转基因产品检测实验室技术要求

转基因产品检测实验室技术要求

国家标准 GB/T19495.2一2004 转基因产品检测实验室技术要求 Deteetionofgeneticallym0difiedorganismandderivedproduets一 Generalreguirementsforlaboratories 2004-04-13发布 2004-04-13实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19495.2一2004 目 次 前言 范围 规范性引用文件 术语、定义和缩略语 转基因产品检测的工作流程 测试样品的要求 转基因产品检验实验室的分区要求 实验室质量控制和质量保证 5 实验室清洁 有毒、有害及废弃物质的处理 10安全防护. 附录A(资料性附录) 防止RNase污染的措施 附录B(资料性附录)漠化乙锭溶液和含溴化乙锭琼脂糖凝胶块的净化处理 参考文献
GB/T19495.2一2004 前 言 GB/T19495(《转基因产品检测》为系列标准: GB/T19495.1一2004转基因产品检测通用要求和定义 2 GB/T19495. 2004转基因产品检测实验室技术要求; GB/T19495.3一2004转基因产品检测核酸提取纯化方法; GB/T19495.4一2004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法; GB/T19495.52004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法; GB/T19495.62004转基因产品检测基因芯片检测方法; GB/T19495.7一2004 转基因产品检测抽样和制样方法; GB/T19495.82004 转基因产品检测蛋白质检测方法 本部分的附录A、附录B为资料性附录 本部分由国家认证认可监督委员会提出并归口 本部分由国家质量监督检验检疫总局动植物检疫实验所和广州出人境检验检疫局 负责起草、上海出人境检验检疫局辽宁出人境检验检疫局,卫生部临 床检验中心浙江大学和广西大学参加起草 本部分主要起草人:朱水芳、翠文、陈红运、黄文胜、潘良文、曹际娟、赵文军、李金民、董海涛、 李有志 本部分系首次发布的国家标准
GB/T19495.2一2004 转基因产品检测实验室技术要求 范围 GBT19495的本部分规定了转基因产品检测实验室总体技术要求和检验质量控制的基本要求 本部分适用于以核酸扩增技术和免疫学方法检测转基因产品的实验室,也适用于基因工程等其他 相关领域的实验室 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T19495的本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文 件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本 部分 GB/T6682一1992分析实验室用水规格和试验方法(eqvIsO3696:1987) GB11930操作开放型放射性物质的辐射防护规定 GB/T15481一2000检测和校准实验室能力的通用要求 GB/T19495.1一2004转基因产品检测通用要求和定义 AsTME1342一1997用冷冻、冷冻干燥和低温养护法保存细菌、真菌,原生生物、病毒,遗传要素 以及动物和植物组织的保存 术语定义和缩略语 GB/T19495.1确立的以及下列术语和定义适用于GB/T19495的本部分 3.1术语和定义 3.1.1 关键试剂eritieal reagents 在使用前经已知样品测试过的试剂 3.1.2 阳性标准物质p0sitiverefereneematerials 由认可机构制备、有溯源性的含有不同浓度待测靶序列的物质 