饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法

饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法

国家标准 GB/T20190一2006 饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应(PCR)法 Deteetionmofb0vine，sheepandgoat-derivedmaterialinfeeds一 chainreaction(PCR)method Qualitativepolymerase 2006-09-01实施 2006-05-17发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20190一2006 引 言 含牛羊源性成分的动物源性饲料的使用,一直被认为是疯牛病传播的主要途径,禁止疫区含牛羊源 性成分的动物源性饲料的生产,流通和使用,成为预防疯牛病感染、流行的主要手段之一 1996年欧盟 提出了动物源性饲料中牛羊源性成分的检测方法(EUR18096EN) 2002年我国发布了出人境检 验检疫行业标准SN/T1119一2002《进出口动物源性饲料中牛羊源性成分检测方法PCR法》,用于 检测动物源性饲料 我国没有针对配合饲料和浓缩饲料等饲料产品中牛羊源性成分的检测标准,EUR18096EN和 SN/T11192002方法适用于动物源性饲料,在DNA提取上不适用于以植物为主要基质的配合饲料 和浓缩饲料 本方法是在SN/T11192002,欧盟方法的基础上提出,在大量实验数据基础上建立起 来的
GB/T20190一2006 饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应(PCR)法 范围 本标准规定了PCR方法对饲料中牛羊源性成分定性检测 本标准适用于饲料中牛羊源性成分的定性检测,本方法的最低检出限为0.25% 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 原理 根据牛羊遗传物质的特异性,通过检索基因库或专利库,选择牛羊特异性的DNA序列,该序列必 须在同类动物(无论什么品种)中都具有高度保守性,而其他动物皆不含有 利用种属特异性的引物通 过PCR扩增这一特定的DNA序列,通过电泳分离PCR产物,以标准长度的PCR产物作对照,检测 PCR扩增出的这一特定的DNA片断,判断是否含有牛羊源性成分 此外,通过限制性内切酶酶切反 应,进一步判断结果 通过对PCR扩增的特定DNA片断进行测序,与标准序列进行比较,来确认检测 结果 试剂与材料 除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂,水应符合GB/T6682一级水要求 三羚甲基氨基甲烧盐腋(Ti=Hcl)溶液1malLpH值为8.0.在80ml去离子水中游解 121.1g三羚甲基氨基甲烧(Tris),冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分 装后高压灭菌 三系甲基氨基甲烧盐酸(TiHe)溶液.】mol/L.pH值为7.5;在0ml.去离子水中游解 12.11gTris.冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至7.5,加水定容至100mL.分装后高压灭菌 氧化钠溶液.5mol/L在80mL.水中溶解29.22g氧化销,加水定容至100mL. mmdlL称取1s6.1《二水乙二胶四乙酸二钠(EDrA 乙二胺四乙酸二钠盐EDTA)溶液，500 Nag2H,O),加人700ml水中,在磁力搅排器上剧烈搅拌,用10mol/儿氢氧化钠溶液调pH值至 8.0,用水定容到1L,分装后高压灭菌 4.5澳代十六烧基三甲胺(cTAB)提取缓冲液I;在800mL去离子水中加人46.75只氯化钠摇动容 器使溶质完全溶解,然后加人50mLTris-HCI溶液(4.1)和20mLEDTA溶液(4.4),然后定容至1L 分装后高压灭菌 4.6澳代十六烧基三甲胺(CTAB)提取缓冲液l:在800ml去离子水中加人46.75g氯化钠,20g澳 代十六婉基三甲胺(CTAB),摇动容器使溶质完全溶解,然后加人50mlTris-HCl溶液(4.1)和20mL EDTA溶液(4.4),用水定容至1L,分装后高压灭菌 4.7核糖核酸酶A(RNaseA)贮备液;将10mgRNaseA溶解于987L水中,加人10ALTris-HCl
