国家标准 GB/T37746一2019 草鱼呼肠孤病毒三重RI-PCR检测方法 TriplexRT-PCRassayfordeteetionofgrasscarpreoviruses 2019-06-04发布 2020-01-01实施国家市场监督管理总局发布币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/37746一2019 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由农业农村部提出本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口本标准起草单位:水产科学研究院珠江水产研究所本标准主要起草人:曾伟伟、王庆、吴淑勤、王英英、石存斌、宋新建、李莹莹、赵长臣
GB/T37746一2019 引言本文件的发布机构提请注意如下事实,声明符合本文件时,可能涉及到第7章“操作步骤”和附录y“引物”与《用于诊断草鱼呼肠孤病毒的三重PCR检测引物组,试剂盒及方法专利号:L.201210039379.8)等相关专利的使用本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案相关信息可以通过以下联系方式获得专利持有人:水产科学研究院珠江水产研究所地址:广州市荔湾区西塑兴渔路1号珠江水产研究所请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
GB/37746一2019 草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法范围本标准规定了3种不同基因型草鱼呼肠孤病毒的三重RT-PCR检测技术本标准适用于对草鱼的3种基因型呼肠孤病毒的核酸进行检测与分离株的鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范缩略语下列缩略语适用于本文件 DEPC;焦炭酸二乙酯(diethypyrocarbonate) dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxy-riboncleosidetriphosphate) EB:溴化乙锭(ethidiumbromide) GCRV;草鱼呼肠孤病毒(grasscarpreovirus) M-MLVRT:莫洛尼氏鼠白血病病毒逆转录酶(moloneymurineleukemiavirusreversetranm scriptase PBSs;磷酸盐缓冲液phosphatebufersolution) PCR;聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) RNA;核糖核酸(ribonucleicacid) RNaseinhibitor;RNA酶抑制剂 RT-PCR:逆转录-聚合酶链式反应(reversetranseriptionpolymerasechainactiom) TuqDNApolymsrase:.TuqDNA聚合附三重RT-PCR:三重逆转录-聚合酶链式反应(triplex reversetranscriptasepolymerasechainreace tion 技术原理草鱼呼肠孤病毒(GCRV)现有I、I和川型3个基因型,根据同一基因型不同毒株之间共有的保守序列分别设计特异性引物,这些引物可以特异性扩增相对应基因型分离株的核酸,而不能扩增其他基因型分离株的核酸在同一聚合酶链式反应(PCR)反应体系里加人针对3个基因型的3对保守引物,便可同时扩增出3个大小有差异的核酸片段,可以通过琼脂糖凝胶电泳的电泳条带分子量大小来区分,从而达到特异性检测和鉴别不同基因型GCRV的目的
GB/T37746一2019 5 试剂和材料 5.1水;符合GB/T6682中一级水的规格,核酸抽提和RT-PCR须使用无RNA酶的去离子水 5.2TRRIzolRNA提取试剂或其他商品化的基因组RNA提取试剂盒 5.3氯仿 5.4异丙醇-20C预冷 5.5无水乙醉 5.675%乙醇:用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，-20笔预冷 5.7M-MLV逆转录酶(5U/L):一20C保存 5.8dNTP含CTP.dATP.dGIP.dTTP各10mmol/AL. 5.9RNA酶抑制剂(RNasin,40U/AL):一20C保存 5.10TaqDNA聚合酶(5U/L);一20C保存 5.11DNA分子量标准DL1000,100bp 5.121.5%琼脂糖凝胶;按附录A中A.1配制 