蛋均一一标号并与母鸡编号对应,将来自于同一只母鸡的种蛋置于带有母鸡编号的孵化纸袋或纸盒中,放人已消毒的孵化器中孵化(孵化期间操作注意事项参见附录F). 4.6不同世代的持续检测与净化按照4.14.5检测规程净化后孵出的雏鸡作为净化后第二世代鸡,继续按照4.1一4.5检测规程实施第二世代的检测和净化,后续世代按此检测规程继续循环进行净化周期启动与终止 5.1检测节点的选择可根据原种鸡群所处时期对照4.14.5任何一个时间节点启动净化程序,不同原种鸡场可根据其技术条件选择4.14.5的部分检测程序进行检测,但按照4.14.5所有检测程序进行全面检测可有效缩短净化周期 5.2净化效果评估首先随机选取500枚种蛋取蛋清,应按照NY/T680一2003或采用符合NY/T6802003的商品化试剂盒检测蛋清中禽白血病病毒p27抗原,若禽白血病病毒p27抗原全部为阴性则判定为达到禽白血病净化状态,若阳性率高于1%则判定为未达到净化状态,若阳性率介于01%则需要对原种鸡群单系随机选取50只(羽)鸡开展病毒分离进行复核检测,若病毒分离全部为阴性则判定为达到禽白血病净化状态,若病毒分离出现阳性则判定为未达到禽白血病净化状态
GB/T36873一2018 5.3实现净化后检测比例的调整按照5.2所列要求判定达到禽白血病净化状态的原种鸡群建议无需再按照4.14.5全部检测程序进行普遍性检测,转为按照不低于10%的比例进行抽样检测,如抽样检测结果不符合5.2所列要求,则按照4.14.5推荐的净化检测规程重新实施净化 6 净化过程中注意事项 6.1种禽场生物安全 6.1.1原种鸡群应有相对隔离的地理位置,要远离其他鸡群 6.1.2应执行全进全出制度,原种鸡群需要物品和人员与外界的交流程度越低越好 6.1.3原种鸡群工作人员应固定化,避免其他鸡群的饲养员进人正在实施净化的原种鸡群中工作运送物品的车辆进出时以及人员出人均应执行消毒制度 6.1.4 6.1.5原种鸡群应在鸡舍设立严密而有效的防鸟网或其他的防鸟措施,并定期检查防鸟网或其他防鸟措施的维护状况和应用效果 6.2弱毒疫苗的使用正在实施和已经实现禽白血病净化的原种鸡群应确保所有使用的弱毒疫苗无外源性禽白血病毒等外源病毒污染,原种鸡群饲养企业需购买检测合格的市售商品化弱毒疫苗,购买疫苗时向生物制品企业索取该批次产品的检测报告并保留疫苗样品备查
GB/36873一2018 录附 A 规范性附录磷酸缓冲盐溶液PBs,p7.4)配制操作规范 A.1在800mL蒸僧水中分别加人无水NaCl8g,无水KCI0.2g,无水KH,PO0.27g,无水 NaHPO1.42g,搅拌使其充分溶解 A.2用HCl调节溶液的pH值至7.4,加蒸馏水定容至1L,高压蒸汽灭菌后置于室温保存
GB/T36873一2018 附录 B 资料性附录) 出壳期间操作注意事项 B.1为避免交叉污染,对一只(羽)母鸡所产雏鸡采集完胎粪后,要进行彻底洗手消毒或更换一次性手套后方可采集下一只(羽)母鸡所产雏鸡的胎粪 B.2检测为阴性的雏鸡需在最短时间内运送至育雏舍中,同一母鸡所产雏鸡在运送过程中仍在同一运输箱内运输 B.3出壳后1日龄注射的鸡马立克氏病弱毒疫苗等应为经过检测的不含有外源病毒污染的合格商品化疫苗
GB/36873一2018 录附 C 规范性附录全血病毒分离操作规范 C.1DF-1细胞的培养 C.1.1DF-1细胞的生长液为含有10%胎牛血清的改良Eagle培养基(DMEM,pH7.2),维持液为含有1%胎牛血清的DMEM C.1.2为确保DF-1细胞保持良好生长状态,将DF-1细胞传代控制在50代以内 C.1.3应定期检测DF-1细胞的纯净性特别是其中是否含有禽白血病病毒污染,每次传代时以及接种样品前取细胞培养上清,应按照NY/T680-2003或采用符合NY/T680-2003的商品化试剂盒检测细胞上清中禽白血病病毒p27抗原 C.1.4经浓度为0.25%的胰酶消化后,将DF-1细胞接种至一次性24孔细胞培养板中,每培养板接种 DF-1细胞量约10"个,接种后将细胞培养板置于37C,5%CO的细胞培养箱中培养,待细胞贴壁并铺满细胞孔约80%90%时接种样品抗凝血的采集与接种 C.2.1 配置浓度为了mg/'mL的肝素纳游液拌以一次性速器过速除菌,作为抗凝剂备用 c.2.2将一次性注射器在超净工作台或生物安全柜内吸取抗凝剂,抗凝剂在全血中比例为20% 也可采用一次性抗凝采血管 .2.3采集抗凝血后在超净工作台或生物安全柜内将全血注人1.5ml灭菌离心管中,50o0K离心 33 min c.2.4取出24孔细胞培养板,每孔取80丝L血浆接种至DF-1细胞,每个细胞培养板中应保留一个孔不接种样品作为空白细胞对照 