3.1.3 阴性标准物质negativerefereneematerials 由认可机构制备、有溯源性的不含有待测靶序列的物质 缩略语 DEPCDhethylpyrocarlbonate,二乙基焦碳酸盐 UNG;酶UracilN-glycosylase,尿喀DNA-糖基化酶 转基因产品检测的工作流程 转基因产品检测的工作流程为;实验室样品到样验收(确定是否具备检验的基本条件)-混样-获 取测试样品-测试样品的制备(待检状态)-核酸和(或)蛋白等目标物质的提取-PCR实验(包括扩增 和产物分析)和(或)蛋白质检测-结果判定-结果表述,出具检验报告
GB/T19495.2一2004 测试样品的要求 转基因产品检测所接收的待检样品应置于原始包装袋(或容器)中,不能接收从其他检测、检验等分 出来的样品,以避免样品间交叉污染 转基因产品检验实验室的分区要求 6.1一般要求 设施和环境要求 用于转基因产品检测实验室的设施和环境要求应符合GB/T15481一2000中的规定 用于核酸检验的转基因产品检测实验室,有条件的宜在所分隔的各工作区域设置缓冲间,缓冲间的 压力为负压(或上设抽风装置),与其相连的工作间为正压,工作间与缓冲间之间宜安装磁性连锁装置 受实验场所限制而无条件设置缓冲间的实验室,在对检测区域进行功能划分后,应根据本部分6.2中的 规定设置实验室的压力 非实验人员不应进人各实验工作区 不同功能的核酸检验工作区应是分隔独立的工作室,并有明显的标志,各区间不能直通 各区之间 如果是紧密相连,需安装物品传递舱 每个工作区域的顶部应安装紫外灯,紫外灯的波长为254nm,安装数量为每20m安装一支40w 的紫外灯,灯与地面的距离不宜超过2.0m士0.1m 6.1.2工作顺序 所有实验操作应在规定的区域进行,待检样品的流动应遵照转基因产品检测工作流程的顺序,严格 按单一方向进行 6.2实验室工作区域的设置及要求 6.2.1核酸检验区 试剂贮存和准备区 6.2.1. 主要功能;原装试剂和配制试剂的贮存,所有试剂的配制与分装 a bb 工作区域的压力要求;未设缓冲间的试剂贮存和准备区,工作区域为正压 注意事项:当试剂经质检合格后,应将其分装贮存备用.贮存试剂的分装体积根据通常在实验 c 室内一次测定所需的扩增反应数决定 用于扩增的试剂应冰冻贮存 6.2.1.2样品制备区 主要功能实验室样品的混样和测试样品的制备 a bb 工作区域的压力要求;未设缓冲间的样品制备区,工作区域为负压或减压,可安装排风系统 注意事项;此区应远离其他实验操作区;粉碎样品时的器皿应单独使用,所用的器具在使用前 应经过彻底清洗并高压消毒,防止交叉污染;称取的测试样品应加盖后再移至样品核酸制 备区 6.2.1.3核酸制备区 主要功能;核酸的提取纯化与贮存;核酸含量的测定;测试样品DNA的保存 a bb 工作区域的压力要求;未设缓冲间的核酸制备区,工作区域为负压或减压,可安装排风系统 注意事项已纯化的核酸应保存于一20C或一80C,避免反复冻融;阳性和阴性标准物质DNA ce 可调整至常用的使用浓度后分装并冷冻保存 6.2.1.4扩增区 主要功能;PCR扩增反应体系的配制和模板的加人,核酸扩增 a b)工作区域的压力要求;未设缓冲间的扩增区,工作区域为负压或减压,可安装排风系统 注意事项:严格限制无关人员出人并减少在本区内走动;加样应在超净工作台(生物安全柜)内 c 进行,超净工作台的气流方向宜选择垂流式;巢式PCR的第二次加样必须在此区进行