5.1350×TAE缓冲液:按A.2配制 5.14澳化乙锭(EB,104g/L.);按A.3配制 5.15焦炭酸二乙醋(DEPC)处理的灭菌双蒸水;按A.4配制 5.16PBs(磷酸盐缓冲溶液);按A.5配制 5.17引物;逆转录引物按附录B中的B.1,引物浓度为25pmol/pL;PCR引物按B.2,引物浓度为 5pmol/L 5.18阳性对照:将3种基因型的GCRV分别接种草鱼性腺细胞(co)或草鱼吻端成纤维细胞(PsF) 将获得的病毒液等量混合作为阳性对照 5.19阴性对照以cO或PSF细胞液作为阴性对照 6 器材和设备 6.1PCR扩增仪 6.2高速台式冷冻离心机 6.3掌上离心机 6.4混匀器 6.5冰箱(2C一8C、一20C和一70C的三种) 6.6水浴锅 67 电泳仪 6.8电泳槽 6.9紫外观察灯或和)凝胶成像系统 6.10研钵、剪刀和子 6.11微量移液器(2.5L,10L,l00L,200L,1000L)和配套无RNA酶的吸头 6.120.2nmlPCR管,1.5ml 和0.5ml无NA酶的Eppendorl管
GB/37746一2019 操作步骤 7.1样品采集与处理 7.1.1样品采集样品采集按SC/T7103的规定进行用无菌毁子和剪刀采集待检鱼脾脏和肾脏组织,每种组织采 300 集的量为100mg mg,如脏器不足100mg则采集整个脏器,将采集的组织分别放人1.5m 无 RNA解的Bpendof管中,编号 7.1.2样品贮运样品采集后,放人密闭容器中,于保温箱中加冰或其他冷冻剂,密封,尽快送检 7.1.3样品处理将样品置于研磨器中,按质量体积比1:1加人灭菌PBS,然后加人液氮或石英砂进行充分研磨; C,3000r/min离心15min,取上清液转人无菌的1.5ml无RNA酶的Eppendorf管中,编号备用 7.2RNA提取 7.2.1取灭菌的1.5ml无RNA酶的Eppendorf管,编号 7.2.2用TRIzol试剂提取待检样品、阴性对照及阳性对照样品的RNA 7.2.3100AL.7.1.3中的上清液,900ALTRIol置人1.5ml无RNA酶的Eppendorf管,振荡5次至 l0次,静置5 min 7.2.4加人200L氧仿,振荡混匀,室温放置5min,4C12000r/min,离心15min 7.2.5吸取上层水相至一新的1.5mL无RNA酶的Eppendorf管中,加人等体积异丙醇(一20C预冷),混勾,室温放置5min,4c12000r/min,离心15min 7.2.6弃去上清,加人1ml75%乙醇(DEPC水配制),缓慢颠倒以漂洗沉淀及管壁,4C12000r/min,离心15min. 7.2.7倒去上清,置室温条件下干燥后,加适量(通常为20l30L)DEPC水溶解 7.2.8提取的RNA应尽快进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增若需长期保存,应放置一70C 冰箱 7.2.9也可以采用质量相当的商品化基因组RNA提取试剂盒进行待检样品、阴性和阳性对照样品 RNA的提取,按照试剂盒说明书进行操作 7.3Rr-CR扩增 7.3.1 一步法反应操作步骤 7.3.1.1反应体系混合液的配制在0.2mLPCR管或0.5mL或1.5mL无RNA酶的Eppendorf管(根据样品数量来选择配制混合液的离心管)依次加人表1所示的组分和用量全部加完后,混匀,掌上离心机瞬时离心或6000r/min 离心15
GB/T37746一2019 表1一步法反应中配制RT-CR扩增体系的组分和用量每管用量 "管总用量组分 Al Al -步法RT-PCR扩增缓冲液(10× 5.0 n×5.0 1.0 n×1.0 MNMLV逆转录酶(5U/Al) dNTPs(10mmol/L 2.0 n×2.0 0.5 酶抑制剂(40U/AL RNA 卫×0.5 TaqDNA聚合酗(5U/AL) 1.0 n×1.0 逆转录引物(25pmol/AL) 1.0 n×1.0 引物Po1-F(25pmol/L 0.5 n×0.5 引物P01-R(25pmol/L 0.5 n×0.5 0.3 引物pP02-F(25pmol/L n×0.3 引物P02-R(25pmol/L 0.3 n×0.3 0.4 n×0.4 引物p3F(25pml/l) 引物P03-R(25pmol/4L 0.4 n×0.4 DEPC水 32.1 n×32.l 总体积 45,0 n×45.0 7.3.1.2反应体系混合液分装将7.3.1.1配制好的混合液按每个PCR管45.0aL分装至新的0.2mLPCR管中,在各设定的PCR 管中分别加人7.2中制备的RNA溶液5.0AL,盖紧管盖,掌上离心机瞬时离心或6000r/min离心 15s 7.3.1.3RT-PCR扩增 42C逆转录30min;95C预变性5min;94C35s,56C退火35s,72C延伸45s,35个循环; 72C延伸10min;4C保存 7.3.2两步法反应操作步骤 7.3.2.1 逆转录时取5.0l7.2中制备的RNA,加人浓度为25pmol/l.逆转录随机引物1.0l 70C水浴5min 7.3.2.2冰浴2min,继续加人表2所示的组分和用量
