GB/T29578-2013
甘蔗白色条纹病菌的检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofXanthomonasalbilineans(Ashby)Dowson
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2013-12-06
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
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甘蔗白色条纹病菌的检疫鉴定方法
国家标准 GB/T29578一2013 甘蔗白色条纹病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentifieationofXanthomonasalbilineansAshby)Dowsonm 2013-07-19发布 2013-12-06实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T29578一2013 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标淮起草单位;天津出人境检验检疫局,重庆大学
本标淮主要起草人;刘鹏、刘跃庭、崔铁军、,王中康、廖芳、张裕君、冯清,黄国明
GB/T29578一2013 甘蔗白色条纹病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了甘蔗白色条纹病菌的检疫鉴定方法
本标准适用于甘蔗蔗苗、茎秆等植物材料中甘蔗白色条纹病的检疫和鉴定
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GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法,培养基和试剂 SN/T1193基因检验实验室技术要求 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 甘蔗白色条纹病菌基本信息 中文名:甘蔗白色条纹病菌 学名:Xanthomoasalbilineans(Ashby)Dowson
scalddisease
病害英文名;sugarceane leat 属细菌界Bacteria， ,变形细菌门Proteobaceteriay变形细菌纲Gammaprot teobacteria ,黄单胞菌目 xXanthomonodales,黄单胞菌科Xanthomonodaceae,黄单胞菌属Xanhomomas 主要靠感病株和机械传播;被感染的种蔗是该病传播的主要方式,削刀包括装载机械化切刀)也是 个重要的传播源
夹风雨、呐齿动物以及甲虫、蝗虫、叶蝉和甘蔗蜒虫等害虫也是甘蔗白色条纹病的 传播途径
甘蔗白色条纹病菌的其他基本信息参见附录A
方法原理 依据甘蔗白色条纹病菌在寄主植物上造成的病害症状特征,以及该病原菌的生物学特性、生理生化 特性、分子生物学特性和致病性特征等进行检测鉴定
仪器用具 电子天平(感量0.0001g),恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、,超净工作台,生物显微镜、 高速冷冻离心机(12000r/min)、掌上离心机、纯水仪、恒温水浴锅、B1oLOG细菌自动鉴定系统、细菌 微量生化鉴定管、低温冰箱,PCR仪,电泳仪、凝胶成像仪、真空冷冻干燥机、培养皿(直径90mm)、,可调 式微量进样器(10,AL.IAl.20AL100l.),研钵,离心管u.5ml),cR管(0.2AL) 一次性注 射器(2mL)等
GB/T29578一2013 试剂和培养基 试剂 酵母膏、蛋白陈,蔗糖、硫酸镁MgSO7H,O)、磷酸氢二钾(K.HPO)琼脂粉、氯化镁MgCl dNTPs(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)、TaqPolymerase,乙二胺四乙酸(EDTA)、三胫甲基氨基甲烧 Tris)、盐酸(HC)冰乙酸(C
