草菇菌种

草菇菌种

国家标准 GB/T2359g一2009 草菇 菌 种 Pureeultureofstrawmushroom 2009-04-23发布 2009-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T23599一2009 前 言 本标准的附录A,附录B附录C和附录D均为规范性附录 本标准由中华全国供销合作总社提出并归口 本标准起草单位;广东省食用菌行业协会、广东省微生物研究所、广东粤微食用菌技术有限公司农 业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心 本标准主要起草人:杨小兵、胡惠萍,吴清平,朱少琼,李森柱、黄龙花、黄晨阳、廖世煌、张一帆、 张金霞
GB/T23599一2009 草菇 菌 种 范围 本标准规定了草菇(Volwariell4olwcea)菌种的相关术语和定义、质量要求、试验方法、检验规则 及标签标志包装,运输、贮存的要求 本标准适用于草菇菌种的生产,流通和使用 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T191 包装储运图示标志(GB/T191一2008,Is0780;1997,MOD) GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法,培养基和试剂 GB/T12728一2006食用菌术语 NY/T5282002食用菌菌种生产技术规程 术语和定义 GB/T127282006确立的以及下列术语和定义适用于本标准 3.1 拮抗现象antagomism 具有不同遗传基因的菌落间产生不生长区带或形成不同形式线状边缘的现象 角变seector 因菌丝体局部变异或感染病毒而导致菌丝变细、生长缓慢、菌丝体表面特征成角状异常的现象 3.3 高温抑制线high-temperaturedline 食用菌菌种在生产过程中受高温的不良影响,培养物出现的圈状发黄、发暗或菌丝变稀弱的 现象 质量要求 4.1母种 4.1.1 容器规格 按NY/T5282002中4.7.1.1的规定执行 4.1.2感官要求 应符合表1的规定
GB/T23599一2009 表1母种感官要求 目 项 要 求 容器 完整,无损 棉塞或硅胶塞 干燥洁净,松紧适度,能满足透气和滤菌要求 培养基灌人量 试管总容积的四分之一至五分之 斜面长度 顶端距棉塞或硅胶塞40mm~50mm 接种块大小(接种量 3mm5mm)×(3mm5mm 菌丝生长量 长满斜面 淡白至黄白色、半透明、旺健、丰满、爬壁力强、气生菌丝旺盛 菌丝体特征 菌种表面允许有少量红褐色的厚垣袍子 菌种外观 菌丝体表面 舒展,无角必 菌丝分泌物 无 菌落边缘 整齐 杂菌菌落 无 培养基不干缩,颜色均匀,无暗斑,无色素 斜面背面外观 有草菇菌种特有的清香味,无酸,臭、霉等异味 气味 4.1.3微生物学要求 应符合表2的规定 表2母种微生物学要求 项 目 要 求 的粗壮菌丝， 粗壮、丰满,显微镜下观察,有直径>84m 菌丝生长状态 菌丝线形,分枝均匀,呈直角或近于直角 无 细菌和霉菌 4.1.4菌丝生长速度 在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基上,在黑暗,适温(32C士1C)条件下,菌丝长满斜面的时间为 3d5d 母种栽培性状 4.1.5 供种单位所供母种需经出菇试验确认农艺性状和商品性状等种性合格后,方可用于扩大繁殖或出 量性状在正常条件下,以采用附录B中提供的栽培培养基为例,生物学效率应不低于20% 售 4.1.6菌丝可溶性蛋白电泳图谱特征 电泳图谱在Ri=0.75(Rf为电泳条带的相对迁移率)处具染色很深的蛋白带 4.1.7IIs(内部转录间隔区)序列特征 供试菌株的ITS序列与草菇V23的ITS序列进行比对,相似性应达98%以上 4.2原种 4.2.1容器规格 使用650mL一750mL且耐126C高温的无色或近无色的玻璃菌种瓶,或850mL耐126C高温白 色半透明的塑料菌种瓶,或(13cem~15cem)×(26cm~28cm)耐126C高温的聚丙烯塑料袋,各类容器 都应使用棉塞或能满足滤菌和透气要求的无棉塑料盖 4.2.2感官要求 应符合表3的规定