GB/T20190一2006 溶液(4.2),加人3Al氯化钠溶液(4.3),于100C水浴中保温15min,冷却到室温后,分装成小份保存 于一20C 4.8Tris饱和苯酚和三氯甲炕混合液,V(Tris饱和苯酚)+V(三氯甲炕)=1十1 4.9三氧甲婉和异戊醇混合液,v(三氯甲烧)+V(异戊醉)=24十1 4.10异丙醇 乙酸钠溶液,3mol/L:;在80mL水中,加人40.81g三水合乙酸钠,溶解后用冰乙酸调节pH值 到5.2,用水定容到100ml.,分装后高压灭菌 4.12体积分数为75%的乙醇 4.13Tris-EDTATE)缓冲液,pH值为8.0;在800ml.水中,依次加人10mLTris-HCl溶液(4.1)和 2 mlEDTA溶液(4.4),用水定容至1L,分装后高压灭菌 44 14正己婉 4.15TaqDNA聚合酶(5U/L)及10×PCR反应缓冲液(含25 mmg ol/LMg*) 4.16牛源性成分检测用引物(对)序列为 5'-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3 5'-TAGGCTTGGGAATAGTACGA-3 4.17羊源性成分检测用引物(对序列为 5'-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3' 5'-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3 4.18引物溶液:用TE缓冲液分别将上述引物稀释到25mol/L 4.19各10mmol/I的四种脱氧核糖核苷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)混合溶液 4.2010mg/mlL澳化乙锭溶液 注澳化乙锭(EB)有致癌作用,使用时要戴一次性手套,使用后按安全规定处置 4.21DNA分子量标记(50bp300p) 4.22电泳缓冲液;称取54gTris,27.5只棚酸,20mLEDTA溶液(4.4),然后用水定容到1L,使用时 0倍稀释 4.23加样缓冲液;称取嗅酚蓝250mg,加水10mL,在室温下过夜溶解;再称取二甲晴蓝250mg,用 0mL.水溶解;称取蔗糖50g,用30m水溶解,合并三种溶液,用水定容至100mL,在4C中保存 4.24琼脂糖 4.25PCR产物回收纯化试剂盒;按使用说明操作 4.26限制性内切酶Sa3.AI及反应缓冲液 4.27凝胶回收纯化试剂盒;按使用说明操作 4.28石蜡油 429DNA测序试剂 4.30体积分数为95%的乙醇 4.31甲酰胺 仪器 5.1实验室常用仪器设备 5.2PCR扩增仪 5.3电泳仪 4 5. 凝胶成像仪或紫外透射仪 5.5DNA序列分析仪 6 5. 高压灭菌锅
GB/T20190一2006 操作步骤 6.1试样的预处理 50g固体样品经粉碎,保持其颗粒大小在0.125mm以下 6.2模板DNA的提取和纯化 6.2.1CTAB法提取模板DNA 称取100mg经预处理的试样,加300AL冰上预冷的CTAB提取缓冲液I(4.5) 加人500AL65C 90min 预热的CTAB提取缓冲液I(4.6),混匀，65C保温30min" n,其间不时轻缓颠倒混匀 待冷却 至室温后加人5LRNaseA贮备液(4.7),室温下放置30min 12000r/min离心10min,取上清液， 加人与上清液等体积Tris饱和苯酚十三氧甲烧(4.8),轻缓颠倒混匀溶液,12000r/min离心10 min， 取上清液,加人等体供三叙甲慌十异皮醉(.9) 将上 ,轻缓颠倒混匀溶液 12000r 离心10min /min 清液转移至干净的离心管中,依次加人等体积异丙醇(4.10)及1/10体积乙酸溶液(4.1l),轻缓颠倒 混匀 12000r/min离心10min,弃上清液,加人800L体积分数为75%的乙醇(4.12)洗涤沉淀 2000r/min离心5min,弃上清液 再加人100L体积分数为75%的乙醇洗涤沉淀.12000:/min离 心5min,弃上清液 除去残留的乙醉,待沉淀干燥后,DNA沉淀溶解于100ALTE缓冲液(4.13)中 待测或于一20C保存备用 油脂类饲料中模板DNA提取 取油脂倒料适量液态油取30mL,磷脂类和固态油脂取5因)放人250mL三角瓶中,加人25nl. 