c.3细胞培养的维持与检测 c.3.1将细胞培养板放人37C,5%cO的细胞培养箱中培养,样品吸附2h后弃去所有上清并以灭菌的PBs(o.01nmol/L,pH7.4)洗涤细胞,然后每孔更换500AL细胞维持液,继续在37C,5%cO的细胞培养箱中培养 C.3.2每天观察DF-1细胞状态,待培养7d~9d后取细胞上清,应按照NY/T680一2003或采用符合 NY/T680-2003的商品化试剂盒检测细胞上清中禽白血病病毒p27抗原 C.4注意事项 C.4.1抗凝剂浓度和用量应按照要求比例添加,以免因凝集导致DF-1细胞脱落 C.4.2采集抗凝血时应注意无菌操作,以免导致DF-1细胞污染 C.4.3样品接种时DF-1细胞密度过大容易导致细胞过早老化脱落,造成培养时间不够 C.4.4在确保DF-1细胞不脱落的前提下延长培养时间有助于提高病毒分离率 C.4.5将DF-1细胞和上清同时冻融后再检测上清中禽白血病病毒p27抗原有助于提高病毒分离率
GB/T36873一2018 附录 D 资料性附录) 育雏期间操作注意事项 D.1将同一母鸡所产雏鸡置于同一笼中饲养,避免将不同母鸡所产雏鸡置于同一笼中 D.2不同笼之间以一次性纸板进行隔离以降低禽白血病水平传播概率,为便于清洗和消毒建议使用不锈钢板 D.3 -次性纸板或不锈钢板的高度应超过该鸡群育雏结束时鸡的高度,确保育雏期间不同母鸡所产雏鸡之间不会发生直接接触群体规模较小的原种鸡群可使用实验动物专用隔离器进行单家系育雏 D.5为降低在疫苗免疫和采血过程中由注射器针头带来的水平传播,建议使用一次性注射器以避免不同鸡之间出现交叉感染 D.6育雏期间为禽白血病病毒易感期,所有使用的弱毒疫苗应为经过检测的不含有外源病毒污染的合格商品化疫苗
GB/36873一2018 录附 E 规范性附录公鸡精液病毒分离操作规范 B.1DF-1细胞的培养同C.1操作 E.2精液的采集与接种 B.2.1在每个1.5mL灭菌离心管中加人含有青霉素和链霉素各500U/mL的灭菌PBs(0.01nmol/L pH7.4)溶液150l E.2.2以75%酒精棉对公鸡肛门进行清洗消毒,采集公鸡精液至已灭菌的采精杯中,以灭菌吸头吸取 50L精液至已装有稀释液的1.5ml.离心管中,将装有精液的1.5mL离心管置于冰袋上运送至实验室 E.2.3将装有精液的1.5mL离心管置于低温离心机中离心,于4C5000从离心3min,取80AL~ 100 上清接种至DF-1细胞 L E.3细胞培养的维持与检测 E.3.1将细胞培养板放人37C,5%CO的细胞培养箱中培养,样品吸附2h后弃去所有上清并以灭菌的PBs(0.01mol/L,pH7.4)洗涤细胞,然后每孔更换500L细胞维持液,继续在37C、5%cO 的细胞培养箱中培养 E.3.2每天观察DF-1细胞状态,待培养7d~9d后取细胞上清,应按照NY/T6802003或采用符合 NY/T6802003的商品化试剂盒检测细胞上清中禽白血病病毒p27抗原 E.4注意事项 E.4.1精液采集时间点建议为早上公鸡喂料前或空料2h后,以最大程度减少粪便的污染 E.4.2采集精液应用广口容器,让精液流至容器内,避免容器口与公鸡接触以减少污染 E.4.3采集精液时所用器皿应需灭菌并注意消毒,以最大程度减少对DF-1细胞的污染 E.4.4每采集一只公鸡的精液后应进行手部消毒方可采集下一只公鸡的精液 E.4.5精液应保持新鲜,如采集后无法马上接种DF-1细胞可冻存于一80C冰箱 E.4.6样品接种时DF-1细胞密度过大容易导致细胞过早老化脱落,造成培养时间不够 E.4.7在确保DF-1细胞不脱落的前提下延长培养时间有助于提高病毒分离率 E.4.8将DF-1细胞和上清同时冻融后再检测上清中禽白血病病毒p27抗原有助于提高病毒分离率
GB/T36873一2018 附录 F 资料性附录) 孵化期间操作注意事项 r.1待孵种蛋应做到专人专车运输,避免与其他种蛋发生交叉,种蛋进人孵化厅前应进行消毒 P.2对实施净化的原种鸡群应使用独立的孵化厅、,孵化机和出雏机,确保单品系人孵和单家系出雏 r.3孵化过程中所有设备和工具用前应彻底冲洗消毒 F.4为降低孵化期间的水平传播,将每只母鸡所产种蛋置于同一个出壳纸袋或纸盒中孵化纸袋或纸盒体积按照不同品系雏鸡个体大小自行设计,以每个纸袋或纸盒容纳7只一10只出壳雏鸡为佳;纸袋或纸盒上应设有一定数量通气孔，一般在12个左右为避免纸袋或纸盒底部光滑导致雏鸡瘫痪,应在纸袋或纸盒底部加一层防滑纸垫 F.5为防止由于通风不畅造成雏鸡窒息死亡,应加大通风 0