GB/T23599一2009 表3原种感官要求 x 目 要 容器 完整，无损 棉塞或无棉塞塑料盖 干燥、洁净、松紧适度,能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶(袋)口距离 50mm士5mm 接种量(每支母种接原种数,接种物大小 4瓶(袋)~6瓶(袋),>(12mmX15mm) 菌丝生长量 长满容器 菌丝显淡白或灰白色,生长旺健、饱满,菌种表面允许有 菌丝体特征 少量红褐色的厚垣袍子 培养物表面菌丝体 无角变,无高温抑制级 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁,无干缩 菌种外观 培养物表面分泌物 无 杂菌菌落 无 无 拮抗现象 子实体原基 无 气味 有草菇菌种特有的清香味,无酸、臭、霉等异味 4.2.3微生物学要求 应符合表2的规定 4.2.4菌丝生长速度 在适宜培养基上,在适温(32C士1C)条件下,菌丝长满容器的时间为7d12d 4.3栽培种 4.3.1容器规格 按照4.2.1的规定执行 4.3.2感官要求 应符合表4的规定 表4栽培种感官要求 目 项 要 求 容器 完整,无损 棉塞或无棉塞塑料盖 干燥,洁净、松紧适度,满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶(袋)口的距离 50mm士5mm 接种量[每瓶(袋)原种接栽培种数] 30瓶(袋)50瓶袋 菌丝生长量 长满容器 菌丝显淡白或灰白色,生长旺健、饱满,菌种表面允许有 菌丝体特征 少量红褐色的厚垣抱子 生长齐整,色泽一致,无角变,无高温抑制线 不同部位菌丝体 菌种外观 培养基及菌丝体 紧贴瓶袋)壁、无干缩 培养物表面分泌物 无 杂菌菌落 无 拮抗现象 子实体原基 无 气味 有草菇菌种特有的清香味,无酸,臭,霉等异味
GB/T23599一2009 4.3.3微生物学要求 应符合表2的规定 4.3.4菌丝生长速度 在适宜培养基上,在黑暗,适温(32C士1C)条件下,菌丝长满容器的时间为7d~12d 试验方法 感官检验 按表5逐项进行 表5感官要求检验方法 检验项目 检验方法 检验项目 检验方法 母种,原种 肉眼观察,测量 容器 肉眼观察 接种量 栽培种 检查生产记录 培养基上表面距瓶袋 硅胶塞,无棉塑料盖 测量 肉眼观察 口的距离 菌种外观各项 母种培养基灌人量 肉眼观察 肉眼观察 杂菌菌落除外) 肉眼观察,必要时用5倍 母种斜面长度 测量 杂菌菌落 放大镜观察 母种斜面背面外观 肉眼观察 气味 鼻嗅 5 微生物学检验 2.1表2中菌丝生长状态用放大倍数不低于10×40的光学显微镜对培养物的水封片进行观察,每 检样应观察不少于50个视野 .2. 细菌检验;取少量疑有细菌污染的培养物或菌块,按无菌操作接种于GB/T4789.282003中 5 .2 4.8规定的营养肉汤培养液中,36C38C振荡培养1d,观察培养液是否混浊 培养液混浊,为有细 菌污染;培养液澄清,为无细菌污染 5 霉菌检验;取少量疑有霉菌污染的培养物或菌块,按无菌操作接种于PDA培养基(见A.1.1 中,25 28C培养3d4d,出现白色以外色泽的菌落或非草菇菌丝形态菌落的,或有异味者为霉菌 污染物,必要时进行水封片镜检 菌丝生长速度 3 母种:按A.1.1或A.1.2的配方,32C士1C培养,计算长满试管所需天数 原种和栽培种;按A.2.1,A.2.2的配方任选其一,在32C士1C培养,计算长满所需天数 5 菌丝可溶性蛋白电泳方法 供试菌株先经3次继代培养,按附录C规定的PDY(马铃薯加富)液体培养基,32C黑暗浅层培养 10d 取上层菌丝体于冰浴中匀浆,再于13000r/min,离心10 min,上清液作为样品,采用聚丙酰胺凝 胶电泳,Tris-甘氨酸缓冲系统,pH8.9,凝胶浓度8% 使用Mini-PR0TEAN板式电泳槽,点样量 20L， 于冰浴中以10mA/块电泳2h 用考马斯亮蓝R250染色(0.1%考马斯亮蓝的7%乙酸溶液. 用含7%乙酸的20%甲醇裕液固定脱色 5.5IIS序列分析方法 按照附录D进行操作 母种农艺性状和商品性状 将被检母种制成原种、栽培种 按附录B规定的培养基配方,采用床架式栽培方法,制作15m培 养料,料厚度为8cm~10cm 接种后分三组(每组5m=)进行常规管理,根据表6所列项目,做好栽培