GB/T19495.2一2004 7.4.2样品管理 送检样品的包装应完好并有明确的标识;在对实验室样品进行混样、测试样品的制备和称量过程中 应避免交叉污染 7.4.3实验过程的质量控制 7.4.3. 质控种类 实验室环境对照 4.3. 1.2阴性质控对照 核酸提取空白对照;核酸提取过程中不加样品的空白管 a b)P(cR试剂对照,不含DNA/eDNA模板的PCR扩增反应液试剂 阴性目标DNA对照即为内源基因对照,是不含外源目标核酸序列片段的模板 可使用阴性 C 标准物质,并与测试样品等同处理进行核酸提取及PCR扩增 7.4.3.1.3阳性质控对照 弱阳性对照;使用已知的弱阳性样品作为阳性质控样品,与测试样品等同处理进行核酸提取及 a PCR扩增 b)阳性目标DNA对照;使用含有目标DNA/RNA序列片段的阳性标准物质和(或)质粒 7.4.3.1.4PCR抑制物对照 在PCR反应体系中加人已知量和已知可扩增的DNA进行CR反应,以检测PCR反应体系中是 否存在水溶性抑制物质 当PCR反应无扩增结果和定量PCR时宜设此对照 7.4.3.2质控的设置及要求 实验室质量控制的设置和要求见表1 表1转基因产品检测实验室检测质控的设置及要求 阳性质控 阴性质控 实验室 质量控制环节 PCR抑制物对照 核股酸提取CR扩增阴性目标 阳性目标阳性目标 阳性提 环境对照 空白对照试剂对照DNA对照取对照DNA对照序列对照 抽样 混样 核酸提取 核酸定量 PCR 扩增 PCR扩增 产物的检测 结果判定" 结果表述 推荐性 推荐性 当需要确 但当所有的PCR 强制性 推荐性 强制" 强制性强制性 强制性定检测低 要求 定期 检测结果均为阴性 限时则为 时则为强制性 强制性 箭头方向表示质控开始至终止的环节 ”表示在检测报告中应做描述 各种对照的PcR检测结果与测试结果判定的关系见GB/T19495.1-2004中9.2 每10个样品应至少设置1个核酸提取空白对照
GB/T19495.2一2004 7.4.4避免各类实验污染 7 .4.4.1避免扩增产物污染 在PCR扩增反应液中加人UDG酶,并以dUTP代替dTTP可防止以前PCR扩增产物所致的遗 留污染 7.4.4.2避免RNase污染 防止RNase污染的措施参见附录A 7.4.4.3避免操作过程污染 实时荧光PCR和总核酸杂交法可防止操作过程的污染,尤其是实时荧光PCR是转基因产品检测 实验室重要的防污染措施之一 7.4.5清洁 实验工作结束后,应按本部分第8章对实验室进行清洁和去污染 7.5污染后的处理 对常见的实验环境污染源可定期采用擦拭实验进行监测 在实验过程中出现实验材料散落和(或)PCR产物外溅时,应立即按照本标准附录A中的规定进行 清洁处理并作出记录 无论任何检验环节发生污染,应对已作的检验结果产生质疑,并停止继续进行检验工作,直至消除 污染源为止 7.6室间质量评价测试 凡对外开展转基因产品检测并出具检测报告的实验室,应定期参加国家有关法定部门组织的检验 项目的室间质量评价测试 实验室清洁 8.1清洁方向 实验室清洁应按转基因产品检测工作流程的方向、依次从试剂贮存和准备区至样品粉醉区,核酸制 备区、扩增区,最后到产物分析区进行 清洁用具 8. 2 不同实验区域的清洁用具应固定,不能交叉使用 工作结束后应立即对工作区域进行清洁 8.3清洁方式 8.3.1实验室空间 实验室空间应定期进行紫外照射 8.3.2实验台面和仪器设备的清洁 实验结束后,实验台面、超净工作台宜用3%双氧水或10%次叙酸钠溶液(含有效氧1g/L)擦拭清 洁;也可在擦拭后再用紫外光照射,照射距离应不超过90cm,照射时间宜过夜 注:10%次叙酸钠和3%双氧水应在使用前配制,配制好的溶液不宜长期存放 有毒、有害及废弃物质的处理 移液器吸头 使用过的移液器吸头应放人含有10%次氧酸钠溶液的容器内浸泡,浸泡时间不宜少于24h PCR产物 含有PCR产物的所有液体及废弃物应放人含有1mol/L盐酸(HHcD)的容器中浸泡.浸泡时间不宜 少于6h;采用PCRELISA方法检测时洗板机洗板所产生的废液应收集至1mol/儿盐酸(HCl)溶 液中