H,O.)、溴化乙锭(CHN,Br),琼脂糖、DNAMarker等
除另有规定外,所有试剂均为分析纯,所有试验用水均为灭菌双蒸水
6.2培养基 YSP培养基、523培养基,配制方法见附录B
检疫鉴定方法及步骤 现场检疫 甘蔗种植园的病害调查或进出境甘蔗样品的现场检疫中,若发现甘蔗植物叶片出现与叶脉平行的 白色细长条纹,有的白色组织中有很小的红褐色斑点或很浅的红线,或出现红色坏死条纹,有的严重的 植株叶片呈现白色枯萎症状(详见附录A中描述),应取甘蔗基部茎秆(地上部分)2节一4节带回实验 室做进一步分离鉴定
在进出境检疫中,对于没有症状的甘蔗样品,同样取茎基部部分,取样方法和步 骤参照sN/T2122
7.2病原菌分离 将甘蔗茎秆表面清洗后,用75%酒精擦拭消毒
用灭菌的刀具横切茎秆,观察横断面是否有菌脓 渗出
若没有发现菌脓,则用灭菌手术刀切取茎秆内部组织小块若干,放人灭菌的研钵中将组织液研 出,吸取1mL组织液加人1.5m离心管中,8000r/min离心10min,弃去上清液后将沉淀用1mL 无菌水稀释,该稀释液1mL再进行系列浓度的稀释,稀释倍数分别为10倍,100倍,1000倍,l0000倍 100000倍(取5个PCR管,分别加人0.9mL无菌水,从稀释液开始,浓度由高到低依次加人0.1mL无菌 水)
将每个浓度的稀释液在YsP培养基平板(直径90mm)上进行涂布,20L/平板,每个浓度做3个 平板
若发现茎科断面有渗出的菌脓,可直接用接种环蘸取并在YsP培养基平板上划线分离
每份样品 做不少于3个平板即可
将涂布或划线分离的YSP培养基平板置于30恒温培养箱中进行培养
7.3培养筛选 经涂布或划线分离的YsSP培养基平板在30C条件下培养48h一72h后观察是否有直径达到1 mm 左右、黄色或浅黄色、光亮、平滑、圆整的可疑菌落产生
挑取可疑单阎落进行分离纯化之后再转接2次进行纯化. 对纯化的可疑菌落进行7.5一7.7步骤的检测
若未发现可疑菌落则判定该样品检验结果为未检出甘蔗白色条纹病菌
7.4革兰氏染色 检测方法和步骤参照GB/T4789.28.
GB/T29578一2013 7.5生化指标测定 应用细菌微量生化鉴定管对可疑菌株进行以下12项生化指标的检测:果糖,阿拉伯糖,半乳糖甘 露糖,山梨醇、木糖、木糖醇、纤维糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖、酒石酸盐
或应用BOLOG细菌自动鉴定系统进行鉴定 7.6分子生物学测定 分子生物学检测中安全措施方面的要求参照SN/T1193
分子生物学测定的具体试验方法和试剂配制见附录B
采用特异性引物xAF1/xAR1对可疑菌 株进行PCR检测,用甘蔗白色条纹病菌标准菌株作阳性对照,用黄单胞属非甘蔗白色条纹病菌的植物 病原细菌作阴性对照,用水作空白对照,进行PCR扩增,扩增产物进行电泳分析
在阳性对照扩增片段 大小为600bp的单带,且阴性对照和空白对照未有扩增条带的前提下,可疑菌株扩增结果与阳性对照 -致,可判定分子生物学检测结果为阳性
7.7致病性测定 用甘蔗感病品种(新台糖16号,粤糖65等)植株进行致病性测定,接种方法采用注射接种方法,试 验设置阴性(无菌生理盐水接种)和阳性对照
温度为白天32C,晚间26C,光照12h,相对湿度 为70%
应用温室中培养的1月龄蔗苗,取在523培养基上培养24h的菌株,用无菌生理盐水配制细菌悬 浮液(10'CFU/nmL),用注射器将菌悬液注人蔗苗茎秆基部约0.5mL
接种5d一7d后观察症状,顶 端叶片是否有白色条纹或叶片的白化枯萎症状是否出现
结果判定 分离纯化得到的细菌菌株同时符合以下五个方面的检测结果,则可以判定检出甘蔗白色条纹病菌
a)在YSP培养基上的菌落特征与7.3中描述相符
b) 革兰氏染色结果为阴性杆菌
c 生化指标测定中,果糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、山梨醉、木糖检测结果为阳性
木糖醇、纤 维糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖、酒石酸盐检测结果为阴性
或经BIOLOG细菌自动鉴定系统 检测判定为甘蔗白色条纹病菌