GB/T23599一2009 记录，统计检验结果 同时将该母种的出发菌株设为对照,做同样处理 对比二者的检验结果,以时间 计的检验项目中,被检母种的任何一项时间较对照菌株推迟3d以上(含3d)者,为不合格;产量显著低 于对照菌株者,为不合格;菇体外观形态与对照明显不同或畸形者,为不合格 表6母种栽培中农艺性状和商品形状检验记录 检验项目 检验结果 检验项目 检验结果 母种长满所需时间d 原种长满所需时间/d 菌丝长满培养基料面所需时间/d 总生物学效率/% 出第一潮菇所需时间/d 色泽、质地 第一潮菇生物学效率/% 菇形 菇体尺寸/mm 平均单产:/kg/m 5.7留样 各级菌种都要留样备查,留样的数量应每个批号菌种3支(瓶、袋),于15C20C下贮存,贮存期 母种为90d,原种为15d,栽培种为15d 检验规则 6.1抽样 质检部门的抽样应具有代表性 母种按品种,培养条件、接种时间分批编号,原种,栽培种按菌种来 源,制种方法和接种时间分批编号 按批随机抽取被检样品 母种、原种、栽培种的抽样量分别为该批 菌种量的10%、5%、1% 但每批抽样数量不得少于10支(瓶、袋);超过100支(瓶、袋)的,可进行两级 抽样 判定规则 2 o 按质量要求进行 检验项目全部符合质量要求时,为合格菌种,其中任何一项不符合要求,均为不 合格菌种 技术指标全部或部分不符合要求,允许业者整改后申请复检一次,如仍不符合要求,则判此批产品 不合格 标签、标志,包装、运输、贮存 标签、标志 产品标签 每支(瓶、袋)菌种应贴有(印有)清晰注明以下内容的标签 产品名称(如,草菇母种); a b) 品种名称(如;粤草02). e)生产单位(××菌种厂); d 接种日期(如:20×× ×X ×X); e)执行标准 7.1.2包装标签 每箱(或其他包装单位)菌种应贴有清晰注明以下要素的包装标签 a)产品名称、品种名称; 厂名、厂址、联系电话 D) 出厂日期 c d)保质期、贮存日期、贮存条件; 数量; e
GB/T23599一2009 f 执行标准 7.1.3包装贮运图示 按GB/T191的规定,应注明以下图示标志 a) 小心轻放标志 防水、防潮、防冻标志; b c 防晒、防高温标志; d)防止倒置标志 防止重压标志 e 7.2包装 7.2.1母种外包装采用木盒或有足够强度的纸盒,内填棉花、碎纸、泡沫塑料等缓冲物 7.2.2原种,栽培种外包装可采用洁净、干燥的塑料箱、编织袋或有足够强度的纸箱 7.3运输 7.3.1不得与有毒物品混装、混运 7.3.2气温在10c~15C和35c以上时,运输时间不得超过2山气温在15c一35C时,运输时间 不得超过1周;气温在10C以下时,应保温15C35C运输 7.3.3运输中应有防震、防晒、防尘、防雨淋、防冻、防杂菌污染的措施 贮存 母种在使用或销售前,在15C一20C保藏不超过90d 使用前,在20C一35C存放不超过 48h 原种和栽培种菌丝长满种袋(瓶)后,应置于清洁、干燥通风(空气相对湿度30%一70%),避光 7.4.2 的室内 在2832C贮存不超过5d,而在15C20C贮存不超过15d
GB/T23599一2009 附 录A 规范性附录 草菇母种,原种及栽培种常用培养基及其可选配方 A.1草菇母种常用培养基及其可选配方 A.1.1PDA培养基(1000mL 马铃薯去皮)200g,葡萄糖20g,琼脂20g,水1o00mL，pH7.5~8 A.1.2综合PDACPDA)培养基(1000mL) 马铃薯(去皮)200g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾2g,硫酸镁0.5g,琼脂20g,维生素B204g,水 1000ml，pH7.5一8 A.2草菇原种和栽培种常用培养基及其可选配方 A.2.1颗粒培养基 小麦、谷子,玉米或高粱等粮食颗粒99.5%,生石灰1%,含水量50%士2%,pH89. A.2.2棉籽壳培养基 棉籽壳80%,麦綦15%,生石灰5%,含水量60%士2%,pH89