GB/T19495.2一2004 9.3琼脂糖凝胶及电泳液 对含有EB或经EB浸泡过的琼脂糖凝胶、电泳缓冲液的处理参见附录B 9.4阳性样品和质粒 阳性样品的处理应符合GB/T19495.1一2004的规定 阳性质粒宜放人1mol/L盐酸(HCI)溶液 中浸泡,浸泡时间不宜少于6h 0安全防护 10.1紫外线 在紫外线下工作应佩戴具有紫外线防护功能的护目镜和(或)防护面罩,并遮蔽暴露的皮肤 紫外 照射消毒后由于空气中臭氧富集,不宜立即开始工作,应在停止紫外照射30min后开始工作,有条件的 实验室,可安装无臭氧紫外灯 10.2澳化乙锭 在接触澳化乙锭时应戴一次性睛类手套,实验操作宜固定在一定的区间、使用相对固定的容器 10.3放射线 在做有放射性物质的实验操作时应遵照GB11930中的规定进行个人防护 10.4细菌培养物 细菌培养物及所接触的平皿应在121C、30min消毒后方可丢弃
GB/T19495.2一2004 附 录 A 资料性附录 防止RNase污染的措施 A.1 操作者 操作者在整个实验操作过程中应戴口罩和手套 A.2 玻璃器皿的处理 玻璃器皿常规洗净后,应用0.1%DEPC于37C浸泡2h,再用双蒸灭菌水漂洗2次3次,l21C、 30min n高压消毒后,250C烘烤4h以上或200C干烤过夜 溶液的处理 所有溶液应加DEPC至0.05%0.1%,室温过夜或室温下磁力搅拌20min,然后121C、30min 高压消毒、或70C加热1h、或60C过夜 注:由于DEPC在Tis溶液中极不稳定.因此.配制Tis溶液的水应预先用0.1%DEPC处理并高压消毒,如此配 制好的Tris溶液再高压消毒后方可使用 A.4实验操作 所有实验操作应在冰浴中进行以降低RNase的活性 A.5抑制内源性RNase的活性 在实验起始阶段使用RNase抑制剂
GB/T19495.2一2004 附录 资料性附录 澳化乙锭溶液和含澳化乙锭琼脂糖凝胶块的净化处理 澳化乙锭溶液的净化处理 B.1.1浓度大于0.5mg/ml的澳化乙键溶液的处理 B.1.1.1氧化法 a 加水稀释嗅化乙锭溶液,使浓度低于0.5mg/m b)加人1×体积的0.5mol/L高孟酸钾溶液,小心混匀,再加人1×体积的2.5mol/儿盐酸,小心 混匀，于室温放置数小时 加人1×体积的2.5mol/L氢氧化钠,小心混匀后溶液可直接丢弃 c B.1.1.2还原法 加水稀释澳化乙锭溶液,使浓度低于0.5mg/mL; a b加人0.2×体积的5%次磷酸和0.12×体积的0.5mol儿亚硝酸钠(pH>3.0),混匀,于室温 放置24h 加人过量的1nmol/儿的碳酸气钠,混匀后溶液可直接丢弃 c 注5%次磷酸和0.5mol/L.亚硝酸钠都应现用现配制 B.1.2浓度小于0.5mg/mL的澳化乙锭溶液(电泳缓冲液)的处理 每100mL.溶液中加人100mg活性炭 a b 于室温放置1h,不时摇动 用whatman号滤纸过滤溶液,滤液可直接丢弃 c d 滤纸和使用过的活性炭可按本部分第B.2章的方法处理 B.2含澳化乙锭琼脂糖凝胶块的净化处理 含嗅化乙锭的琼脂糖凝胶块及其他固态物质的净化处理可采用焚化处理方式,焚化的温度不应低 于262C
GB/T19495.2一2004 参 考 文献 [1]GA/T382一2002法庭科学DNA实验室规范 [[2]国家药品监督管理局《药品检验所实验室质量管理规范(试行))，2000 [3]卫生部《临床基因扩增(PCR)诊断实验室工作规范》 [4]ASTME548一1994用于评定实验室资格的一般性准则 [5]C.w.迪芬巴赫等(黄培堂等译)PCR技术实验指南 北京:科学出版社，1998 etical [6]CEN/Tc275/wC11N181Foodstufls-Nucleicacidbasedmethodsofanalysisforgenet lymodified andderivedproducts-Generalrequirementsanddefinitions )rganisms [7]ISO/DIS15189医学实验室 -质量和能力的特殊要求