原种鸡群禽白血病净化检测规程GB/T36873-2018详解

原种鸡是指用于育种的母鸡和公鸡，其健康状况对于家禽产业发展至关重要。而群禽白血病则是一种常见的家禽传染病，对鸡类的生长、发育和繁殖都有明显的不良影响。为保证原种鸡的健康和质量，国家制定并实施了《原种鸡群禽白血病净化检测规程GB/T36873-2018》这一国家标准，该规程是对原种鸡养殖领域中的检测工作进行规范的。

规程适用范围

该规程适用于原种鸡群禽白血病净化检测工作，包括采样、样品处理、实验室检测等方面。

检测方法和标准

该规程详细介绍了原种鸡群禽白血病的检测方法和标准，其中包括血清学检测法、分子生物学检测法、免疫学检测法等多种检测方法。同时，该规程规定了不同检测方法的具体操作步骤和标准，以及对检测结果的判定标准。

检测流程

该规程对原种鸡群禽白血病净化检测的整个流程进行了详细规定，包括采样、样品处理、实验室检测和结果判定等环节。其中，采样需要根据具体情况选择不同的采样方式和位置；样品处理则是对采集到的样本进行初步处理，以便后续的检测操作；实验室检测则是对经过样品处理的样本进行检测，以获得准确的检测结果；结果判定则是对检测结果进行分析和判断，以确定样品是否符合净化标准。

净化标准

该规程对原种鸡群禽白血病净化的标准进行了详细规定，包括抗体阳性率、核酸检测阳性率等多个方面。同时，该规程还对净化后的鸡群进行了隔离和观察期的要求。

总的来说，《原种鸡群禽白血病净化检测规程GB/T36873-2018》是一份非常重要的国家标准，它规范了原种鸡养殖领域中的检测工作，有助于保证原种鸡健康和质量。在实际应用中，生产企业应当严格按照该规程的要求进行检测和净化工作，以确保原种鸡的健康和质量，提高养殖效益。