GB/T23599一2009 B 附 录 规范性附录 草菇栽培常用培养基 粕籽棉培养基 粕籽棉95%,用5%生石灰水浸泡,沥去余水后使用
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GB/T23599一2009 附 录D 规范性附录 草菇菌种lIS序列分析法 D.1检测流程 待测样品-液体培养基增菌或待测菌株-菌丝DNA提取-PCR扩增一序列测定一比对分析-结 果判定 D.2材料与方法 D.2.1菌体培养 待测菌种增菌液体培养基CYM:蛋白陈2g,酵母膏2g,葡萄糖20.2g,硫酸镁(MgSO 7H.O) 0.5g,磷酸氢二钾(K,HPO1g,磷酸二氢钾(KHPO,)1g,纯水1000mL,pH7.5~8.0. 培养基分装至三角瓶后灭菌,冷却,接种,置于30C130r/min摇床培养3d,菌丝真空抽滤,无菌 水洗涤,低温干燥，-20C保存备用 D.2.2DNA提取和纯化 CTAB(cetyltrimethyl ammoniumbromide)法 a)2倍CTAB提取液在65C水浴锅中预热 b 取适量(O.lg一1g)菌丝体置于研钵中,用已灭菌的石英沙或液氮中研磨,同时加人少量聚乙 烯基毗咯烧酮(PVP)防氧化),将菌丝体充分研磨成粉末状 样品转人1.5ml离心管中,管内先加人600L2倍CTAB提取液在65C水浴锅中预热(用 少量提取液洗下研钵上残留的粉末样品,轻轻混匀,65水浴30min60min,其间每隔 10min轻轻摇动 冷却2mn后,加人等体积(约80,AL)的剧三策甲熔异皮脉(352A),充分摇动混匀 D 0000r/min,离心10min,取上清液移人另 -新管,重复步骤小)用三郭甲檐异皮醉( :1 再抽提离心一次 同时将2/3体积的异丙醇(或2倍体积的无水乙醇)预冷 两次抽提后的上清液转人新离心管,加人2/3体积的预冷异丙醉(或2倍体积的预冷无水乙 醇),再加人约1/10体积的乙酸钠(约30L50L),缓慢翻转混匀,沉淀DNA 13000r/min,离心15nmin,去上清液 70%酒精(400L.)漂洗沉淀2次(快速翻转振荡几分 钟),8000r/min,离心5min,去上清液,沉淀用纸巾吸取剩余乙醇,自然晾干或低温烘干(电 风筒吹干) 加1倍TE缓冲液(Tris10mmol/L十EDTAlmmol/L)溶解(约50AL) 一20C保存备用 h D.2.3PCR扩增 采用真菌核糖体基因间隔区通用引物对ITS1/1ITS4(ITSl:TcCGTAGGTGAAcCTGCGG ITS4:TcCTCcGCTTATTGATATGC)进行PCR扩增 反应体系;PCRmix25ALDNA模板5L,双蒸水12AL,通用引物(10uM)各4AL总体积 50Al 反应条件;94c预变性5min;94c1min- -55c1nmin一72c1nin.30个循环,72C10in 完成延伸 D.2.4序列测定 PCR扩增产物用1.0%琼脂糖电泳检测,在UVP凝胶成像系统下成像观察条带情况,并保存图像 PCR扩增产物回收纯化后,以PCR引物为测序引物,分别从正反链双向测序,该操作由生物公司完成 10
GB/T23599一2009 D.2.5序列分析 双向序列拼接后在Genank上进行比对(Blaes),若发现序列与Geanbank上已知序列方向相反,则 应对序列进行反向互补处理后再比对,对获得的同源序列进行分析,待测菌种与GenBank上某菌种序 列同源性达98%以上时,则待测菌与GenBank上该已知菌是同一个种 取草菇V23为草菇的对照标准种,其ITS序列登录号为FJ379273,其碱基序列如下:GGCTTTCT TCAAAGGCATCAGCAGGGCCCAGTCGCAGTCGGCCTCGTGGCGT CGGCTTCGAACCGTCCGG TGACACCCTTGACCTCAAATC AGGTAGGAcTACCcGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCGGGAGGAA,当待测菌的ITs序列 与草菇V23的ITs序列相似性>98%时,该待测菌种就是草菇(Voluriellaolacea)菌种