GB/37746一2019 表2两步法反应中配制逆转录体系的组分和用量每管用量管总用量 n 组分 p p 4.0 5×逆转录缓冲液 DTT(0,1mol/L) 2.0 n×2.0 dNTPs(10mnmol/L 1.0 n×1.0 M-MLV逆转录酶(5U/L 0.5 n×0.5 RNA酶抑制剂(40U/AL 0.5 nX0.5 DEPC水 6.0 6.0 总体积 l4.0 n×l4.0 7.3.2.337C反应30min合成cDNA,85C灭活5min后进行PCR或置一20C保存 7.3.2.4PCR扩增体系配制如表3所示,全部加完后,混匀,掌上离心机瞬时离心或6000r/min离心 15s 表3两步法反应中配制PCR扩增体系的组分和用量管总用量每管用量组分 l l 10×PCRbuffer 5.0 n×5.0 dNTPs(10mmol/L 1.0 n×1.0 引物P01-F(25pmol/AL 0.5 n×0.5 引物P01-R(25pmol/l) 0,5 n×0.5 引物P02-F(25pmol/4L 0,3 nX0.3 0.3 引物2-R(25 1×0.3 pmol/AL 引物P03-F(25 0.4 n×0.4 5pmol/AL 引物P03-R(25pmol/L 0.4 n×0.4 0.5 n×0.5 DNA聚合酶(5U/AL DEPC水 36.1 n×36. 总体积 45.0 n×45.0 7.3.2.5将7.3.2.4配制好的混合液按每管45.0ML分装至新的PCR管中,在各设定的PCR管中分别加人7.3.2.3中制备的eDNA5.0AL,盖紧管盖,掌上离心机瞬时离心或6000r/min离心15s 7.3.2.6PCR扩增;95C预变性5min;94C变性35s,56C退火35s72C延伸45s,循环35次心 72C延伸10min,4 保存 7.4扩增产物的电泳检测制备1.5%的琼脂糖凝胶板(参见A.l),取5.0ALPCR扩增产物和1L商品化的上样缓冲液混合 min45 后,分别加样到凝胶孔中 110V恒压下电泳30; min,在紫外投射仪或凝胶成像系统上观察并拍照记录
GB/T37746一2019 8 结果判断 8.1实验结果成立条件 GCRV阳性对照的PCR产物,经电泳检测后分别在195bp296bp和501bp位置同时出现特异性条带,阴性对照PCR产物电泳检测后没有目的条带,则试验结果有效,否则试验结果无效 8.2结果判定 8.2.1阳性判定在试验结果成立的前提下,按以下结果进行判定: 若样品中PCR扩增产物电泳后仅在501bp的位置上出现特异性条带,取PCR扩增产物测 a 序,同参考序列进行比较(参见附录C中C.1),序列相似性在85%或以上,判定为GCRVI型检测阳性; b 若仅在195bp的位置上出现特异性条带,取PCR扩增产物测序,同参考序列进行比较(参见 C.2),序列相似性在85%或以上判定为GCRVI型检测阳性若仅在296bp的位置上出现特异性条带,取PCR扩增产物测序,同参考序列进行比较(参见 C.3),序列相似性在85%或以上判定为GCRV皿型检测阳性若在195bp、,296bp和501bp中的两个或三个位置上出现特异性条带,分别切取特异性条带 d 并回收和纯化目的片段后测序,同参考序列进行比较(参见附录cC),序列相似性都在85%或以上,则判定为GCRV3个基因型中的两个或三个基因型检测阳性 8.2.2阴性判定在试验结果成立的前提下,按以下结果进行判定若在195bp,296bp和501bp的位置上均未出现特异性条带,则判定为GCRVI、I、皿型检 a 测阴性 b若扩增出特异性条带但测序结果和已知GCRV分离株的参考序列同源性在85%以下(参见附录C),则判定为GCRVI、I、型检测阴性
GB/37746?2019 ? A 淶??) ? A.11.5%? ?? 1.5g 1TAE?? 100mL ???100mLTAE??(1),???60C?,5l ?,?,?3mm?5mm A.250TAE?? A.2.10.5mo/L?EDTA)?(pH8.0 ? 18.6g ?? 80ml pH8.0 100ml ?? A.2.2TAE??(50) ??(Tris) 242g 57.1m 100 0.5mol/L??(pH8.0) ml ?? 1000ml ?????á A.3??(EB)? 20mg ?? ?? 20ml A.4DEPC???DEPC? ?? 1000ml 500L ?(DEPC) ??,121C?15" min A.5PBs? 800mL ??