d)分子生物学检测结果为阳性 致病性检测表现典型症状
样品保存 检出甘蔗白色条纹病菌的样品至少保存6个月,以备复检、谈判和仲裁;保存期满后,需经灭菌后方 可处理
10 菌种保存 分离并最终鉴定为甘蔗白色条纹病菌的菌株应转接到523试管斜面上,经登记和经手人签字后置 于4C低温冰箱中保存,30d60d转接一次,以防止病菌死亡,以备复核,谈判和仲裁
必要时将菌株 用真空冷冻干燥机冻干后长期保存
GB/T29578一2013 附 录A 资料性附录 甘蔗白色条纹病菌的其他信息 A.1分布 贝宁,布基纳法索,喀麦隆,加纳、肯尼亚、象牙海岸、马达加斯加,马拉维、毛里求斯、摩洛哥,莫桑比 克,多米尼加、尼日利亚、留尼汪、南非斯威尔兰、多宁,坦桑尼亚、刚果、津巴布韦,扎伊尔,缅旬、柬埔 寨,印度、印度尼西亚、日本,巴基斯坦,菲律宾,伊拉克、斯里兰卡、泰国、越南,澳大利亚、斐济,夏威夷、 墨西哥,美国,巴巴多斯、古巴,格林纳达、瓜德罗普,危地马拉、牙买加,马提尼克、巴拿马,波多黎各、圣 基茨,圣卢西亚、圣文森特、特立尼达和多巴哥、阿根廷、巴西、乌拉洼、主亚那、苏里南、巴拉主、委内瑞 拉、台湾、江西、广东,福建)
A.2寄主范围 r"um)、玉米(Zemays)、象草(Penniselumpurpureum)等
甘蔗(Sacchaeruo/fiecinar A.3危害 甘蔗白色条纹病也称甘蔗叶灼病,属系统性病害,由于蔗茎维管束被病菌粘液淤塞,影响水分运输， 致使甘蔗叶片的条纹坏死,在干旱季节会发生整株的突然枯萎死亡
该病害常为潜伏侵染,细菌获得机 会活跃时,才呈现外表病征,有慢性型和急性型,潜伏期不表现症状
急性型症状;典型特征是茎杆突然萎缩枯死,而不表现其他的任何症状
有时从茎杆基部或节间侧 生叶片具有典型的细长条斑的边鞘
慢性型症状;病初叶片出现1mm一2mm宽的与叶脉平行的白色细长条纹,其数目、长度不一,或 细小,或整片叶变白,变白程度亦不尽相同,有的白中略带浅黄,有些在白色组织中有很小的红褐色斑点 或很浅的红线,后期部分条纹变成红色坏死
条纹常常沿中脉背面延伸或扩展至叶鞘周围呈现紫色色 调,蔗株生长点受抑制,易抽侧芽
此外,慢性期的症状还包括尖端焦枯内卷成直立的枯鞘,叶缘部分或 全部坏死,并丛生出典型叶片症状的再生蔗苗
白条病诱发的褪绿症状和白化苗容易混淆影响诊断
然而白条病往往部分变色,存在红色坏死点,症状交界处不规则、波纹状,部分褪绿区域常常位于叶片中 段
白化症常常在栽植3月6月后叶片呈现白化
A.4生物学特性 甘蔗自色条纹病(sugarceaneleafscealadisease)是甘蔗上重要的检疫性细菌病害,主要危害甘蔗的 维管束组织,属系统性病害,由于蔗茎维管束被病菌粘液淤塞,影响水分运输,致使甘蔗叶片的条纹坏 死,严重时可造成整株枯萎死亡
干旱,水浸和低温等环境因素能提高该病严重度
菌体杆状,(0.3~ 0.4)m×(0.81.4)" )pm;单生或成链,极生单鞭毛,革兰氏染色阴性,最适生长温度为25C,最高为 35C
在营养琼脂上不能生长;在2%蔗糖、1%蛋白陈琼脂或类似的培养基上生长缓慢,YSP琼脂上 3d出现菌落
菌落黄色或浅黄色,光亮,平滑,圆整;过氧化氢酶阳性,精氨酸水解酶阳性,VP试验阳 性,磷酸盐还原反应阴性;只能在氯化钠浓度低于0.5%的培养基中生长,生长需要谷氨酸和维生素B,
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GB/T29578一2013 B 附 录 规范性附录 培养基配制和CR检测方法 B.1培养基配制 B.1.1YSP培养基 酵母膏5g,蛋白陈10g,蔗糖20g,琼脂粉15g,蒸馏水1000ml
121笔湿热灭菌20min
B.1.2523培养基 蛋白陈8尽-酵母膏4g.硫酸镁(Mgso7Ho)0.3,蔗糖10g,磷酸氢二钾(K,HPo.)2g.琼脂 -7.1,121C湿热灭菌20min
粉18g,蒸溜水1000ml
调整pH值至7.0- B.2试剂配制 B.2.1TAE电泳缓冲液(50×储存液pH值约8.5) 242只Tris碱,57.1mL冰乙酸,37.5gNaEDTA2H,O,加水至1L B.2.2TIE缓冲液 10mmol/1TrisCl,pH8.0;1lmmol/L
EDTA,pH8.0.