正己炕(4.14),于磁力搅拌器上不断振荡混合2h后,加人25mlcTAB提取缓冲液I(4.6),继续于磁 力搅拌器上振荡混合2h 将溶液转人100mL离心管中,于8000r/min离心10min,使有机相和水相 分离,取水相,加人与水相溶液等体积的异丙醇(4.10)及水相溶液1/10体积的乙酸钠溶液(4.l1),轻缓 颠倒混匀室温放置10min后,12000!/nin离心10min,弃上清液,待沉淀干燥后用200LTE缓冲 液(4.13)溶解沉淀,加人200lTris饱和苯酚十三氯甲婉(4.8),轻缓颠倒混匀溶液,12000r/min离 心10min,取上清液,加人与上清液等体积三氯甲熔十异戊醇(4.9),轻缓颠倒混匀.12000r/min离心 2nmin至分相 将上清液转移至干净的离心管中,加人与溶液等体积的异丙醇(4.10)及溶液1/10体积 的乙酸钠溶液(4.11),轻缓颠倒混匀 室温放置10min后,12000r/nmin离心10min,弃上清液后,依 次加人800L 体积分数为75%的乙醇和100体积分数为75%的乙醉(4 12)洗涤沉淀 12000r/min离心5min,弃除乙醇溶液 待沉淀干燥后,DNA沉淀溶解于100lTE缓冲液(4.13) 中,待测或于一20C保存备用 6.2.3模板DNA提取的其他方法 可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA 6.3试样的PCR反应 在200L,或500Al的CR反应管中依次加人10×PCR缓冲液5l、1l各10mmol/1的四种 脱氧核糖核酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)混合溶液、引物溶液(含正向和反向引物)各1l、模板 DNA25ng~50ng)10l、TaqDNA聚合酶1AL,加人灭菌水,使PCR反应体系达到50L 再加约 50L石蜡油(有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油) 每个试样2次重复 以4000r/min离心10、后,将PCR管插人PCR仪中 95C恒温1min3min;进行30次扩增反 应循环(95C恒温30一60s.56C恒温30一0s.72C恒温30=一0),然后72C恒温5min.取出 PCR反应管,对反应物进行电泳检测或在4C保存 在试样PCR反应的同时,应设置阴性对照阳性对照和空白对照 阴性对照是指不含牛或羊成分的饲料中提取的DNA作为PCR反应体系的DNA模板;阳性对照 是指含牛或羊成分的饲料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板;空白对照是指用无菌重蒸僧水或 不含目的DNA的试剂作为PCR反应体系的DNA模板 上述对照PCR反应体系中,除模板外其余组
GB/T20190一2006 分相同 6.4PCR产物的电泳检测 将适量的琼脂糖加人电泳缓冲液中,加热将其溶解,配制成质量分数为1.5%的琼脂糖溶液,然后 按每100mL琼脂糖溶液中加人5L澳化乙锭溶液的比例,加人澳化乙锭溶液,混匀,稍适冷却后,将 其倒人电泳板上,室温下凝固成凝胶后,放人电泳缓冲液中 在每个泳道中加人5L8L.的PCR产 物需和上样缓冲液混合,其中一个泳道中加人DNA分子量标记,接通电源,9V/em电压,电泳 20min一30min. 电泳结束后,将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪或紫外透射仪上成像 根据DNA分子量标记判断扩 增出的目的条带的大小,将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照 6.5PCR产物的酶切检测 PCR扩增产物电泳检测结果阳性,进行限制性内切酶酶切反应 ALPCR反应液按CR产物回收纯化试剂盒说明进行 将30 牛,绵羊,山羊PCR产物均用Saa3.AI进行酶切 具体操作为;将回收纯化的rCR产物放人酶切 管中,加人2AL的眼制性内切酶,再加人5A反应酶切缓冲液,加人灭菌水,使酶切反应体系达到 50L.