GB/T37746一2019 9 NaCI 8g KCI 0.2g NagHPO 1.44g 0.24 KH,PO 用HCl调节溶液的pH值至7.4,加灭菌双蒸水定容至1l,在121C高压下蒸气灭菌20min 保存于室温
GB/37746一2019 附录 B 规范性附录引物 B.1逆转录引物(随机引物 55 -NNNNNNNNN-3'(N=A/T/C/G) B.2CR引物引物信息见表B.1 表B.1PCR引物信息基因型引物名称引物序列(5'-3') 片段长度/bp 5'ATTTACCCCCACCTCTGACAT3 Po1-F GCRVI 501 5" AGGcTcTTcCAG;TTG;CAG;G;3 R P02-F 5'GCTGATGCTGcCAGAccTAAAc3 GCRV l 196 P02-R TAATTGCCTGCTGCGCTGACT3 P03-F GGCGGCATGAATATGTATCGACT3" GCRv 297 5'TATGTGATTACGCGGGTCAG3' P03-R
GB/T37746一2019 附录资料性附录) 扩增片段参考序列 C.1I型GCRV扩增的序列 ATTTAcCcCCAccTCTGACATGA AAACCTGG GGTTCTCAATcCTAccGGT cCATCGAC TCACTTGcCcATcGTTA AGACCTTTTCAAAAGC CCACTGCCGGTGATGC ACTTAGACACcGCcCATGAcCATGCTAACACCTGACAT TGGAAGAGCTT I型GCRV扩增的序列 GCTGATGCTGCAGACGGCTAAAcCACTTAGTGCGGAGATCAccGCCGCAGATATTCAA GCTATCACACCTCTTGTAGTAGGGACTGATAAGCTCAACACTTTGGTCACCACTGGTTTTG GCAATATTCGCAACATTACCGACTTC'TCAATGTCTGCAATTTGGGAACCAGAGACAGTCAG CGCAGCAGGCAATTA 皿型GCRV扩增的序列 GGCGGCATGAATATGTATCGACTTAATTGGAGAGACGCTTTACGCCGGAAGATCAGA TTGCCTACAAGCGGTA GATGACTACGCTCGTGACTGTGCAGCATTGCTTGATGACGTG" AGCGCGACAGACGGCGT TTAACCGAGCTAACCCTGGAGGTGAAACGATGCGGGTTAAGCCATTTGCGCAAGCCGAT'TA CCGTAACCCGTTCGAGTTCGTTCCAGCGATGATATCCCTGACCCGCGTAATCACATA 0

草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法GB/T37746-2019详解

草鱼是我国重要的经济鱼类之一，但由于草鱼呼肠孤病毒的存在，不仅会导致草鱼死亡率增加，还会使得草鱼的质量受到影响。为了保障草鱼养殖业的健康发展，对草鱼呼肠孤病毒的检测就显得非常必要。因此，针对草鱼呼肠孤病毒的三重RT-PCR检测方法也相应地得到了制定和完善。

什么是草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法GB/T37746-2019？

草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法GB/T37746-2019是由中国水产科学研究院制定的标准，旨在通过三个不同的引物和探针，对草鱼呼肠孤病毒进行高效可靠的检测。

草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测的原理

草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法主要是通过以下几个步骤实现的：

提取样本：从草鱼体内或排泄物中提取出RNA；
逆转录：将RNA转化为相应的DNA；
PCR扩增：使用三个不同的引物和探针，对草鱼呼肠孤病毒进行PCR扩增；
结果分析：通过检测PCR扩增产物，判断是否存在草鱼呼肠孤病毒。

草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法能够快速、准确地检测草鱼呼肠孤病毒，可用于草鱼养殖场的日常检测以及对草鱼产品的监管。