B.3PCR反应模板制备 可直接用培养的菌株稀释成菌悬液(>10CFU/mL)作为PCR反应模板;也可按《精编分子生物学 实验指南》中的方法提取细菌基因组DNA,提取后可用TE缓冲液溶解，一20C保存
B.4定性PCR检测 B.4.1PCR检测引物序列 XAF1:5'-CCTGGTGATGACGTGGGTT-3’ XAR1:5'-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3 (扩增产物600bp) B.4.2CR反应体系(30L. 10×PCR缓冲液 3Al dNTP(2.5mmol/L1.2l 引物P1(10mmol/L1L 引物P2(10mmol/L)1AL 0.2AL Taq(5U/L 双蒸水 22.6L
GB/T29578一2013 DNA模板 1l B.4.3CR反应程序 94/3min;94/30s;58C/30s;72C/40s;38次循环;72C/5” 4C保存 min; B.4.4PCR扩增产物的检测 1%1.5%的琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像仪下进行分析并拍照,记录试验结果
甘蔗白色条纹病菌的检疫鉴定方法GB/T29578-2013
甘蔗是世界主要的经济作物之一，但其生产过程中常常受到各种病害的侵袭，其中白色条纹病菌是极具危害性的一种病原体。为了保障我国甘蔗生产和出口贸易安全，GB/T29578-2013《植物病理学 检疫鉴定 甘蔗白色条纹病菌检疫鉴定方法》应运而生。
该标准适用于对甘蔗及其组织、土壤等样品中的白色条纹病菌进行检疫鉴定。下面将对该标准的主要内容进行介绍。
一、样品采集与处理
样品应从受害部位采集，包括叶片、茎、花序等。如果样品来自土壤，应在甘蔗根系周围采集土样。采样前应先浇透水，并选择没有感染的完整植株进行取样。
对于不同类型的样品，处理方法也有所不同。茎、叶片等植物组织样品需要进行表面消毒处理，而土壤样品则需要筛选、过筛、沉淀等步骤。
二、检疫鉴定方法
白色条纹病菌的检疫鉴定主要包括形态学特征观察和分子生物学鉴定两个方面。
1. 形态学特征观察
白色条纹病菌在显微镜下呈现出典型的形态学特征，如菌丝的颜色、大小、菌落的形态等。通过对这些特征的观察和比对，可以初步判断样品中是否存在白色条纹病菌。
2. 分子生物学鉴定
分子生物学技术已经成为植物检疫鉴定的重要手段之一。GB/T29578-2013标准规定了PCR扩增和序列分析等鉴定方法的具体步骤和条件。
三、结论
GB/T29578-2013《植物病理学 检疫鉴定 甘蔗白色条纹病菌检疫鉴定方法》提供了一套操作规范和技术要求，为我国甘蔗白色条纹病菌检疫工作的开展提供了有力的支撑。在实际应用中，需要根据样品类型和鉴定目的选择合适的检疫鉴定方法，并按照标准规范进行操作，以确保检测结果的准确性和可靠性。
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