在37C恒温水浴保温反应3h 将酶切反应液与上样缓冲液混合后加人预制好的含质量分数为 2.5%的琼脂糖凝胶的一个泳道中,进行电泳分析及凝胶成像 PCR扩增产物测序 必要时,对PCR产物酶切检测阳性结果进行PCR扩增产物测序 6.6.1CR扩增产物的纯化 将6opLPCR反应液与上样缓冲液混合后,加人预制好的含质量分数为0.8%的琼脂糖凝胶的泳 道中,在其中的一个泳道中加人DNA分子量标记,接通电源进行电泳 在凝胶成像仪或紫外透射仪下 将特异性扩增条带切削下来,以下步骤按凝胶回收纯化试剂盒说明进行 6.6.2测序扩增反应 反应体系(c0b)8LNA测序试剂,30g一00RR纯化产物,3.2pmal引物,水补足至 20aL;PCR扩增程序;96c10s,50C5s,60C4nmin,25个循环,扩增产物4C保存 6.6.3测序扩增产物的纯化 扩增管中加人16L水,64L体积分数为95%的乙醇,稍混匀,室温放置15min,12000!/min离 心20min,去上清,加人250L体积分数为75%的乙醇,短暂混匀,12000r/min离心10nmin,去上清. 室温干燥 6.6.4测序 纯化产物中加人170nL甲酰胺溶液,95C,5min,迅速转移至冰上,2min 分装样品测序仪的加 样槽中,自动测序 6.6.5测序产物拼接 用正向和反向引物分别进行测序扩增反应、纯化和测序,将两次测得序列进行拼接,得到最终PCR 产物测序结果 结果分析和表述 PCR扩增产物电泳结果 牛源性成分的PCR扩增产物为271bp;羊源性成分的PCR扩增产物,绵羊为295bp,山羊为 294bp 7.2限制性内切酶酶切产物电泳结果 PCR扩增产物Sau3A限制性内切酶酶切产物;牛源性成分为57bp,214bp;绵羊的为91bp、 204bp;山羊的为92p,202bp
GB/T20190一2006 7.3序列比较 PCR扩增产物测序结果与附录A牛羊特定的DNA序列进行比较 7.4结果表述 PCR扩增产物电泳检测结果阴性,未检出牛或羊源性成分 PCR扩增产物电泳检测结果阳性,限制性内切酶酶切产物片段大小正确,确认含有牛或羊源性成 分;酶切产物片段大小不正确,确认不含有牛或羊源性成分 若对酶切结果进行了测序确证,测序结果与附录A牛羊特定的DNA序列的符合程度在90%以上 含90%),则确证为含有牛或羊源性成分;结果符合程度在90%以下,则确证为不含有牛或羊源性 成分
GB/T20190一2006 附 录 A 规范性附录 牛羊特定的DNA序列 A.1牛源性成分的PCR扩增产物序列 GTAGGCTTGGGAATAG,TACGATAAGGGCTACGAGAGGGAGACCTAAAATTACAGGGG TAATAAAAGAGGTAAATAAATTTTcGTTCATTTTGTTTcTcAAGGGGTGTTTTGTTTTAA TATTTTTGTTGGTGTcAGTTCTGG.ATTGTGATAAAGGTTGTGTTTTGAAACTTTTAGTTG AAAGATGATAAAAAGGGTcAAGAATATTGATAAGATcArTGTCAGTcATGTTGAcG:TGT CTAGTTGCGGCATGTCAcCcAAGGAGAGTATATGGc A.2羊源性成分的CR扩增产物序列 A.2.1绵羊 ccCTGcTCATAAGGGAATAGcCATGcCTAGGTTTATTGATAGTTGTGTAGTTGGTGTA AATGAGTGGGGTAGGAGGCCTAGTAGGTTTGTAGATcCCAATAAATAAAATTAGGGACATT AGTATTAATAGCTCATGTCTGTcCTTTGGTGTTATGAATGCTCATTATTTGTTTTGATACT AATTGAAGTATTCACTGTTGGAGGGAGATGAGGCAGG:TTGTTGACTAGTcGGCTTGATGT GGGAAATAATAGGCTAGGGAATAAAACAATGAGGGTAACAAGGGGGAGGCCTAATA A.2.2山羊 CCCTGCTCATAAGGGAATAGCCCATGCCTAGATTTATTGATAGTTGTGTAGTTGGTGT AAATGAGTGGGGTAGAAGGcCTAATAGGTTTGTAGATcCAATAAATAGGATTAGGGACAT TAATATTAATGTTCATGTTTGTCCTTTGGTGTTATGAATACTTATTATTTGTTTTGATAT GAGTTGAAGTGCCCATTGTTGGAGAGAGACGAGGCGGTTGTTAATTAGTCGGTTTGATGA GGGAAATAGTAAGCTAGGAAATAAAATAATAAGGGTAACAAGGGGGAGGCCTAATA